全 文 ：分子植物育种，2013年，第11卷，第1期，第77-84页
MolecularPlantBreeding,2013,Vol.11,No.1,77-84
研究报告
ResearchReport
基因枪介导擎天凤梨遗传转化体系的建立
沈晓岚 1* 王炜勇 1 毛碧增 2 俞少华 1 田丹青 1 俞信英 1
1浙江省农业科学院花卉研究开发中心,杭州,311202;2浙江大学生物所,杭州,310029
*通讯作者,angalla@163.com
摘 要 擎天凤梨的愈伤组织获取较为困难、而且愈伤分化缓慢且极易死亡，使用农杆菌介导转基因面临着
受体难以获得、侵染后愈伤死亡率高、转化时间长以及成本高等问题。使用基因枪介导的转基因方法相对来说
更为直接快速，但也面临转化效率不高、插入基因表达定位不清等问题。本研究以擎天凤梨组培苗的茎尖生
长组织为材料，以基因枪介导结合GFP荧光蛋白基因，对转化中的主要影响因子进行研究，建立并优化了遗
传转化体系，获得了转化再生植株，并利用GFP荧光蛋白基因的荧光特性，分析确定了外源基因的表达定
位，为进一步利用分子育种手段培育擎天凤梨新品种打下基础。
关键词 擎天凤梨,基因枪,遗传转化体系,GFP荧光蛋白基因
Establishment of Particle Bombardment-mediated Genetic Transformation
SystemofGuzmaniaBromeliad
ShenXiaolan1* WangWeiyong1 MaoBizeng2 YuShaohua1 Ti nDanqing1 YuXinying1
1FlowerReserchandDevelopmentCentre,Hangzhou,311202;2ZhejiangAcademyofAgriculturalSciences,Hangzhou,310029
*Correspondingauthor,angalla@163.com
DOI:10.3969/mpb.011.000077
Abstract It is known to hardly obtain the callus ofGuzmania Bromeliad, and that the plant regenerates slowly
withthehighratemortality,whichmakeAgrobacterium-mediatedgenetictransformationofGuzmani Bromeliad
more difficulties that face difficulty to obtaining explant, high mortality after infection, transformation time con-
sumption and high costs. Particle bombardment-mediated genetic transformation is considered a more direct and
quickway,buttheproblemsoflowtransgenicefficiencyandtheuncleargeneinsertingsitesexist.Inthisresearch
weusedtopstemshootofculturedseedlingofGuzmaniaBromeliadasmaterialtostudythemainfactorsaffecting
genetic transformation, in order to establish and optimize the genetic transformation system ofGuzmania Bro-
meliad as well as obtain transgenic regenerated plant and detect and analyze the exogenous gene positioning and
expressionbyusingtheGreenfluorescentprotein(GFP).Theachievementofthisresearchmaylaythefoundation
tobreednewGuzmaniaBromeliadvarietiesbyusingmolecularbreedingapproach.
