全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2014, 49 (6): 653–662, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3724/SP.J.1259.2014.00653
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收稿日期: 2013-10-18; 接受日期: 2014-03-12
基金项目: 国家自然科学基金(No.30623012)
E-mail: wangf@mail.hzau.edu.cn
拟南芥RabD2b蛋白氨基酸突变对定位和功能的影响
王芳
华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室, 武汉 430070
摘要 Rab蛋白4个保守的鸟嘌呤核苷酸结合结构域G1、G3、G4和G5共同参与了与GTP的结合及水解过程。将拟南芥
(Arabidopsis thaliana)RabD2b(AtRabD2b)G4结构域的重要氨基酸位点天冬酰胺(asparagine, N)突变为异亮氨酸(iso-
leucine, I)(AtRabD2b[N121I]), 并研究了N121I突变对AtRabD2b亚细胞定位和功能的影响。结果表明 , N121I突变使
AtRabD2b由原来的高尔基体点状定位转变为高尔基体和细胞质弥散定位。AtRabD2b能够互补酿酒酵母(Saccharomyces
cerevisiae)同源蛋白Ypt1突变产生的功能缺陷, 而AtRabD2b[N121I]仅能部分互补Ypt1的功能。AtRabD2b[N121I]转基因植株表
现出矮化、丛生、不育和茎顶端坏死等多效性异常表型, 与AtRabD2b转基因植株出现的主茎异常抽出表型不同。上述结果
表明, N121I突变不仅引起了AtRabD2b亚细胞定位的改变, 而且影响了其正常功能。
关键词 AtRabD2b, N121I突变, 亚细胞定位, 功能
王芳 (2014). 拟南芥RabD2b蛋白氨基酸突变对定位和功能的影响. 植物学报 49, 653–662.
真核生物的细胞生长依赖于细胞内外的物质交
流, 内吞和分泌作用是细胞内和细胞外物质交换的重
要途径, 囊泡运输是完成这些途径的主要方式。Rab
蛋白是小G蛋白超家族蛋白的成员, 它们通过识别货
物蛋白(cargo protein)、募集马达蛋白(motor protein)
以及与泊定在细胞器膜上的停靠蛋白结合等, 促进囊
泡的形成、运输以及与细胞器膜的融合, 进而调节细
胞内不同细胞器之间的蛋白转运过程(Stenmark and
Olkkonen, 2001; Rutherford and Moore, 2002)。
Rab蛋白的作用机制在不同生物间非常保守。它
们在细胞质和细胞器膜上来回移动, 并在非活性的
GDP结合形式和活性的GTP结合形式之间进行循环,
完成分子开关功能。Rab蛋白结合和水解GTP的循环
反应受两类蛋白调节。鸟苷酸交换因子(guanine nu-
cleotide exchange factors, GEFs)促进Rab蛋白与
GTP的结合 , GTP酶激活蛋白 (GTPase-activating
proteins, GAPs)则刺激Rab内在的GTP水解酶活性,
促进Rab从GTP结合形式转变为GDP结合形式(Wool-
lard and Moore, 2008; Agarwal et al., 2009)。Rab
蛋白的4个保守鸟嘌呤核苷酸结合结构域(G1、G3、
G4和G5)均参与了与核苷酸的结合及水解过程(Hau-
bruck et al., 1990; Takai et al., 2001; Agarwal et al.,
2009)。这些保守结构域中重要氨基酸位点的突变会
影响Rab蛋白结合GTP或者GDP的状态, 产生组成
型抑制或者显性激活的突变蛋白, 从而影响Rab蛋白
的定位和功能。烟草(Nicotiana tabacum)Rab2蛋白
(NtRab2)的G4结构域处保守的氨基酸天冬酰胺(asp-
aragine, N)突变为异亮氨酸(isoleucine, I)后, 产生显
性抑制突变体(dominant negative mutant); 突变蛋
白由特异的高尔基体定位变为细胞质弥散定位, 且突
变蛋白抑制了花粉管中分泌蛋白由高尔基体向目的
位点的运输 , 从而使花粉管的极性生长受阻(Che-
ung et al., 2002)。
目前在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中发现了57
个Rab蛋白, 根据其结构和功能的同源性可划分为
RabA到RabH8个亚家族 (Rutherford and Moore,
2002)。拟南芥RabD(AtRabD)亚家族包括4个蛋白成
员, 它们与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的
Ypt1蛋白和小鼠(Mus musculus)的Rab1蛋白具有较
高的序列同源性。AtRabD亚家族进一步分为At-
RabD1(包括AtRabD1蛋白)和AtRabD2(包含3个成
员, 即AtRabD2a、AtRabD2b和AtRabD2c)2个亚类。
Pinheiro等(2009)的研究表明, AtRabD1和AtRabD2a
定位在细胞的高尔基体和反面高尔基体点状结构上,
·研究报告·
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它们分别通过不同的生化途径调节从内质网到高尔
基体的囊泡运输过程; AtRabD1和AtRabD2亚类间及
AtRabD2亚类内成员间均存在功能冗余 , atrabd1/
atrabd2b/atrabd2c三突变体出现茎顶端坏死、丛生和
不育等多效性表型。Wang等(2012)的研究表明, At-
RabD2b定位在细胞的高尔基体点状结构上, 能够互
补酵母Ypt1蛋白突变产生的功能缺陷, 也参与细胞
内从内质网到高尔基体的囊泡运输过程。此外, Peng
等(2011)研究发现atrabd2b/atrabd2c双突变体的角
果长度变短, 细胞学观察结果表明, 角果变短可能与
花粉管的发育缺陷有关, 他们推测AtRabD2b和At-
RabD2c可能还参与植物花粉管的生长过程。本研究
将AtRabD2b的G4结构域重要氨基酸位点N突变为I,
研究了突变蛋白AtRabD2b[N121I]的亚细胞定位及 功
能。
1 材料与方法
1.1 实验材料
将拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)哥伦比亚生态型
(Columbia)种子点播在含蛭石和腐殖土(1:1)的营养
土中, 置于温度为(20±2)°C, 光照条件为16小时光照/
8小时黑暗, 光照强度为150 µmol·m–2·s–1的培养箱
中萌发并生长。烟草(Nicotiana tabacum L.)的种植条
件同拟南芥。
大肠杆菌(Escherichia coli)菌株DH5α、DB3.1和
根癌农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens)菌株GV-
3101为本实验室保存。野生型酿酒酵母(Saccharo-
myces cerevisiae)菌株NSY125和ypt1温敏突变型酵
母菌株ASY01由中国热带农业科学院热带作物生物
技术研究所张家明教授(Zhang et al., 2006)馈赠。
含AtRabD2b全长CDS(coding DNA sequence)
序列的pT-D2b、pYX142-D2b和p104-D2b载体为本
实验室构建并保存。pGEM-T载体购自Promega。
Golgi标记载体GmMan1-CFP购自拟南芥生物研究中
心(Nelson et al., 2007)。亚细胞定位载体pEARLE-
YGATE104和BP反应载体pDONR221由加拿大农业
部南方植物保护和食品研究中心崔玉海研究员馈赠。
酵母菌转化载体pYX142由张家明教授馈赠。
引物由上海捷瑞公司合成。限制性内切酶、T4
DNA连接酶、Taq DNA聚合酶和dNTP等购自Fer-
mentas公司。DNA凝胶回收试剂盒购自上海捷瑞公
司。酵母转化培养基购自Clontech公司。BP和LR反
应试剂盒购自Invitrogen公司。
1.2 实验方法
1.2.1 蛋白质序列的比对
首先 , 通过NCBI网站 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)
查找并获得Rab1类小G蛋白的编码序列信息, 然后
用ClustalW软件进行氨基酸序列同源性比对。将比对
结果文件导入Genedoc软件后获得加工后的比对结
果。

