全 文 ：食用菌学报?２０１１．１８（３）：９～１１
收稿日期：２０１１－０８－０８原稿；２０１１－０８－２４修改稿
基金项目：河南省科技攻关项目（编号：０８２１０２１５００４８）的部分研究内容
作者简介：曹育博（１９８６－），男，河南农业大学在读硕士研究生，主要从事食用菌分子生物学方面研究。
＊本文通讯作者　Ｅ－ｍａｉｌ：ｑｌｉｙｏｕ＠ｈｅｎａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
文章编号：１００５－９８７３（２０１１）０３－０００９－０３
基因枪法遗传转化双孢蘑菇菌褶
曹育博，刘天翔，周巍巍，高玉千，戚元成，申进文，邱立友＊
（河南农业大学生命科学学院，农业部农业微生物酶工程重点实验室，河南郑州４５０００２）
摘　要：以双孢蘑菇（Ａｇａｒｉｃｕｓ　ｂｉｓｐｏｒｕｓ）２７９３为试材，采用基因枪法对其菌褶进行遗传转化，相对转化率为
２．６９％，转化子经ＰＣＲ检测表明，外源潮霉素Ｂ抗性基因已经被转入到菌丝体中。
关键词：双孢蘑菇；基因枪；遗传转化；潮霉素Ｂ抗性
　　双孢蘑菇（Ａｇａｒｉｃｕｓ　ｂｉｓｐｏｒｕｓ）是世界上栽培
最广泛、生产量和消费量最大的食用菌。２０世纪
９０年代初，许多研究者采用多种方法进行了双孢
蘑菇的基因转化，包括对原生质体、菌丝或子实
体等的ＰＥＧ介导转化、电转化和基因枪转化等，
但均未获得成功［１－４］。１９９６年，ＶＡＮ　ＤＥ　ＲＨＥＥ
等以大肠杆菌潮霉素Ｂ抗性基因为选择标记，应
用原生质体电转化法建立了双孢蘑菇有效而稳
定的转化系统［５，６］。目前，双孢蘑菇最为常用的
转化系统是ＣＨＥＮ等的农杆菌介导的菌褶转化
法［７］。该法比食用菌中常见的原生质体ＰＥＧ介
导转化和电转化简便，但比基因枪法繁琐。本文
报道的是应用基因枪法转化双孢蘑菇菌褶获得
潮霉素Ｂ抗性转化子的实验结果。
１　材料与方法
１．１ 菌株与质粒
　　双孢蘑菇（Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ）２７９３菌株，由河南农
业大学应用真菌实验室提供。质粒ＰＡＮ７－１，含
构巢曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｄｕｌａｎｓ）ＧＰＤ启动子和
潮霉素Ｂ抗性基因，由荷兰ＰＵＮＴ博士赠送。
１．２ 培养基
　　ＰＤＡ加富高渗培养基：２００ｇ马铃薯，２０５ｇ
蔗糖，２０ｇ葡萄糖，２ｇ酵母膏，２ｇ　ＭｇＳＯ４，２ｇ
ＫＨ２ＰＯ４，１ｇ胰蛋白胨，２０ｇ琼脂，１０００ｍＬ蒸
馏水。
１．３ 潮霉素适宜浓度筛选
　　取在ＰＤＡ平板中培养的双孢蘑菇菌落边缘
菌丝块（直径９ｍｍ），分别接种于含０、１、２、３、４、
５μｇ／ｍＬ潮霉素Ｂ的ＰＤＡ平板中央，每处理３
个重复，置于２８℃的恒温培养箱中培养１０　ｄ，观
察并记录菌块的生长情况。
１．４ 双孢蘑菇菌褶外植体的制备
　　选取幼嫩的未开伞的双孢蘑菇子实体，用
７０％的酒精将子实体的表面消毒１ｍｉｎ，无菌水
冲洗３遍，在超净台上用解剖镊切取３～５ｍｍ大
小的菌褶块置于ＰＤＡ加富高渗培养基上，过夜
培养，待用。
１．５ 基因枪转化
　　采用ＰＤＳ－１０００／Ｈｅ型基因枪，包裹质粒
ＰＡＮ７－１的微弹（微弹的制备按照说明书进行）。
基因枪轰击参数是：阻挡网与轰击材料（双孢蘑
菇菌褶外植体）之间的距离９ｃｍ，可裂膜的压力
１１００ｐｓｉ，真空度２７ｐｓｉ，轰击２次。基因枪空打
的菌褶外植体为对照。
１．６ 转化子的初筛和复筛
　　将轰击后的双孢蘑菇外植体置于２８℃培养
箱中培养２ｄ后转入１．３中筛选出的含适宜浓度
潮霉素的ＰＤＡ筛选培养基上，在２８℃下静置培
养１０ｄ左右，根据菌块菌丝是否萌发进行转化子
的初步筛选。１５ｄ后，挑取新生长的菌丝，转入
含适宜浓度潮霉素的ＰＤＡ筛选培养基中继续筛
选，能在培养基上生长的菌丝块即认为是拟转
化子。
１．７ 转化子的ＰＣＲ鉴定
　　将选取的拟转化子分别转接在含潮霉素的
食　用　菌　学　报 第１８卷
ＰＤＡ培养基上和不含潮霉素的ＰＤＡ培养基上，
２８℃培养２０ｄ。随机选择３个经过两次抗性筛
选后仍能长出菌丝的转化子，提取总ＤＮＡ，以潮
霉素Ｂ抗性基因引物Ｐ１和Ｐ２进行ＰＣＲ扩增。
上游引物Ｐ１：５′－ＧＧＡＡＧＴＧＣＴＴＧＡＣＡＴＴＧ－
ＧＧＧＡＧＴ　Ｔ－３′，下游引物Ｐ２：５′－ＴＡＣＴＴＣ－
ＴＡＣＡＣＡＧＣＣＡＴＣＧＧＴＣＣＡＧ－３′。ＰＣＲ扩增
的反应体系为２５μＬ：１００　ｎｇ模板ＤＮＡ１．０μＬ，
１０ × ｂｕｆｆｅｒ （含 Ｍｇ２＋ ）２．５μＬ，ｄＮＴＰ