Keywords Guzmaniabromeliad,Particlebombardment-mediated,Genetictransformationsystem,GFP
收稿日期：2012-09-19 接受日期：2012-10-20 网络出版日期：2012-11-19
URL:http://5th.sophiapublisher.com/abstract-1008-mp opa
基金项目：本研究由浙江省重大科技专项重点项目(2009C12095)和浙江省科技厅公益性研究项目(2012C22085)共同资助
擎天凤梨为凤梨科(Bromeliacceae)果子蔓属(Guz-
maniaRuiz&Pav)植物的总称，其苞片颜色艳丽丰富，
观赏期长，兼具室内观赏盆栽和园林地被布置功能，
是优良的花卉盆栽植物。果子蔓属也叫擎天凤梨属。
擎天凤梨原产于美洲，通过多年的栽培和育种，已经
形成大量的观赏品种及变种，但是目前大部分擎天
凤梨的品种主要靠引进，需要支付大量的品种使用费。
快速获得具有自主知识产权的擎天凤梨新品种具有重
要的经济意义。
分子育种可以克服传统育种中远缘杂交不亲
和，育种周期长等限制，转基因育种是定向改良植物
性状、缩短育种周期的首选策略。通常的植物转基因
分子植物育种
MolecularPlantBreeding
Hyg浓度(mg/L)
Concentrationsof
hygromycin(mg/L)
0
10
20
30
40
50
接种芽数(个)
No. ofinoculated
shoots
42
42
42
42
42
42
再生数(个)
No.ofregenerated
shoots
40
12
6
4
0
0
存活率(%)
Livability(%)
95.24
28.57
14.29
9.52
0.00
0.00
生长情况
Growthstatus
生长正常,苗健康
Growhealthy
从叶尖开始发黄,部分苗死亡
Topofleavesturnedyellow，somedied
整株叶子明显发黄,大部分苗从根部开始褐化死亡
Leavesturnedyellow,mostturnedbrownanddied
少数植株新叶保持绿色,大部分从根部开始褐化死亡
Fewleaveskeptgreen,mostturnsbrownanddied
全部死亡
Alldead
全部死亡
Alldead
表1潮霉素浓度对擎天凤梨2cm小苗生长的影响
Table1Effectofhygromycinongrowthof2cmhighseedlingsofGuzmaniabromeliadin vitro
方法有农杆菌介导和基因枪介导两种，在目前的研究
中，农杆菌介导转基因因其不需要特殊仪器、费用低
等特点被广泛使用。但是在擎天凤梨中，大量愈伤的
获取极其困难、侵染后愈伤死亡率高、愈伤分化慢等
原因，造成农杆菌介导转基因的成功率低下、周期冗
长。使用基因枪介导的转基因方法相对来说更为直
接快速，但也面临转化效率不高、插入基因表达定位
不清等问题。因此，如何建立一个高效、操作方便同
时能明确表达定位的凤梨遗传转化体系，已成为观
赏凤梨分子育种的关键性基础问题。
本研究选取擎天凤梨组培苗茎尖生长组织为材
料，以基因枪介导结合GFP荧光蛋白基因，利用GFP
的荧光特性分析外源基因的定位表达，建立了擎天
凤梨的遗传转化体系。本研究对基因枪介导遗传转
化中的主要影响因子进行研究，建立并优化了遗传
转化体系，获得了转化再生植株，并利用GFP荧光蛋
白基因的荧光特性，分析确定了外源基因的表达定
位，为进一步利用分子育种手段培育擎天凤梨新品种
打下基础。
1结果与分析
1.1擎天凤梨茎尖组织和小苗对抗生素的敏感性
我们分别选择了茎尖组织、2cm小苗和4cm小
苗作为抗生素筛选受体。研究发现，茎尖组织由于切
口较多，筛选培养基中的抗生素对其的伤害非常大，
容易从伤口处褐化最终导致死亡，在潮霉素敏感性
试验中，大部分茎尖组织均褐化死亡，少量存活的几
个再生苗生长状况也并不好，很难判断是否就是抗性
苗，容易形成错判；2cm小苗和4cm小苗均是理想的
筛选受体，平均而言2cm小苗比4cm小苗对抗生素
更为敏感，且由于凤梨组培苗生长较慢，要长到4cm
需要较长的周期，因此，后期我们把生长到2cm的凤
梨小苗作为转基因苗筛选工作中的材料。
研究结果表明，擎天凤梨小苗对潮霉素和卡那霉
素反应敏感，其存活率分别与潮霉素和卡那霉素抗
生素的浓度成逆相关，擎天凤梨2cm小苗在潮霉素
40mg/L，4cm小苗在潮霉素 50 mg/L时全部死亡，
