全 文 ：中国农业科学 2012,45(13):2561-2567
Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2012.13.001

收稿日期：2012-02-02；接受日期：2012-03-20
基金项目：国家自然科学基金（31071401）、安徽省优秀青年基金（10040606Y03）、科技部“863”抗逆优质高产水稻分子育种与品种创制（2012AA101102）
联系方式：倪大虎，E-mail：dahuni1974@yahoo.com.cn。通信作者杨剑波，E-mail：yjianbo@263.net



水稻闭花授粉基因 cl7(t)的遗传分析与基因定位
倪大虎 1,2，杨亚春 2，宋丰顺 2，倪金龙 2，李 莉 2，杨剑波 2
（1 中国科学院技术与农业工程研究所，合肥 230031；2 安徽省农业科学院水稻研究所，合肥 230031）

摘要：【目的】鉴定、遗传分析和定位水稻闭花授粉突变体新基因，了解水稻开花机理，利用闭花授粉基因
防止转基因作物花粉漂移。【方法】通过 EMS 对优良粳稻品种 H02 进行诱变，发现了一个新的闭花授粉突变体 8m30。
利用突变体 8m30 与正常开花授粉材料广恢 102 配制的杂交种和相应的自交分离群体，采用形态特征观察、杂交后
代的表型分离统计和遗传分析、基于图位克隆的基因定位等技术方法，对突变体 8m30 的表型、遗传和基因定位进
行研究。【结果】突变体 8m30 与野生型 H02 相比，株高变矮，株型变紧，穗着粒密，在整个抽穗授粉过程中，颖
花不张开。遗传分析表明该突变性状受 1 对隐性核基因控制，位于第 7 染色体长臂的 RM21964 和 RM234 之间，遗
传距离分别为 0.1 cM 和 0.3 cM，两者间的物理距离为 160 kb，与标记 RM21971 共分离，是一个尚未报道的基因，
暂命名为 cl7(t) （Cleistogamy 7 (t)）。【结论】水稻闭花授粉突变体 8m30 由位于第 7 染色体１对隐性核基因
控制，位于第 7染色体的 RM21964 和 RM234 之间 160 kb 范围内。
关键词：水稻（Oryza sativa L.）；闭花授粉；遗传分析；基因定位

Genetic Analysis and Mapping of Novel Cleistogamy
Gene, cl7(t) in Rice
NI Da-hu1,2, YANG Ya-chun2, SONG Feng-shun2, NI Jin-long2, LI Li2, YANG Jian-bo2
(1 Institute of Technical Biology and Agricultrue Engineering, Chinese Academy of Sciences, Hefei 230031; 2 Rice Research Institute,
Anhui Academy of Agricultural Sciences, Hefei 230031)

Abstract: 【Objective】 Identification, genetic analysis and mapping of novel cleistogamy genes in rice would play an
important role in understanding the molecular genetic mechanisms of floral development. At the same time, the cleistogamy is an
ideal strategy to prevent pollen explosion in transgenic rice. 【Method】 A rice cleistogamy mutant 8m30 with japonica cultivar H02
background was isolated in M2 population treated with 0.5% EMS (Ethane Methyl Sulfonare). Phenotypic study, genetic analysis and
gene mapping by map-based cloning were conducted with the population from F1 of 8m30 and Guanghui102 and its self-cross
progenies.【Result】The mutant with lower plant height, compatible plant style and closed paleas at flowering stage. Genetic analysis
indicated that the mutant was controlled by a single recessive nuclear gene. The cleistogamy locus was mapped on the long arm of
chromosome 7 between the microsatellite markers RM21964 and RM234 with 0.1 cM and 0.3 cM genetic distance, about 160 kb of
the physical distance and cosegregated with RM21971, which suggests the mutant locus be novel allele and is tentatively named cl7(t)
(Cleistogamy 7 (t)). 【Conclusion】 The 8m30 mutant is controlled by a recessive nuclear gene, which is located on chromosome7
between RM21964 and RM234 with physical distance of 160 kb.
Key words: rice (Oryza sativa L.); cleistogamy; genetic analysis; gene mapping