1.2.2 载体的构建
pT-D2b[N121I]: 设计引物D2bF(5′-ATGAATCCTGAA-
TATGACTATC-3′)和N121IR(5′-GAAGTGAGATCG-
TTCTTGATCCCAACCAGTAGCTTG-3′)以及N121I
F(5′-CAAGCTACTGGTTGGGATCAAGAACGATCT
CACTTC-3′)和D2bR(5′-TCAAGAAGAACAACAGC-
CTG-3′), 其中引物N121IR和N121IF分别含有1个核
苷酸突变位点的互补位点(下划线所示)。用成对引物
D2bF和N121IR以及N121IF和D2bR分别扩增在突变
位点处重叠的AtRabD2b的前后两段序列。PCR反应
体系总体积为25 μL, 包含模板约50 ng, 10×PCR
Buffer 2.5 μL, 1.5 mmol·L–1MgCl2, 0.2 mmol·L–1
dNTPs, 0.5 μmol·L–1primer, 1.5 U Taq DNA Poly-
merase。反应程序为 : 94°C3分钟 ; 94°C30秒 ,
56°C30秒, 72°C1分钟, 30个循环; 72°C延伸7分钟。
反应产物于4°C保存。2种PCR产物经琼脂糖凝胶
DNA回收试剂盒纯化后, 分别取5 μL产物混合, 并以
此为模板进行第 2轮PCR扩增 , 获得突变基因
AtRabD2b[N121I]。按照Promega公司TA克隆技术的操
作程序, 将该基因克隆到pGEM-T载体上, 获得pT-
D2b[N121I]载体, 并送交上海生物工程公司进行序列测
定。
pYX142-D2b[N121I]: 以pT-D2b[N121I]质粒DNA为
模板, 用引物D2bEF(5′-CGAGAATTCATGAATCC-
TGAATATGACTATCTGT-3′, EcoRІ)和D2bXR(5′-
GAGCTCGAGTCAAGAAGAACAACAGCCTG-3′,
XhoІ)扩增AtRabD2b[N121I]的CDS序列。PCR反应体
系和反应程序同上。PCR产物纯化后用EcoRІ和XhoІ
进行双酶切, 然后与同样双酶切的pYX142线状载体
王芳: 拟南芥 RabD2b蛋白氨基酸突变对定位和功能的影响 655