卡那霉素对擎天凤梨2cm小苗的全部致死浓度则在
75mg/L。王关林和方宏筠认为在选择外植体的抗生素
筛选浓度时，不宜选择外植体全部致死浓度，应确定
在抑制绝大部分不定芽的分化，杀死非转化细胞，能
使转化细胞生存下来的浓度(王关林和方宏筠,1998,科
学出版社,pp.323-329)。根据这一选择标准和实验结
果，我们设定存活率5%~10%的抗生素浓度为筛选浓
度，因此得到擎天凤梨2cm小苗的潮霉素选择浓度
为30mg/L(表1)，4cm小苗为40mg/L(表2)；卡那霉素
2cm小苗选择浓度为50mg/L(表3)。
1.2基因枪不同轰击参数下的存活率和抗性芽获得率
基因枪轰击参数与转基因效率直接相关，不同
物种相适应的轰击参数也不同，为提高观赏凤梨转
基因效率，优化遗传转化体系，我们按不同的金粉直
径、氦气压力、射程距离、不同的射击枪数及预培养
时间设计试验，设置了16个处理。在进行不同轰击参
数下基因枪轰击后，分别统计恢复培养后存活的芽数
78
Hyg浓度(mg/L)
Concentrationsof
hygromycin(mg/L)
0
10
20
30
40
50
接种数(个)
N .ofinoculated
seedlings
42
42
42
42
42
42
存活数(个)
No.ofalive
seedlings
38
26
16
6
4
0
存活率(%)
Livability(%)
90.48
61.90
38.10
14.29
9.52
0.00
生长情况
Growthstatus
生长正常,苗健康
Growhealthy
老叶略发黄,部分苗从根部开始褐化继而死亡
Someleavesturnedalittlebityellow
整株叶子明显发黄,部分苗褐化死亡
Leavesturnedacertainextentyellow
叶子明显发黄
Leavesobviouslyturnedyellow
叶子变黄,大部分发白死亡
Leavesturnedyellowandmostdied
叶子变黄,继而转白死亡
Leavesturnedyellowandalldied
表2潮霉素浓度对擎天凤梨4cm小苗生长的影响
Table2Effectofhygromycinongrowthof4cmhighseedlingsofGuzmaniabromeliadin v tro
Kn浓度(mg/L)
Concentrationsof
kanamycin(mg/L)
0
10
20
30
40
50
75
100
接种数(个)
N .ofinoculated
seedlings
42
42
42
42
42
42
42
42
存活数(个)
No.ofaliveseedlings
40
31
27
25
12
3
0
0
存活率(%)
Livability(%)
95.24
73.81
64.29
59.52
28.57
7.14
0.00
0.00
生长情况
Growthstatus
生长正常,苗健康
Growhealthy
叶子略发黄,少量苗死亡
Someleavesturnedalittlebityellow
叶子明显发黄,部分苗褐化死亡
Leavesturnedacertainextentyellow
整株叶子明显发黄,部分苗死亡
Leavesturnedyellow,somedied
叶子明显发黄,大量苗死亡
Leavesobviouslyturnedyellow
叶子变黄,大部分死亡
Leavesturnedyellowandmostdied
叶子变黄,继而转白死亡
Leavesturnedyellowandalldied
全部死亡
Alldeath
表3卡那霉素浓度对擎天凤梨2cm小苗生长的影响
Table3Effectofkanamycinongrowth2cmhighseedlingsofGuzmaniabromeliadin vitro
及筛选培养后获得的抗性芽数。在所有的处理中，最终
共筛选获得12个抗性苗。按各个参数加权平均后分
别统计存活率和抗性芽获得率，结果表明，金粉直径
0.6μm无论从存活率和抗性芽获得率来说都要优于
1.0μm(表4)；氦气压力则是1100psi存活率较高，
而1350psi抗性芽获得率更高(表5)；射程则是9cm
最佳，6cm射程只存活了一个芽，且没有抗性芽获得
(表6)；从射击枪数看，存活率差异较大，而抗性芽获
得率则与枪数成正比(表7)；预培养2天后进行轰击
的茎尖组织全部死亡，而直接轰击的存活率在
10.87%，抗性芽获得率1.32%。
1.3转基因植株的 PCR检测
分别以未转基因组培苗(CK)和转基因抗性苗的