2562 中 国 农 业 科 学 45 卷
0 引言
【研究意义】闭花授粉是花器官发育的一种变
态，在燕麦[1]、高粱[2]、大麦[3]、小麦[4]、水稻[5]等多
种作物中均有发现。闭花授粉的颖花不张开，花药不
能外露，花粉不会向外传播。在不影响其它农艺性状
的前提下，培育具有闭花授粉特性的转基因新品种是
抑制基因漂流、减少环境风险的一种理想策略[6-7]。【前
人研究进展】目前普遍认为双子叶植物花器官发育的
ABCDE 模型[8]也基本适用于单子叶植物水稻。在水稻
中，A 类基因[9-10]包括 RAP1A（rice apetalal gene A）、
RAP1B（rice apetala l gene B)；B 类基因[9-12]包括
OsMADS2、OsMADS4 和 SPW1（superwoman1）；C
类基因包括 RAG（rice agamous）[13]、OsMADS3[14]和
DL（drooping leaf）[15]；D 类基因 OsMADS13[15]以及
E 类基因 LHS（leafy hull sterile 1）[16]、OsMADS5、
OsMADS7 和 OsMADS8[17]。根据文献报导，在水稻中
目 前 已 发 现 3 种 类 型 闭 花 授 粉 突 变 体 ： d7
（ Heieidaikoku 或 Cleistoganous dwarf ） [5] 、 ld(t)
（lodiculeless spikelet）[18]和 spw1-cls（superwoman1-
cleistogamy）[19]。d7 突变体浆片发育正常，内颖和外
颖交界部分发生融合，虽然浆片能正常膨大，但内外颖
不能张开。ld(t)突变体内、外颖正常，但缺少浆片，致
使开花时内外颖不能被推开，ld(t)已定位在第一染色体
的末端[20]。spw1-cls 突变体是由于 SPW1[19]第 45 位氨
基酸发生错义突变，致使浆片发生变形，形成浆片-
颖片嵌合体，导致内外颖不能打开。【本研究切入点】
水稻的开花是一个复杂的过程，水稻开花的机理及其
调控途径尚不完全清楚。笔者对优良粳稻 H02 进行诱
变，获得了一个闭花授粉突变体 8m30，该闭花授粉突
变体的浆片、内外颖等花器官发育正常，与已报道的
闭花授粉突变体明显不同。【拟解决的关键问题】本
研究对该突变体进行形态学观察并对该突变体的基因
进行遗传定位研究，为该突变体及突变基因的应用奠
定基础。
1 材料与方法
1.1 植物材料
闭花授粉突变体 8m30 是利用 0.5%的 EMS 对粳
稻品种 H02 进行诱变获得的稳定变异株系。野生型品
种 H02（粳型）、广恢 102（偏粳型）为正常开花的
水稻品种。突变体和野生型品种于 2010 年 5 月种植于
安徽省农业科学院试验农场。
1.2 突变体的表型观察
2009 年 5 月，野生型 H02 和突变体 8m30 同时种
植于安徽省农业科学院试验农场，抽穗期间，上午
9：00 取未受粉的小花，除去 1/2 内外颖，在显微镜下
观察花器官结构。在晴日下午 14：00，观察开花刚结
束的穗部性状。成熟后，测量并统计株高、单株穗数、
穗长、每穗总粒数、结实率和谷粒长、宽等农艺性状。
样本统计数为 15 株。
1.3 遗传群体的构建与分析
