全 文 ：分子植物育种，2007年，第5卷，第4期，第451-454页
MolecularPlantBreeding,2007,Vol.5,No.4,451-454
基金项目：本研究由国家高技术研究发展863计划(2002AA241111)和黑龙江省科技计划项目(GB04B606-02-02)资助。
研究报告
ResearchReport
水稻质膜H+-ATPase基因对拟南芥遗传转化及其抗盐性分析
管清杰 1 程玉祥 1 高野哲夫 2 柳参奎 1*
1东北林业大学盐碱地生物资源环境研究中心抗性分子生物学实验室,哈尔滨,150040;2东京大学亚洲生物资源环境研究中心,东京,188000,日本
摘 要 RT-PCR扩增得水稻质膜H+-ATPase全长cDNA(PM-H+-ATPase)，构建了植物表达载体获得质粒
pBI121-PM-H+-ATPase，农杆菌介导、真空渗入法转化PM-H+-ATPase基因入拟南芥，得35株T1代卡那抗性
植株。抗性植株PCR分析表明，抗性植株整合了目的基因。Northern杂交分析进一步表明T3代转基因拟南
芥表达了目的基因。抗盐(NaHCO3和NaCl)性分析表明：转基因植株的耐盐能力明显高于野生型；盐碱胁迫
下转基因植株开花优先于野生型植株。
关键词 水稻(OryzasativaL.)，质膜H+-ATPase，转基因拟南芥，盐(NaHCO3和NaCl)逆境
ArabidopsisOverexpressingRicePlamsaMembraneH+-ATPaseGeneand
AnalysisofitsSaltTolerance
GuanQingjie1 ChengYuxiang1 TetsuoTakano2 LiuShenkui1*
1StressMolecularBiologyLaboratory,AlkaliSoilNaturalEnvironmentalScienceCenter,NortheastForestryUniversity,Harbin,150040;2AsianNat-
uralEnvironmentScienceCenter(ANESC),TheUniversityofTokyo,MidoriCho1-1-1,NishitokyoCity,Tokyo,188000,Japan
Abstract ThecompletecodingregionofriceplasmamembraneH+-ATPase(PM-H+-ATPase)wasamplifiedby
RT-PCR,andwasfusedintopBI121plantexpressionvectortoconstructthepBI121-PM-H+-ATPaseplasmid.The
resultantplasmidswereintroducedintoArabidopsisbyAgrobacteriumtumefaciens(strainEHA105)-mediated
transformationusingthevacuuminfiltrationmethod.Thirty-fiveindividualkanamycinresistantplantswereob-
tained.PCRanalysisshowedthatkanamycinresistantplantshadintegratedthericePM-H+-ATPase.Furthermore,
NorthernblotanalysisshowedthatT3generationtransgenicArabidopsisseedlingshaveoverexpressedrice
PM-H+-ATPase.SalttoleranceoftransgenicArabidopsisseedlingswasanalyzed,andtheresultsshowedthattrans-
genicArabidopsisplantshavegreatersalttoleranceattheseedlingstagethanwild-typeplantsundersaltstress.
Aslo,transgenicArabidopsisplantsfloweringhaveprecedenceoverwild-typeplantsunderNaHCO3stress.
Keywords Rice,PlasmamembraneH+-ATPase,TransgenicArabidopsis,Salt(NaHCO3orNaCl)stress
生物体内大多数的ATP是依靠ATP合酶催化
合成的。ATP合酶可以分为储能F-型、质膜P-型和
液泡V-型三类(ArechagaandJones,2001)。细胞膜
上ATP酶(plasmamembraneATPase)对细胞维持内
外环境的平衡具有极重要的作用，由它建立的跨膜
质子推动力△μH+，可用于ATP的形成，驱动次级离
子或溶质的跨膜运输。质膜ATPase在高等植物生命
活动中有主宰酶 (masterenzyme)之称。Hogdes等
(1972)证明应用蔗糖梯度离心得到的原生质膜制剂
存在ATPase活性，从此开始了探索高等植物细胞
ATPase的分子特性。H+-ATPase是质膜和液泡上的
一种H+泵，维持质膜的Na+浓度(Brunaetal.,1986)。
盐处理激活V型H+-ATPase的活性，促进H+
泵入液泡，在液泡膜两侧建立电化学梯度。这种激活