连接, 转化DH5α。挑选阳性克隆, 用碱裂解法提取质
粒后进行EcoRІ和XhoІ双酶切鉴定, 并进一步测序验
证, 获得转化载体pYX142-D2b[N121I]。
p104-D2b[N121I]: 以pT-D2b[N121I]质粒DNA为模
板, 用引物attb1-D2bF和attb2-D2bR进行PCR扩增,
获得两端带有attb接头的AtRabD2b[N121I]全长序列。
将AtRabD2b[N121I]与入门载体pDONR221进行BP重组,
获得中间载体pDON-D2b[N121I]; 将pDON-D2b[N121I]与
pearleygate104再进行LR重组, 获得p104-D2b[N121I]
载体。BP和LR反应体系参照Invitrogen试剂盒使用说
明书。

1.2.3 根癌农杆菌介导的烟草瞬时表达和亚细胞定
位观察
用电转化法将p104-D2b[N121I]载体转入GV3101。挑取
转化子单菌落, 接种到含有3种抗生素(50 mg·L–1kan-
amycin、50 mg·L–1rifampicin和50 mg·L–1gentamy-
cin)的LB培养基上, 28°C振荡培养过夜。菌液浸染烟
草叶片方法参照Wang等(2012)的方案进行。在农杆
菌浸染烟草叶片后48–72小时之间, 剪取注射区域叶
片制备组织切片, 在激光共聚焦显微镜(Leica DMI-
RE2, Germany)下观察并拍照。黄色荧光蛋白(yellow
fluorescent protein, YFP)激发光波长设置为514 nm,
发射波长范围为505–530 nm; 青色荧光蛋白(cyan
fluorescent protein, CFP)的激发光波长为405 nm,
发射波长范围为450–470 nm。

1.2.4 酵母转化实验
酵母菌株ASY01的感受态制备及质粒转化参照酵母
操作手册(yeast protocols handbook, PT3024-1, Clon-
tech)进行。挑取单克隆酵母菌接种到SD-Leu(6.7
g·L–1YNB、20 g·L–1葡萄糖和不含Leu的氨基酸混合
物)液体培养基中, 振荡培养24小时后, 用接种棒蘸
取少量液体培养物在SD-Leu固体培养基上划线, 并
分别置于26°C和37°C培养箱中培养, 观察其生长情
况。设置NSY125为阳性对照, 转化了pYX142空载体
的ASY01为阴性对照。