以突变体 8m30 为母本与广恢 102 进行杂交，收
获 F1 种子，种植后得到 F2 分离群体。抽穗期间，中
午 14：00—15：00 单株调查开花习性，统计 F2群体
中突变体表型株和野生型表型株的数量，经 χ2测验明
确分离比例。
1.4 水稻 DNA 提取和 PCR 检测
采用 SDS 法提取各单株叶片总 DNA[21]。挑选能平
均覆盖水稻全基因组的400对SSR引物根据已发表的序
列进行引物合成（http:www.gramene.org/microsat/ssr.
html），PCR 反应体系参照曾生元等[22]进行。
1.5 突变基因连锁分析
选取典型闭花性状和正常开花的单株各 10 株提
取 DNA，分别等量混合突变株和正常株的 DNA，形
成按表型区分的突变池和正常池。
首先利用平均覆盖全基因组的 400 对 SSR引物对
突变型和野生型双亲进行多态性分析，筛选出亲本间
表现多态性的标记，利用双亲间表现多态性的标记分
析两池间的多态性（BSA 法）[23]，找出可能与闭花基
因连锁的标记，用亲本间和基因池间均具有多态性的
连锁标记对 F2群体中的闭花授粉单株进行分析定位。
根据 SSR 分析的结果，用 MAPMAKER3.0 软件进行
突变位点与标记间的连锁分析，利用 Kosambi 函数将
重组率转化为遗传距离（centiMorgan，cM）。
2 结果
2.1 闭花突变体的表型特征与农艺性状
8m30 突变体植株抽穗后，内外颖始终闭合，不开
张（图 1-a），检查小花的内外颖，没有发现融合现象。
将突变体未受精的小花顶端剪去 1/4 后，小花的花丝能
正常伸长。在显微镜下观察花器官结构，突变体的浆片、
柱头、花丝和花药均没有发现结构变异（图 1-b）。但
农艺性状出现了较大的改变，与野生型相比，株高变矮，
株型变紧，叶片变厚，且短而挺立，穗着粒密而较直立，
籽粒长宽比变小，千粒重降低，结实率变差（表 1）。
13 期 倪大虎等：水稻闭花授粉基因 cl7(t)的遗传分析与基因定位 2563
表 1 突变体与野生型农艺性状比较
Table 1 Agronomic comparison between wild type and mutant
株系
Line
株高
Plant height
(cm)
穗数
Effective panicle
per plant
穗长
Panicle length
(cm)
总粒数
Total grains
per panicle
着粒密度
Grain dense per panicle
(grain No./cm)
结实率
Seed setting
rate (%)
千粒重
1000-grain
weight (g)
粒长
Grain length
(mm)
粒宽
Grain width
(mm)
H02 110.0±0.40 5.0±0.20 18.3±0.10 162.8±1.10 8.90±0.10 83.67±0.40 23.68±0.10 6.90±0.00 3.85±0.00
8m30 86.0±0.30 5.0±0.10 12.2±0.10 136.2±0.80 11.18±0.10 49.48±0.30 20.67±0.00 5.59±0.00 4.29±0.00