包括:亚基成分变化、酶活性提高、蛋白质丰度增加、
转录增强 (DoPont,1992)。水稻质膜H+-ATP酶(plas
mamembraneH+-ATPase)陆续克隆了多个，Zhang等
(1999)从日本晴中克隆了水稻质膜H+-ATP酶OSA3
基因，NaCl的盐处理下OSA3基因及突变体与盐逆
境有应答关系。但是在盐碱逆境下的研究还未见报
分子植物育种
MolecularPlantBreeding
道。本研究选取水稻PM-H+-ATPase基因，进行了转
基因拟南芥研究并分析其与盐碱胁迫的相关性。
1材料与方法
1.1材料
水稻种子消毒、灭菌后30℃恒温培养24h，选择
萌动的种子播种到5cm×7cm的花盆中，ZP人工
智能气候培养箱，光照12h/d，温度为26℃。苗培养
10d后，取样液氮速冻保存于-80℃冰箱中。
拟南芥(Arabidopsisthaliana,ecotype:columbia)种
子由上海植生所提供。
EXTaqTM、限制性内切酶、T4DNA连接酶、卡那
霉素(Kana)均购自Takara公司。ReverTraAce-αTM购
伊事达公司。其它为国产分析纯试剂。
1.2引物设计与合成
通 过 GenBank登 录 的 水 稻 PM-H+-ATPase
(GenBankAccessionNo.D10207)全长序列信息，利
用 PrimerPrimer5.0软件设计全长特异引物 P1：
5-TTTCAGAGGTGTGGGAGGTC-3；P2：5-GCT-
GAGAGGAGATAAAAACTA-3，引物由上海博亚
生物工程公司合成。
1.3PCR扩增、表达载体构建及DNA测序等基因操作
应用RT-PCR方法扩增目的基因，表达载体构建
及DNA测序等基因操作参照萨姆布鲁克等(2002)。
1.4PM-H+-ATPase基因对拟南芥植株的遗传转化
参照Bechtold和Peletier(1998)，对拟南芥进行转
基因及抗性植株筛选。将拟南芥培养到盛花期，植株倒
插入含有质粒pBI121-PM-H+-ATPase的农杆菌的工
作液中，-0.05MPa渗透入15min。取出培养10d收获
种子，采用卡那霉素(Kana)50mg·L-1选择压筛选。
1.5PCR检测方法
PCR检测方法参照闫新甫(2003)。PCR引物P3：
5-CATCAGTATTAAGCTGGGG-3，P4：5-GTGAA
CCTCTTGAATACCAG-3，由上海博亚生物工程公
司合成。
1.6拟南芥基因组DNA分离
拟南芥基因组DNA分离采用CTAB法，方法参
照萨姆布鲁克等(2002)。
1.7Northern杂交
Northern杂交检测参照闫新甫(2003)。
1.8转PM-H+-ATPase基因拟南芥植株抗盐碱性分析
T3代 (纯合体)转基因株系Th-2及对照种子在50
mg/LKana+MS培养基上发芽并生长至7d，取同样大小
转基因株系Th-2及对照幼苗移接到带有不同浓度、不同
种类盐(NaCl、NaHCO3)的培养基上生长20d，含盐培养基
参照管清杰(2007)，调查植物的生长、发育情况。盐碱浓度
梯度为：5mmol/L、8mmol/L、10mmol/L、15mmol/L的
NaHCO3；50mmol/L、80mmol/L、100mmol/L、150mmol/L
的NaCl。
2结果与分析
2.1水稻 PM-H+-ATPase基因 cDNA获得及其植物
表达载体构建
用Biozol一步法制备水稻总RNA，以此总RNA
为模板，反转录合成水稻FirstStrandcDNA。以此
cDNA为模板，以特异P1、P2引物PCR扩增得水稻
PM-H+-ATPase基因cDNA片段，并插入pMD18-T
载体。经测序，结果与GenBank登录的PM-H+-AT-
Pase核苷酸序列相同。
用 BamHⅠ、SacⅠ双酶酶切处理、并把水稻
PM-H+-ATPase基因 cDNA片段插入到植物表达载
体 (pBI121)，得重组质粒DNA(pBI121-PM-H+-AT-
Pase)，经测序插入的PM-H+-ATPase基因cDNA核
苷酸序列正确。电转化pBI121-PM-H+-ATPase重组
质粒 DNA入农杆菌 (EHA105)，得带有质粒
pBI121-PM-H+-ATPase的农杆菌工程菌株。
2.2转基因拟南芥的筛选及分子检测
采用真空渗透法(BechtoldandPeletier,1998)对
拟南芥遗传转化，得T1代种子。对T1代拟南芥种子
进行转基因卡那霉素抗性筛选，得35株抗性植株，
部分结果如图1，箭头所指为抗性植株。
图1T1代Kana抗性筛选
注:箭头所指为卡那抗性植株
Figure1ScreeningT1generationkanamycinresistantplants
Note:Thearowdenoteskanamycinresistantplants
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水稻质膜H+-ATPase基因对拟南芥遗传转化及其抗盐性分析
ArabidopsisOverexpressingRicePlamsaMembraneH+-ATPaseGeneandAnalysisofitsSaltTolerance
T1代抗性植株继代培育并进行卡那霉素抗性筛
选，得T3代(纯合体)转基因株系。CTAB法提取拟南