1.2.5 拟南芥转基因植株的表型观察
采用沾花法转化拟南芥(Clough and Bent, 1998)。T0
转基因拟南芥种子消毒后播种在含50 mg·L–1basta
的MS培养基(Sigma, USA)上。对初步筛选获得的阳
性苗的根尖部位进行激光共聚焦显微观察, 根据YFP
的表达情况判断外源基因的表达。生长2周后, 将培
养皿上的阳性转基因后代和野生型对照植株移栽到
营养土中, 在相同条件下种植并观察植株的表型。
2 结果与讨论
2.1 Rab1亚家族蛋白的结构域分析
通过比对不同物种Rab1同源蛋白 (拟南芥RabD/
Rab1亚家族的4个成员、酿酒酵母的Ypt1和小鼠的
Rab1)的氨基酸序列, 发现它们都包含Rab蛋白的4
个与鸟嘌呤核苷酸结合和水解有关的结构域G1、G3、
G4和G5。G3结构域的氨基酸序列在3个物种的蛋白
中完全保守, G1、G4和G5结构域的氨基酸序列存在
一些差别, 但这些结构域的重要功能位点, 如G1结
构域(VGKS)的丝氨酸和G4结构域(KLLVGNK)的天
冬酰胺等都非常保守(图1)。
2.2 突变基因AtRabD2b[N121I]的扩增
突变基因AtRabD2b[N121I]是指基因编码的第121位氨
基酸序列由天冬酰胺(N)突变为异亮氨酸(I), 对应的
核苷酸序列由AAC突变为ATC, 因此只需将AtRab-
D2b编码序列第362位的A定点突变为T即可获得
AtRabD2b[N121I]。首先, 通过PCR扩增出长度分别为
380和265 bp, 并在A碱基处发生了突变的AtRabD2b
的前后两段重叠序列 ; 然后 , 将它们纯化回收 , 混
合的DNA作为第2轮PCR扩增的模板 , 扩增获得
AtRabD2b[N121I]的全长编码序列, 长度为609 bp(图
2A)。测序结果显示除第362位的A突变为T外, At-
RabD2b其余位点的核苷酸序列均未发生突变。将
AtRabD2b[N121I]克隆到pGEM-T上, 获得pT-D2b[N121I]
载体。
2.3 AtRabD2b[N121I]的亚细胞定位
以pT-D2b[N121I]为模板, 用引物扩增两端添加了attb
接头的AtRabD2b[N121I]的全长编码序列, 并通过BP
和LR重组反应将AtRabD2b[N121I]克隆到亚细胞定位
载体pearleygate104上, 获得AtRabD2b[N121I]与YFP
C端序列融合的亚细胞定位载体p104-D2b[N121I](图
2B)。
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图1 不同物种Rab1同源蛋白的保守结构域比较
右边的数字代表氨基酸的位置; 相同或者相似的氨基酸分别用黑色和灰色标识; 保守结构域G1、G3、G4和G5的序列用上划线标出

Figure 1 Conserved domains of Rab1 homologous proteins within different species
Numbers shown at the right of each sequence are the positions of amino acid residues; Identical and similar amino acid residues
are shaded with black and grey, respectively; Conserved regions involved in GTP binding or hydrolysis are overlined and labeled
as G1, G3, G4 and G5


Wang等(2012)前期的研究表明, AtRabD2b主要
定位在高尔基体点状结构上。本研究中, 我们用载体
p104-D2b[N121I]转化烟草表皮细胞瞬时表达, 并在转
化后48–72小时内观察AtRabD2b[N121I]的亚细胞定
位。图2C显示, YFP-AtRabD2b[N121I]表达的黄色荧光
一部分出现在细胞的点状结构上, 另一部分则弥散在
烟草叶片的细胞质中。为了验证这些点状结构是否为
细胞内的高尔基体细胞器, 进一步将高尔基体的标记
蛋白GmMan1-CFP与YFP-AtRabD2b[N121I]融合蛋白
在烟草表皮细胞中共表达, 发现大部分点状的黄色荧
光与标记蛋白表达的青色荧光重叠, 表明这些重叠的
点状结构为高尔基体; 但也有少部分黄色点状荧光未
与青色荧光重叠, 这部分可能为细胞内其它细胞器。
因此, 与野生型AtRabD2b的高尔基体定位相比(图
2C), AtRabD2b[N121I]的亚细胞定位发生了部分改变,
出现在弥散的细胞质中。
2.4 AtRabD2b[N121I]能够部分互补酵母ypt1突变
体的功能
酵母温敏突变型菌株ASY01的Ypt1蛋白的第136位
丙氨酸突变为天冬氨酸, 使其在26°C(非限制性温度)
条件下能够正常生长, 而在37°C(限制性温度)条件下
生长受到抑制。AtRabD2b能够互补Ypt1突变产生的
生长缺陷, 表明其与Ypt1是功能同源的蛋白(Wang
王芳: 拟南芥 RabD2b蛋白氨基酸突变对定位和功能的影响 657