（２．５　ｍｍｏｌ／Ｌ）２．０μＬ，１．５　Ｕ　Ｔａｑ 聚合酶
０．５μＬ，引物（０．１　ｍｍｏｌ／Ｌ）各１．０μＬ，ｄｄＨ２Ｏ
１７μＬ。ＰＣＲ扩增条件是：９４℃预变性５　ｍｉｎ，然
后９４℃变性１　ｍｉｎ，５８℃退火１　ｍｉｎ，７２℃延伸
２　ｍｉｎ，扩增３５个循环，最后７２℃延伸１０　ｍｉｎ，
４℃保存。ＰＣＲ产物采用１％琼脂糖进行凝胶电
泳检测，英国Ｓｙｎｇｅｎｅ　Ｇ：ＢＯＸ 凝胶成像系统
照相。
２　结果与分析
２．１ 潮霉素适宜浓度筛选
　　双孢蘑菇在不同浓度潮霉素平板上２８℃
恒温培养１２ｄ后的生长情况显示，双孢蘑菇菌
丝对潮霉素Ｂ特别敏感，随着潮霉素Ｂ浓度增
加，生长速度愈慢，菌丝柔弱，不整齐，在潮霉素
Ｂ浓度为３μｇ／ｍＬ的培养皿中菌块稍有生长，
在潮霉素浓度为４μｇ／ｍＬ的平板中菌丝生长明
显受到抑制，当潮霉素浓度为５μｇ／ｍＬ时没有
菌丝生长。
因此选用潮霉素浓度为５μｇ／ｍＬ（图１）。
图１　ＰＤＡ培养基中潮霉素Ｂ浓度 为５μｇ／ｍＬ时
双孢蘑菇菌丝生长情况
Ｆｉｇ．１　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　５μｇ／ｍＬ　ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ　Ｂ　ｏｎ　ｔｈｅ
ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　ｎｏｎ－ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ　ｍｙｃｅｌｉｕｍ
２．２ 双孢蘑菇潮霉素抗性转化子的初筛
　　初筛共得到７个拟转化子（图２），相对转化
率（转化子数／外植体总数）为２．６９％。
图２　双孢蘑菇拟转化子在含５μｇ／ｍＬ
潮霉素Ｂ的ＰＤＡ平板上的生长情况
Ｆｉｇ．２　Ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ
ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｒｅｓｅｎｃｅ　ｏｆ　５μｇ／ｍＬ　ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ　Ｂ
２．３ 含潮霉素抗性转化子的复筛
　　将拟转化子转移到含５μｇ／ｍＬ潮霉素的
ＰＤＡ平板上进行继代培养，有菌丝长出，可初步
判定为阳性转化子。
２．４ 潮霉素抗性的阳性转化子ＰＣＲ鉴定
　　随机选择３个阳性转化子提取其总ＤＮＡ，以
潮霉素Ｂ抗性基因引物进行ＰＣＲ扩增，均能扩
增出一条与设计引物大小预期的潮霉素抗性基
因大小相同的片段。未转化双孢蘑菇基因组
ＤＮＡ即阴性对照没有扩增出条带（图３）。表明
外源潮霉素Ｂ抗性基因已经被转入到菌丝体中。
泳道 Ｍ：分子量标记；泳道１：未转化双孢蘑菇基因组（对照）；
２－４：不同的抗性转化子
Ｌａｎｅ　Ｍ：ｍａｒｋｅｒｓ；ｌａｎｅ　１：ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ（ｎｏｎ－ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔ）；
ｌａｎｅｓ　２－４：Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ；
图３　潮霉素抗性转化子的ＰＣＲ检测
Ｆｉｇ．３　Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ　Ｂ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｇｅｎｅ
ｉｎｔｏ　Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ
２．５ 转化子的遗传稳定性
　　将鉴定得到的转化子继代培养至第三代，菌
丝生长速度明显降低，菌丝生长稀疏，ＰＣＲ扩增
０１
第３期 曹育博，等：基因枪法遗传转化双孢蘑菇菌褶
未能检测出潮霉素Ｂ抗性基因。
３　讨论
　　与其它转化方法相比，基因枪法不需要制备
原 生 质 体，没 有 农 杆 菌 参 与，比 较 简 便。
ＡＬＴＰＥＴＥＲ等认为，基因枪转化会产生大量的、
多拷贝和复杂的转基因位点，这些基因进一步重
组从而导致不稳定和基因沉默［８］。双孢蘑菇菌
丝每个细胞中含有多个核，其中带有外源基因的
核极易丢失，如要获得稳定的转化子，需要进行
大量筛选。笔者在以双孢蘑菇的菌丝体制备外
植体进行基因枪转化时未能得到转化子，应用基