DNA为模板，进行PCR扩增，对PCR产物进行电泳
检测(图1)。检测结果显示，阴性对照凤梨植株1和
基因枪介导擎天凤梨遗传转化体系的建立
EstablishmentofParticleBombardment-mediatedGeneticTransformationSystemofGuz aniaBromeliad79
分子植物育种
MolecularPlantBreeding
射击数
Amountofshot
1
2
3
接种芽数(个)
No.ofinoculated
shoots
650
130
130
再生数(个)
No.ofregenerated
shoots
63
5
33
存活率(%)
Liv bility(%)
9.69
3.85
25.38
获得抗性芽个数(个)
Numberofantibiotic
resistantbuds
6
2
4
抗性芽获得率(%)
Rateofantibiotic
resistantbuds(%)
0.92
1.54
3.08
表7不同射击数对芽再生和获得抗性芽的影响
Table7EffectofshotamountonshootsregenerationandrateofantibioticresistantbudsofGuzmaniabromeliad
氦气压力(psi)
Heliumpressure
(psi)
1100
1350
接种芽数(个)
No.ofinoculated
shoots
455
455
再生数(个)
No.ofregenerated
shoots
64
37
存活率(%)
Livability(%)
14.07
8.13
获得抗性芽个数(个)
No.ofantibiotic
resistantbuds
5
7
抗性芽获得率(%)
Rateofantibiotic
resistantbuds(%)
1.10
1.54
表5不同氦气压力对芽再生和获得抗性芽的影响
Table5EffectofheliumpressureonshootsregenerationandrateofantibioticresistantbudsofGuzmania bromeliad
射程(cm)
Fieldoffire(cm)
6
9
12
接种芽数(个)
No.ofinoculated
shoots
130
520
260
再生数(个)
No.ofregenerated
shoots
1
72
28
存活率(%)
Liv bility(%)
0.77
13.85
10.77
获得抗性芽个数(个)
Numberofantibiotic
resistantbuds
0
10
2
抗性芽获得率(%)
Rateofantibiotic
resistantbuds(%)
0.00
1.92
0.77
表6不同射程对芽再生和获得抗性芽的影响
Table6EffectoffieldoffireonshootsregenerationandrateofantibioticresistantbudsofGuzma iab omeli d
转基因阴性植株5中均没有观察到相应的条带，株
系 2、3和 4的转基因凤梨植株均观察到大小约为
689bp的目标条带，表明3个转基因株系的基因组
中均整合有GFP基因。
1.4 GFP 在擎天凤梨植株叶片细胞上的瞬时表达和
稳定表达荧光观察
把瞬间转化的凤梨叶片培养24h后在激光共聚
焦显微镜下观察，发现叶片叶肉细胞和表皮细胞均
在局部出现大量绿色荧光圆点(图2)。推断这些绿色
荧光圆点即为GFP绿色荧光基因在擎天凤梨叶片叶
肉细胞和表皮细胞中的瞬时表达。绿色荧光圆点分
布于不同的细胞中，疑似细胞核的位置，初步认定
金粉直径(μm)
Diameterofgolden
powder(μm)
0.6
1.0
接种芽数(个)
No.ofinoculated
shoots
455
455
再生数(个)
No.ofregenerated
shoots
57
44
存活率(%)
Livability(%)
12.53
9.67
获得抗性芽个数(个)
No.ofantibiotic
resistantbuds
8
4
抗性芽获得率(%)
Rateofantibiotic
resistantbuds(%)
1.76
0.88
表4包埋金粉不同直径对芽再生和获得抗性芽的影响
Table4EffectofgoldenpowderdiameteronshootsregenerationandrateofantibioticresistantbudsofGuzmaniabromeliad