图2 烟草表皮细胞中AtRabD2b[N121I]与AtRabD2b的亚细胞定
位比较
(A) AtRabD2b[N121I]的扩增(M: 1 kb DNA ladder; 1: AtRabD2b
全长编码序列; 2: AtRabD2b[N121I]全长编码序列); (B) p104-
D2b[N121I]载体示意图; (C) AtRabD2b与AtRabD2b[N121I]在烟草
叶片表皮细胞中的亚细胞定位。图中箭号示与高尔基体重合的
点状结构; 箭头示与高尔基体未重合的点状结构; 五边形示细
胞质。Bar=5 µm

Figure 2 The comparation of the subcellular localization of
AtRabD2b[N121I] and AtRabD2b protein in tobacco epidermal
cells
(A) The amplification of AtRabD2b[N121I] (M: 1 kb DNA ladder;
1: The full-length coding sequence of AtRabD2b; 2: The
full-length coding sequence of AtRabD2b[N121I]); (B) Sketch
map of the constructed binary vector p104-D2b[N121I]; (C) The
subcellular localization of AtRabD2b and AtRabD2b[N121I]
protein in tobacco epidermal cells. Arrows and arrowheads
indicate punctate structures that associate with Golgi stacks
and that are not labeled by Golgi stacks, respectively; Pen-
tagons indicate the cytoplasm. Bar=5 µm
et al., 2012)。为了检测AtRabD2b[N121I]是否能够互补
Ypt1的功能, 我们构建了酵母的表达载体pYX142-
D2b[N121I](图3A), 并将其转化ASY01进行组成型表
达。结果显示, 在37°C条件下, AtRabD2b转化子生长
状态良好; 而AtRabD2b[N121I]转化子的生长受到部分
抑制(图3B)。可见AtRabD2b[N121I]仅能部分互补Ypt1
的功能。



图3 AtRabD2b[N121I]转化酵母温敏突变体ASY01的互补测验
(A) 酵母表达载体pYX142-D2b[N121I]示意图; (B) 酵母互补测
验。左图中所有转化子都能在26°C正常生长; 中间图中At-
RabD2b转化子在37°C条件下生长良好, 而AtRabD2b[N121I]转
化子的生长受到部分抑制; 右图显示左边和中间两个图中转化
子对应的名称。野生型NSY125菌株和转化了pYX142空载体的
ASY01菌株分别作为正(+)和负(–)对照。

Figure 3 Functional complementation of ypt1 mutant by
AtRabD2b[N121I]
(A) Sketch map of yeast expression vector pYX142-D2b[N121I];
(B) The yeast complementary assay. All the yeast transfor-
mants grew well at 26°C in the left picture. In the middle pic-
ture, AtRabD2b yeast transformant grew well in 37°C, while
the growth of AtRabD2b[N121I] yeast transformant was partially
inhibited. The corresponding yeast transformants in left and
middle pictures were named in the right picture. The trans-
formant introduced with pYX142 was as a negative control (–)
and wild type yeast strain NSY125 was as a positive control
(+).