因枪法转化双孢蘑菇菌褶获得含潮霉素Ｂ抗性
基因的转化子，转化子不稳定的原因有待进一步
研究。
参考文献
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ａｌ．Ａ　ｆｒｕｉｔｉｎｇ　ｂｏｄｙ　ｔｉｓｓｕｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　 ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　 ｏｆ
Ａｇａｒｉｃｕｓ　ｂｉｓｐｏｒｕｓ［Ｊ］．Ａｐｐｌ　Ｅｎｖｉｒｏｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，
２０００，６６（１０）：４５１０－４５１３．
［８］ＡＬＴＰＥＴＥＲ　Ｆ，ＢＡＩＳＡＫＨ　Ｎ，ＢＥＡＣＨＹ　Ｒ，ｅｔ　ａｌ．
Ｐａｒｔｉｃｌｅ　 ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ　 ａｎｄ　 ｔｈｅ　 ｇｅｎｅｔｉｃ
ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ｃｒｏｐｓ：ｍｙｔｈｓ　ａｎｄ　ｒｅａｌｉｔｉｅｓ［Ｊ］．
Ｍｏｌ　Ｂｒｅｅｄ，２００５，１５（３）：３０５－３２７．
Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｇａｒｉｃｕｓ　ｂｉｓｐｏｒｕｓ　ｂｙＰａｒｔｉｃｌｅ
Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｆｒｕｉｔ　ＢｏｄｙＧｉｌ　Ｔｉｓｓｕｅ
ＣＡＯ　Ｙｕｂｏ，ＬＩＵ　Ｔｉａｎｘｉａｎｇ，ＺＨＯＵ　Ｗｅｉｗｅｉ，ＧＡＯ　Ｙｕｑｉａｎ，ＱＩ　Ｙｕａｎｃｈｅｎｇ，ＳＨＥＮ　Ｊｉｎｗｅｎ，ＱＩＵ　Ｌｉｙｏｕ＊
（Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈｅｎａｎ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ，Ｈｅｎａｎ　４５０００２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｇａｒｉｃｕｓ　ｂｉｓｐｏｒｕｓ　ｂｙ　ｐａｒｔｉｃｌｅ　ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ　ｏｆ　ｆｒｕｉｔ　ｂｏｄｙ　ｇｉｌ　ｔｉｓｓｕｅ　ｗａｓ
ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ　ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ　Ｂ　ｇｅｎｅ　ａｓ　ａ　ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ｍａｒｋｅｒ．ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｒｅｖｅａｌｅｄ　ｔｈａｔ　ＤＮＡ
ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｔｈｅ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｍａｒｋｅｒ　ｈａｄ　ｂｅｅｎ　ｉｎｓｅｒｔｅｄ　ｉｎｔｏ　ｆｕｎｇａｌ　ｈｙｐｈａｅ　ｗｉｔｈ　ａ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ
ｏｆ　２．６９％．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ａｇａｒｉｃｕｓ　ｂｉｓｐｏｒｕｓ；ｐａｒｔｉｃｌｅ　ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ；ｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ；ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ　Ｂ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ
［本文编辑］　王瑞霞
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