芥抗性植株T3代及野生型(WT)植株基因组 DNA，
以此为模板，P3、P4为引物、进行PCR扩增检测。结
果表明35株均呈阳性，部分结果如图2。WT植株未
扩增出600bp目的带；阳性对照CK+和6个T3代抗
性植株均扩增出600bp左右目的带。结果表明水稻
PM-H+-ATPase基因已整合到拟南芥植株上。
为了了解整合到拟南芥中PM-H+-ATPase基因
表达情况，我们进行了不同转基因株系拟南芥植株
Northernblot分析。结果表明WT植株无信号，而转
基因植株均有信号。图3为6个转基因株系(Th-2、
3、5、6、8、10)的 Northernblot结果。这表明水稻
PM-H+-ATPase基因在mRNA水平已过量表达。
2.3转水稻PM-H+-ATPase基因拟南芥植株抗盐碱
性分析
取转基因纯合体(T3代)进行抗盐性分析。结果表
明：8mmol/L、10mmol/LNaHCO3胁迫下转基因植物
根系伸长量同野生型植株相比差异不显著 (图4A,
B)，但株高及发育表现出显著的胁迫差异，转基因植
株受胁迫30d后开花，野生型植株受盐碱抑制不能
开花。在80mmol/L、100mmol/LNaCl胁迫下转基因
植株根系和株高伸长量明显高于野生型植株 (图4C,
D)，并且在80mmol/LNaCl胁迫下转基因植株受胁
迫30d后开花，而野生型植株受盐抑制不开花。而在
150mmol/L以上 NaCl盐胁迫及 15mmol/L以上
NaHCO3盐碱胁迫下，转基因植物及野生型植物生
长、发育均受到严重抑制，无明显差异。这些结果表明
一定浓度的盐(NaCl)及盐碱(NaHCO3)逆境时，转基因
植株与野生型植株生长、发育表现出显著差异。
为了验证转基因植物对盐碱逆境耐受性，我们进
一步对转基因植物在8mmol/L、10mmol/LNaHCO3、
80mmol/LNaCl和100mmol/LNaCl盐逆境下根长
和株高进行了统计，结果如图4E和4F。转基因植物
在8mmol/L、10mmol/LNaHCO3逆境下根生长与野
生型相比，差异不显著，但株高生长明显要好于野生
型；在NaCl逆境下转基因植物根生长明显强于野生
型，株高生长差异不显著。
3讨论
本文通过 RT-PCR扩增得到 PM-H+-ATPase基
因及其构建植物表达载体、获得转基因拟南芥并对转
基因植物进行了抗盐性分析。混合盐碱胁迫包括由总
盐浓度决定的盐胁迫和由pH决定的碱胁迫 (李玉明
等,2002)。植物在盐碱环境下生长时,因渗透胁迫而
导致活性氧的生成、脂质过氧化和生理代谢的变化，
最终生长受到抑制 (赵可夫,1993)。植物细胞质膜
H+-ATPase与跨膜的物质运输、细胞内外pH值以及
细胞膨压等生理生化过程密切相关。过量水稻
PM-H+-ATPase基因转基因拟南芥对盐(NaCl)及盐碱
(NaHCO3)胁迫表现出明显不同于野生型的耐盐性，我
们推测是PM-H+-ATPase基因的超量表达提高了植
物的跨膜物质运输能力，或减轻了脂质过氧化和生理
代谢的变化。从而表现出转基因植株在NaHCO3盐碱
胁迫明显先于野生型植株开花。这同王宝山和邹琦
(2000)研究结果相符。转基因植物提前开花，是对逆境
胁迫的一种适应，提前开花避免长期胁迫，早开花早
结实，以利于遗传下去。因此，植物耐盐碱能力与
PM-H+-ATPase基因有一定的相关性，但是，PM-H+-
ATPase基因以何种生理方式提高植物耐盐或耐盐碱
能力有待进一步深入研究。
参考文献
ArechagaI.,andJonesP.C.,2001,Quickguide:ATPsynthase,
Cur.Biol.,11(4):117-123
BechtoldN.,andPeletierG.,1998,InplantaAgrobacterium-me-
图3T3代转基因株系Northern分析
注:WT:野生型植株;Th-2,3,5,6,8,10:T3代转基因株系
Figure3Northernblotanalysisoftransgeniclines
Note:WT:Wild-typeplant;Th-2,3,5,6,8,10:sixindependentT3
generationtransgeniclines
图2T3代转基因植株PCR检测
注:M:Marker;Ck+:阳性对照;Ck-:阴性对照;1~6:转基因植株
Figure2PCRanalysisofT3generationtransgenicplants
Note:M:Marker;Ck+:Positivecontrol;Ck-:Negativecontrol;
1~6:Transgenicplants
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分子植物育种
MolecularPlantBreeding
图4转基因植物Th-2株系抗盐性分析
注:WT:野生型;Th-2:转基因株系;A:MS+8mmol/LNaHCO3;B:MS+10mmol/LNaHCO3胁迫;C:MS+80mmol/LNaCl胁
迫;D:MS+100mmol/LNaCl胁迫;E:盐胁迫对WT与Th-2根长的影响(n=15);F:盐胁迫对WT与Th-2株高的影响(n=15)
Figure4AnalysisofsalttoleranceofTh-2transgenicline