2.5 AtRabD2b[N121I]转基因植株表现多效性表型
超表达野生型AtRabD2b的转基因植株表现出主茎不
从莲座叶中心而从莲座叶侧面倾斜抽出的表型(王芳,
2011)。为了进一步研究N121I突变对AtRabD2b功能
的影响, 我们将前面构建的含有YFP-RabD2b[N121I]
融合蛋白的亚细胞定位载体p104-D2b[N121I]稳定转化
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图4 AtRabD2b和AtRabD2b[N121I]在拟南芥根尖细胞的亚细胞
定位观察
(A) AtRabD2b定位在细胞的点状结构上(箭头示点状结构); (B)
AtRabD2b[N121I]定位在细胞的点状结构和细胞质中(箭头示点状
结构, 菱格形示细胞质成分)。Bar=5 µm

Figure 4 The different subcellular localization of AtRabD2b
and AtRabD2b[N121I] in root tip cells of Arabidopsis thaliana
(A) AtRabD2b localized at the punctate structure in root tip
cells (Arrowheads indicate punctate structures); (B) At-
RabD2b[N121I] localized at the punctate structure and cyto-
plasm in root tip cells (Arrowheads indicate punctate struc-
tures; Rhombi indicate cytoplasm.). Bar=5 µm


野生型拟南芥, 获得表达突变基因AtRabD2b[N121I]的
转基因植株, 并与超表达野生型AtRabD2b的转基因
植株的表型进行比较。将T0代AtRabD2b[N121I]转基因
植株收获的种子播种在含有Basta除草剂的培养基上
筛选, 获得7株阳性幼苗。为了进一步研究这些阳性
植株中AtRabD2b[N121I]的表达情况, 我们对7株阳性
植株根尖细胞中是否出现黄色荧光进行了检测。图4B
显示, 黄色荧光主要出现在这些阳性植株根尖细胞的
细胞质和点状结构上。可见AtRabD2b[N121I]的表达与
其在烟草表皮细胞中的瞬时表达情况一致, 说明外源
基因AtRabD2b[N121I]在这些阳性植株中都进行了有效
地表达。而AtRabD2b转基因植株的根尖细胞中, 黄
色荧光主要集中在点状结构上(图4A)。
将7株阳性植株与野生型种植在同一条件下, 观
察它们的表型差异。发现转基因阳性植株表现出多效
性的异常表型, 在植株高度、侧枝数目以及茎、花和
角果的发育上与野生型(图5A)都有差异(图5D–G)。其
中一个最为显著的特征是转基因植株的部分主茎和
侧枝顶端部分在快速生长阶段变紫, 然后出现坏死
(图5D, E)。成熟期植株的侧枝数目明显比野生型多,
植株表现出丛生矮化的表型, 且多数角果不育(图5F,
G)。此类转基因植株的表型与Pinheiro等(2009)报道
的三突变体atrabd1/atrabd2b/atrabd2c相似, 但与超
表达野生型AtRabD2b的转基因植株(图5B, C)有较大
差异(王芳, 2011)。
2.6 讨论
本研究通过定点突变的方式首次获得了AtRabD2b
G4核苷酸结合结构域的重要氨基酸位点N处发生突
变的突变基因AtRabD2b[N121I], 并观察了突变蛋白的
亚细胞定位和功能。与野生型AtRabD2b相比, At-
RabD2b[N121I]的定位发生了部分的改变, 由以前的高
尔基体细胞器特异性定位变为高尔基体和细胞质的
弥散定位。类似的研究也表明一些Rab蛋白G4结构域
处等位突变造成了蛋白定位的改变, 如N119I突变造
成了NtRab2蛋白由原来的高尔基体特异性定位变为
弥散的细胞质定位(Cheung et al., 2002); N121I突变
造成了AtRabH1b蛋白由原来的高尔基体和细胞质定
位转变为细胞质定位(Johansen et al., 2009); N123I
突变造成了AtRabF2b蛋白由高尔基体和液泡前体特
异性定位变为细胞质定位(Kotzer et al., 2004)。上述
突变都与N突变为I引起Rab蛋白在细胞内的结构形
式改变有关。Rab蛋白特异的细胞器定位依赖于Rab
蛋白的活性形式, 即GTP的结合形式(Takai et al.,
2001; Agarwal et al., 2009)。G4结构域处保守氨基酸
N突变为I, 会造成Rab蛋白结合GTP和GDP的能力
均下降, 使其处于不结合核苷酸的自由状态(Olkk-
onen and Stenmark, 1997)。而这种自由状态的Rab
王芳: 拟南芥 RabD2b蛋白氨基酸突变对定位和功能的影响 659