图1GFP基因转基因植株PCR结果分析
注:M:1kbmarker;1:CK;2~4:转基因阳性植株;5:转基因阴
性植株
Figure1ExpressionanalysisofGFPgeneintransgenicGuzmania
BromeliadbyPCR
Note: M:1 kb marker; 1: CK; 2~4: Positive transgenic plants; 5:
Negativetransgenicplants
80
图2pBIN438-GFP融合蛋白在‘太阳神’植株叶肉细胞上的瞬
间表达
注:A:光镜下的形态;B:488nm激发光下的荧光;C:叶绿素
自发荧光;D:组合照片
Figure 2 The transient expression ofpBIN438-GFP inGuzmania
‘Focux’mesophyllcell
Note:A:Sightinlightmicroscope;B:Thetransientexpressionin
a laser scanning confocal microscope with 488 nm excitation,
greenforGFPfluorescence;C:Chlorophyllautofluorescence;D:
Combinationsphoto,ofA,BandC
pBIN-438-GFP融合蛋白的瞬时表达主要定位于擎
天凤梨叶片的细胞核中，在未转化的叶片上则没有
看到类似的荧光现象。
分别把 PCR检测阳性的转基因凤梨叶片和未
转基因的对照植株叶片在激光显微镜下观察，发现
除了叶绿素自发红色荧光(图3C1)外，在488nm激
发光下转基因凤梨叶片局部出现大量绿色荧光圆点
(图3B1)，应该为GFP基因在转基因凤梨叶片中的
表达。绿色荧光圆点存在于不同的细胞中，大小不
一，从叶尖到叶鞘，从叶片边缘到中间叶脉位置均有
分布，荧光数量呈现不均匀分布；而在未转基因的对
照植株叶片中则没有观察到相应的绿色荧光现象，
除了叶绿素自发红色荧光(图3C2)外，将荧光背景调
整到最亮的情况下，也只观察到叶片表皮中气孔的
自发荧光现象(图3B2)。由此我们推断pBIN438-GFP
融合蛋白主要定位于凤梨叶片表皮细胞和叶肉细胞
的细胞核中，这个结果和我们之前在瞬时表达的凤
梨叶片上观察到的是一致的。根据抗性筛选、PCR检
测及共聚焦显微镜观察的结果，目前共获得3个转
基因株系。
2讨论
抗生素筛选是遗传转化中的重要阶段，选择适当
图3pBIN438-GFP融合蛋白在‘太阳神’植株表皮细胞的细
胞核上的表达
注:E:转基因植株;F:未转基因对照;A1,A2:光镜下的形态;
B1,B2:488nm激发光下的荧光;C1,C2:叶绿素自发荧光;D1,
D2:组合照片
Figure3ThetransgenicexpressionofpBIN438-GFPinGuzmania
‘Focux’epidermalcell
Note: E: Transgenic expression; F: Non-transgenic CK; A1,A2:
Sight in light microscope; B1,B2: The transient expression in a
laserscanningconfocalmicroscopewith488nmexcitation,green
for GFP fluorescence; C1,C2: Chlorophyll autofluorescence; D1,
D2:Combinationsphoto,ofA,BandC
的筛选受体和选择压是成功的关键因素。不适合的筛
选受体会导致漏判和错判，致使后期PCR检验工作
量的增大甚至直接导致目标植株的死亡，在前期抗
生素敏感性实验中，我们选择了茎尖组织及不同大小
的苗作为抗生素筛选受体，发现其对抗生素的敏感性
与苗的大小成反比，且越小的苗其时间成本越小。但
是直接使用茎尖组织存在错判的问题，茎尖组织切口
较多，极容易受到抗生素的伤害，导致其从伤口处褐
化并最终死亡，形成错判；而2cm小苗是较为理想的
筛选受体，其植株较为完整，没有直接的伤口，生长
周期在合理范围内，对抗生素的敏感程度适当，用其
基因枪介导擎天凤梨遗传转化体系的建立
EstablishmentofParticleBombardment-mediatedGeneticTransformationSystemofGuz aniaBromeliad81
分子植物育种
MolecularPlantBreeding
作为筛选材料，可以获得较为稳定可靠的筛选结果。