Note:WT:Wild-type;Th-2:Transgenicline;A:MS+8mmol/LNaHCO3;B:MS+10mmol/LNaHCO3;C:MS+80mmol/LNaCl;
D:MS+100mmol/LNaCl;E:EfectofsaltsonrootgrowthofWTandTh-2transgenicline(n=15);F:Efectofsaltsonplanthigh-
nessofWTandTh-2transgenicline(n=15)
diatedtransformationofadultArabidopsisthalianaplantsby
vacuuminfiltration,MethodsMol.Biol.,82:259-266
BrunaY.,HassidimM.,LernerH.R.,andReinholdL.,1986,
StudiesonH+-translocationATPaseinplantsofvaryingre-
sistancetosalinity,PlantPhysiol.,81(4):1050-1056
DoPontF.M.,1992,Salt-inducedchangesiniontransport:regu-
lationofprimarypumpsandsecondayrytransporters,In:
ClarksonD.T.(ed.),Transportandreceptorproteinsofplant
membranes,PlenumPress,NewYork,USA,pp.91-100
GuanQ.J.,LuoQ.X.,XiaD.X.,LiY.W.,LiangH.,ZhangX.X.,
NishiuchiS.,TakanoT.,andLiuS.K.,2007,Expressionof
riceOsAPX1geneanditssalttoleranceintobacco,Fenzi
ZhiwuYuzhong(MolecularPlantBreeding),5(1):1-7(管
清杰,罗秋香,夏德习,李耀文,梁涵,张欣欣,西内俊策,
高野哲夫,柳参奎,2007,水稻OsAPX1基因在烟草中的
表达及其抗盐性研究,分子植物育种,5(1):1-7)
HogdesT.K.,LeonardR.T.,BrackcrC.E.,andKeenanT.W.,
1972,Purificationofanion-stimulatedadenosinetriphos-
phatasefrom plantroots:associationwithplasmamem-
branes,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,69(11):3307-3311
LiY.M.,ShiD.C.,LiY.D.,andWangY.Q.,2002,Efectof
complexalkali-salinestressonsorghumseedlings,Zaliang
Zuowu(RainFedCrops),22(1):41-45(李玉明,石德成,李
毅丹,王岳琼,2002,混合盐碱胁迫对高粱幼苗的影响,杂
粮作物,22(1):41-45)
SambrookJ.,andRusselD.W.,eds.,HuangP.T.,WangJ.X.,
ZhuH.C.,ZhangZ.S.,ChenH.P.,FanM.,YuW.Y.,andHe
F.C.,trans.,2002,Molecularcloning:alaboratorymanual,
3rded.,SciencePress,Beijing,China,pp.461-509(萨姆布
鲁克J.,拉塞尔D.W.,编著,黄培堂,王嘉玺,朱厚初,张
兆山,陈慧鹏,范明,俞炜源,贺福初,译,2002,分子克隆
实验指南(第三版),科学出版社,中国,北京,pp.461-509)
WangB.S.,andZouQ.,2000,Advancesinthestudyonplasma
membrane-boundtranslocatingproteinsandtheirrelations
withsalttoleranceinplants,ZhiwuxueTongbao(Chinese
BuletinofBotany),17(1):17-26(王宝山,邹琦,2000,质
膜转运蛋白及其与植物耐盐性关系研究进展,植物学通
报,17(1):17-26)
YanX.P.,ed.,2003,Transgnicplants,SciencePress,Beijing,
China,pp.197-206(闫新甫,主编,2003,转基因植物,科学
出版社,中国,北京,pp.197-206)
ZhangJ.S.,XieC.,LiZ.Y.,andChenS.Y.,1999,Expressionof
theplasmamembraneH+-ATPasegeneinresponsetosalt
stressinaricesalt-tolerantmutantanditsoriginalvariety,
Theor.Appl.Genet.,99(6):1006-1011
ZhaoK.F.,1993,Plantanti-salt-physiology,SciencePress,Bei-
jing,China,pp.15-16(赵可夫,1993,植物抗盐生理,科学
出版社,中国,北京,pp.15-16)
454