图5 AtRabD2b和AtRabD2b[N121I]转基因拟南芥植株的表型
(A) 野生型植株(30天)(王芳, 2011), 箭头示发育正常的主茎; (B), (C) AtRabD2b转基因植株的2个不同株系(30天), 箭头示从莲座叶
侧面倾斜抽出的主茎; (D), (E) AtRabD2b[N121I]转基因植株的两个不同株系(35天), 箭头示茎顶端坏死部分; (F) 野生型拟南芥(左)和
AtRabD2b[N121I]转基因植株(右)成熟期(49天)表型比较, AtRabD2b[N121I]转基因植株出现矮化、丛生和不育等表型; (G) F图中
AtRabD2b[N121I]转基因植株的放大图片。Bar=1 cm

Figure 5 The phenotypes of AtRabD2b and AtRabD2b[N121I] transgenic Arabidopsis thaliana
(A) 30-day-old wild-type plant (Wang Fang, 2011, in Chinese); The arrow indicates the normal morphology of the main inflores-
cene of wild-type plant. (B), (C) Two AtRabD2b transgenic lines (30-day-old); The arrows indicate the abnormal morphology that
the main inflorescene extracted from the lateral side of rosette of AtRabD2b transgenic plants. (D), (E) The phenotype of two
AtRabD2b[N121I] transgenic lines (35-day-old); The arrows indicate the necrosis at the upper region of the stem. (F) The phenotype of
wild type (left) and AtRabD2b[N121I] transgenic plant (right) at mature time (49-day-old); AtRabD2b[N121I] transgenic plant showed
dwarf, bushy with low fertility phenotype. (G) The enlarged picture of AtRabD2b[N121I] transgenic plant in Figure 5F. Bar=1 cm


蛋白将不能被定位在特定的细胞器膜上或可能从细
胞器上解离下来, 从而产生弥散的细胞质定位。
AtRabD2b能够互补酵母ypt1突变体在37°C条件
下的生长缺陷 , 表明AtRabD2b在酵母体内行使与
Ypt1相同的功能, 即都介导了从内质网到高尔基体
的囊泡运输过程(Wang et al., 2012)。N121I的突变导
致AtRabD2b仅能部分互补酵母Ypt1的功能, 可能与
AtRabD2b的定位改变有关, 其原因为Rab蛋白的功
能在很大程度上依赖于其特异的细胞器定位(Sten-
mark and Olkkonen, 2001; Takai et al., 2001; Agar-
wal et al., 2009); AtRabD2b的细胞质非特异性定位
可能抑制了Rab蛋白正常的囊泡运输过程, 从而使其
功能发生改变。功能改变的另一方面表现为AtRab-
D2b[N121I]转基因植株出现了与AtRabD2b转基因植株
不同的异常表型。因此 , N到 I的突变不仅影响了
AtRabD2b的定位, 而且对其功能也产生了影响。
AtRabD2b[N121I]转基因植株表现出矮化、丛生和
不育等多效性表型, 其异常表型与Pinheiro等(2009)
报道的atrabd1/atrabd2b/atrabd2c三突变体的表型相
同。AtRabD2b[N121I]转基因植株中只有AtRabD2b[N121I]
进行了表达, AtRabD1、野生型AtRabD2b和AtRab-
D2c的表达量没有变化, 因此其作用机制可能与三突
变体不同, 而可能与AtRabD2b[N121I]在体内产生的显
性抑制效应有关。Batoko等(2000)的研究表明, 在烟
草叶片表皮细胞中表达AtRabD2a[N121I]的突变体能够
抑制高尔基体标记蛋白向高尔基体的分泌, 使标记蛋
白聚集在内质网。通过共表达野生型AtRabD2a则可
解除AtRabD2a[N121I]产生的抑制效应, 使标记蛋白正
常进行分泌 , 推测AtRabD2a[N121I]突变体中野生型
Rab蛋白的功能可能受到了抑制。Jones等(1995)、
Rybin等(1996)以及Cool等(1999)通过遗传和生化研
究表明, G4结构域处N121I突变及其等位的突变不仅
减弱了Rab蛋白与GTP和GDP的结合能力, 而且突
变体的表达抑制了Rab蛋白的调控蛋白GEF的功能,
660 植物学报 49(6) 2014