擎天凤梨的愈伤组织获取较为困难、愈伤分化
缓慢且极易死亡，使用农杆菌介导转基因面临着受体
难以获得、侵染后愈伤死亡率高、转化时间成本高等
问题。基因枪转化法因其不受物种类型的范围限制，
靶受体类型广泛，可控度高，重复性好，是除了农杆
菌法外应用最广的遗传转化技术，其靶受体几乎包括
所有具有潜在分裂能力的细胞或组织，如幼嫩的组
织、幼胚、茎尖等。使用茎尖作为靶受体，以基因枪介
导的方法相对来说更为直接快速，更适合擎天凤梨
的遗传转化。
传统观点认为基因枪转化法易产生多拷贝、导
致基因沉默、遗传稳定性差等现象。不过在参考大量
基因枪转化的实验报道后我们发现，此观点有失偏僻。
在多种作物的基因枪介导的遗传转化研究中，如水稻
(Tuetal.,2000;Yeetal.,2001;Dattaetal.,2003)、小麦
(Stoger et al., 1998)、玉米(郭嘉等, 2012)和马铃薯
(Romanoetal.,2003)等转基因研究，发现多拷贝转基
因植株与单一拷贝的转基因植株在基因表达上效果
是相同的，在超过一个拷贝基因的转基因作物中均出
现了外源基因高水平表达的现象。在本研究中，通过激
光共聚焦显微镜，我们观察到在大部分擎天凤梨转基
因植株中，叶肉细胞和表皮细胞中均出现了大量的绿
色荧光圆点，表明GFP基因在叶片细胞中得到了较强
的表达。也有少量植株中未观察到荧光现象，表现出基
因沉默，但是数量仅在10%以下。
基因枪介导法的转化率变化范围较大，在不同的
研究报道中，不同物种间呈现数量级的差别，甚至同
一受体在不同的研究中也出现了较大的差异，例如
在基因枪法转化大豆的首例报道中McCabe等以大
豆茎尖为靶受体，转化率达2%(MeCabeetal.,1988)，
但在其他的相关报道中转化率远低于这个数；刁现民
等(1999)以谷子愈伤组织为靶受体的基因枪法转化率
高达4%，但有的报道只有0.03%(Wilkinsaetal.,2000)。
影响转化率的因素很多，在基因枪转化法中，不同的
轰击参数对转基因芽的存活率和转化率都有直接的
影响，本研究中我们通过金粉直径、氦气压力、射程及
不同的射击枪数等轰击参数的设置来找出影响其转
化率的关键因子。结果表明，金粉直径0.6μm、氦气压
力1100psi或1350psi均可；射程9cm、射击枪数3
枪能够获得较好的存活率和最佳的转化率。
观赏凤梨生长周期慢，常规育种时间长，农杆菌介
导的遗传转化又面临着愈伤分化难的问题。本研究
利用基因枪介导结合GFP绿色荧光蛋白基因，建立
了高效的擎天凤梨遗传转化体系，在幼苗甚至刚分化
的阶段就可以通过激光共聚焦显微镜进行初步的筛
选和验证，减少了工作量，缩短了观赏凤梨遗传转化
育种的前期筛选时间。通过激光共聚焦显微镜结合
GFP绿色荧光蛋白基因，可以观察到外源基因在转化
植株细胞上的定位，为后期其他观赏凤梨的遗传转化
和外源基因的定位研究提供一定的基础和依据。
3材料和方法
3.1材料
本实验植物材料为擎天凤梨属太阳神 G.‘Focux’
和纯黄星 G.‘Diana’的组培苗茎尖生长组织。质粒
pBIN438-GFP由浙江大学生物技术研究所提供。使
用基因枪为PDS-1000/He(Bio-Rad)。使用显微镜为
德国产Zeiss510META型激光扫描共聚焦显微镜。
高渗培养基为MS+0.1mg/LNAA+0.5mg/LBA+
18.2g/L山梨醇+18.2g/L甘露醇；增殖和恢复培养基
为MS+0.1 mg/L NAA+0.5 mg/L BA；筛选培养基为
MS+0.1mg/LNAA+0.5mg/LBA+抗生素；壮苗培养
基为1/2MS。
PCR检测用的引物为 GFP(F)：5-ATGGTGAG-
CAAGGGCGAGGA-3和 GFP(R)：5-TCACGAAC-
TCCAGCAGGACC-3。
3.2受体的准备
从擎天凤梨组培苗中剥取大小约0.1~0.2cm的
茎尖生长组织，接种于高渗培养基，培养4~6h后可
进行轰击。
3.3基因枪介导转化擎天凤梨茎尖生长组织
按毛碧增等(2004)及沈晓岚(2010)的方法，使用
基因枪对茎尖组织进行轰击。
为优化观赏凤梨遗传转化体系，我们进行了基
因枪不同轰击参数的比较实验，分别对金粉直径、氦
气压力、射程、不同的枪数及不同的预培养时间进行
比较。我们将这五个参数进行设计，共设置了16个处
理(表8)，在分别进行不同轰击参数下基因枪轰击后，
将转化茎尖组织放置到恢复培养基中进行恢复培
养，统计存活的芽数，到小苗长到2cm左右时放置
于筛选培养基中进行筛选培养，分别统计抗性芽获