进而造成了对调控GEF的一类Rab蛋白的功能抑制,
但目前其具体作用机制尚不清楚。许多GEF特异性调
控1种或多种Rab亚家族蛋白从非活性GDP到活性
GTP结合形式的转换 (Boguski and McCormick,
1993; Buday and Downward, 1993)。本研究中, Rab-
D亚家族蛋白AtRabD1、AtRabD2b和AtRabD2c可能
同时由1种GEF蛋白调控, AtRabD2a[N121I]在野生型
拟南芥植株中的表达可能抑制了GEF的功能, 从而
对其调控的AtRabD1、AtRabD2b和AtRabD2c功能都
产生了影响, 故出现了AtRabD2b[N121I]转基因植株与
atrabd1/atrabd2b/atrabd2c三突变体植株表型相同的
现象。
分枝增多是AtRabD2b[N121I]转基因植株的一个主
要表型特征。植物的分枝发育是决定植物形态建成的
重要因素, 是影响作物生物量和结实量的重要农艺性
状(李亚栋等, 2009)。分枝发育受到植物激素生长素
(auxin, IAA)、细胞分裂素(cytokinin, CTK)及新型植
物激素独脚金内酯(strigolactones, SL)的协同调控。
IAA和SL抑制植物的分枝发育, CTK则促进植物的分
枝发育。PINFORMED1 (PIN1)编码一种生长素输出
载体蛋白(pin-formed auxin efflux carriers, PIN) (Gäl-
weiler et al., 1998), 水稻中该基因突变导致生长素
从顶端到基部的极性运输受阻, 引起了植物分蘖数增
加(Xu et al., 2005)。rgp1是水稻中分离的一个与酵母
Ypt3同源的Rab基因, 在烟草植株中表达水稻rgp1可
产生与本研究中AtRabD2b[N121I]转基因植株(丛生、矮
化以及不正常的花器官发育)类似的多效性表型; 检
测结果表明, 转基因植株内源细胞分裂素的含量比野
生型提高了6倍(Kamada et al., 1992; Sano et al.,
1994), 推测rgp1可能介导了细胞分裂素的信号路
径。本研究中, AtRabD2b[N121I]转基因植株和野生型的
不同组织在上述激素的种类和含量上是否存在变化,
及AtRabD2b是否也介导了激素信号调控等诸多问题
尚需进一步深入研究。
综上所述, 我们通过定点突变获得了AtRabD2b
的突变基因AtRabD2b[N121I], 并研究了点突变对At-
RabD2b定位和功能的影响, 在以往研究的基础上更深
入地揭示了AtRabD2b的功能 , 为今后开展AtRab-
D2b点突变在体内的作用机制研究奠定了理论基础。
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662 植物学报 49(6) 2014

RabD2b Protein N121I Mutation Affects the Subcellular Localiza-
tion and Functions in Arabidopsis thaliana
Fang Wang
National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China
Abstract The four conserved guanine-base-binding motifs of Rab GTPase―G1, G3, G4 and G5―are involved in the
binding and hydrolysis of GTP. We obtained the full-length coding sequence of the Arabidopsis thaliana RabD2b mutant
allele AtRabD2b[N121I] within the conserved G4 motif by changing asparagine 121 to isoleucine and studied the effects of
N121I mutation on the sublocalization and functions of AtRabD2b. The N121I mutation altered the specific localization of
AtRabD2b from Golgi stacks to both Golgi and cytoplasm. AtRabD2b could completely complement the functional defect
induced by the mutation of Saccharomyces cerevisiae Ypt1, which is homologous to AtRabD2b in yeast. However, At-
RabD2b[N121I] only partly complemented the function of Ypt1. AtRabD2b[N121I] transgenic A. thaliana showed dwarf, bushy,
sterile and necrotic phenotypes, which differed from that of AtRabD2b-overexpressing Arabidopsis with its abnormal
main-inflorescence extension phenotype. The N121I mutation alters the subcellular localization of AtRabD2b and affects
its normal functions.
Key words AtRabD2b, N121I mutation, subcellular localization, function
Wang F (2014). RabD2b protein N121I mutation affects the subcellular localization and functions in Arabidopsis thaliana.
Chin Bull Bot 49, 653–662.
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E-mail: wangf@mail.hzau.edu.cn
(责任编辑: 孙冬花)