得数，最后按各个参数加权平均后分别计算各参数的
存活率和抗性芽获得率。
3.4转化子的筛选
经轰击的凤梨茎尖组织在增殖培养基上恢复培
82
序号
No.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
编号
Treatment
F-111
F-112
F-121
F-121b
F-121c
F-122
F-123
F-211
F-211b
F-211c
F-211d
F-211e
F-212
F-213
F-221
F-222
金粉直径(μm)
Goldpowder
diameter(μm)
0.6
0.6
0.6
0.6
0.6
0.6
0.6
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
氦气压力(psi)
Heliumpressure
(psi)
1100
1100
1350
1350
1350
1350
1350
1100
1100
1100
1100
1100
1100
1100
1350
1350
射程(cm)
Fieldoffire
(cm)
9
12
9
9
9
12
6
9
9
9
9
9
12
6
9
12
枪数
Firenumber
1
1
1
2
3
1
1
1
2
3
1
2
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1
1
1
预培养
Pr -culture
直接轰击
Directfire
直接轰击
Directfire
直接轰击
Directfire
直接轰击
Directfire
直接轰击
Directfire
直接轰击
Directfire
直接轰击
Directfire
直接轰击
Directfire
直接轰击
Directfire
直接轰击
Directfire
预培养2d
Pre-culture2daysbeforefire
预培养2d
Pre-culture2daysbeforefire
直接轰击
Directfire
直接轰击
Directfire
直接轰击
Directfire
直接轰击
Directfire
芽数
Sprout
number
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表8基因枪不同轰击参数试验设计
Table8Theexperimentaldesignofdifferentparameterbygenegun
养，待生长至2cm大小的苗时转接于含相应浓度抗
生素的筛选培养基中筛选抗性转化子，每隔45d换一
次培养基。3~5个月后，将筛选存活的植株转接到壮苗
培养基中培养。
3.5转基因植株的 PCR检测
以筛选存活的植株叶片DNA为模板进行PCR
扩增。PCR扩增程序为 94℃ 5 min；94℃ 30 s，56~
58℃30s，72℃1min，30个循环；72℃10min。扩增
结果用0.8%琼脂糖凝胶进行电泳检查。目标条带大
小为689bp。
3.6转基因植株的共聚焦显微镜荧光定位观察
剪取PCR检测为阳性的转基因植株的叶片，放
置于载玻片上，滴一滴蒸馏水，盖上盖玻片，放置到
激光扫描共聚焦显微镜下观察，使用激发光波长
488nm。
3.7 pBIN438-GFP 在擎天凤梨叶片表皮细胞上的瞬
间表达
按沈晓岚(2010)的方法，用基因枪介导法将质粒
导入凤梨叶片后，放入组培室避光培养24~36h后在
共聚焦显微镜下观察。
基因枪介导擎天凤梨遗传转化体系的建立
EstablishmentofParticleBombardment-mediatedGeneticTransformationSystemofGuz aniaBromeliad83
分子植物育种
MolecularPlantBreeding
作者贡献
沈晓岚和毛碧增是本研究的实验设计和实验研
究的执行人；沈晓岚及王炜勇完成数据分析，论文初
稿的写作；俞少华、田丹青和俞信英参与实验设计，
试验结果分析；沈晓岚是项目的构思者及负责人，指
导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者
都阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究由浙江省重大科技专项重点项目(2009C-
12095)和浙江省科技厅公益性研究项目(2012C-
22085)共同资助。
参考文献
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