a：野生型（右）与突变型（左）的穗部表型；b：野生型（左）与突变型（右）的花器官结构。l：外稃；p：内稃；an：花药；f：花丝；st：柱头；
o：子房；lo：浆片；g：护颖。标尺=1.00 mm
a: Panicle phenotype of the wild type (right) and mutant(left); b: Comparison of floral organs between wild type (left) and mutant (right). l: Lemma; p: Palea; an:
Anther; f: Filaments; st: Stigma; o: Ovary; lo: Lodicules; g: Glume. Bar=1.00 mm

图 1 野生型和突变体穗及颖花的特征
Fig.1 Panicles and dehulled spikelets of the wild type and mutant

2.2 闭花突变体 8m30 的遗传分析
以突变体 8m30 为母本与广恢 102 杂交构建了
8m30/广恢 102 的 F1 和自交 F2 分离群体，考察了 F1
植株、F2 分离群体的开花习性和农艺性状。结果表
明，F1 植株开花正常，内外颖能正常张开，花药外
露，株型偏散、穗弯垂。F2 群体中出现目标性状分
离，分别表现为正常开花授粉和闭花授粉。其中正
常开花植株为 455，闭花授粉植株为 128，正常植株
与突变植株比例接近 3﹕1（χ2=2.72＜χ20.05=3.84）。
表明该闭花授粉突变体表型由 1 对隐性核基因控
制，初步命名为 cl7(t)。F2 群体中，不论是正常授粉
单株还是闭花授粉单株，株高变化都比较大；但正
常授粉植株的农艺性状与 F1 相似；而闭花授粉植株
的表现为株型紧凑、叶片变厚、且短而挺立、着粒
密、穗直立、籽粒长宽比变小等特征，与突变体农
艺性状相似。
2.3 闭花基因 8m30 的初步定位
利用均匀覆盖水稻基因组的 400 对 SSR 标记，以
2564 中 国 农 业 科 学 45 卷
8m30/广恢 102 F2群体作为定位群体，对双亲以及BSA
法构建的突变池和正常池进行多态性分析，在双亲间
表现多态性的 73个标记中，RM505、RM234、RM5426、
RM5455 在两池间也表现出多态性，据此分析，控制
闭花性状的基因位于第 7 染色体。根据网站
（http:www.gramene.org/microsat/ssr.html）公布的 SSR
序列，合成位于第 7 染色体相应区段的 SSR 引物，并
在两池间进行筛选，引物 RM5623、RM5508、RM132、
RM6420、RM21945、RM364、RM3555 表现多态性。
进一步利用在两亲本和基因池间均表现多态的 13 个
标记，对 F2群体的 128 个闭花授粉单株进行逐一分析
（图 2），RM21945、RM234 与闭花授粉性状紧密连
锁，分别有 7 和 6 个交换。根据网上公布的 SSR 引物
序列，在 RM21945 和 RM234 之间合成多态性引物
RM21964 和 RM21971，将基因所在区域进一步缩小
（图 3），最终将控制该闭花性状的基因定位在
RM21964 和 RM234 之间，与两标记的遗传距离分别
为 0.1 cM 和 0.3 cM，物理距离约为 160 kb，标记
RM21971 与闭花性状共分离。RM21964 与 RM234 两
个标记间有 2 个部分重叠的 BAC 克隆 AP005198 和
AP004988。
根据日本晴基因组注释，在 RM21964 与 RM234
之间，有 21 个候选基因，可分为三类（表 2），一类
是 编 码 未 知 蛋 白 ， 包 括 LOC-Os07g42410 、
LOC-Os07g42430、LOC-Os07g42470、LOC-Os07g42550
和 LOC-Os07g42560；一类为编码转录蛋白，包括
LOC-Os07g42400、LOC-Os07g42460、LOC-Os07g42530
和 LOC-Os07g42540；一类为编码其它功能蛋白，包括
LOC-Os07g42370、LOC-Os07g42500、LOC-Os07g42380、
LOC-Os07g42395、LOC-Os07g42390、LOC-Os07g42420、
LOC-Os07g42440、LOC-Os07g42450、LOC-Os07g42490、
LOC-Os07g42510、LOC-OS07G42520和LOC-Os07g42570。
控制突变体 8m30 闭花授精属哪一类蛋白，还有待于
精细定位和克隆后进一步验证。

P1 P2


P1：突变体 8m30；P2：广恢 102；其它泳道为 F2 分离群体中闭花单株，箭头所指为单交换单株
P1: Mutant 8m30; P2: Guanghui102; Other lanes are some mutants from the F2 population; The arrows show single exchange between mutant and wild type
图 2 cl7(t)连锁分析（RM234）
Fig.2 Linkage analysis (RM234) of cl7(t)


A：标记；B：遗传距离（cM）；C：物理距离 A: Marker; B: Genetic distance (cM); C: Physical distance
图 3 cl7(t)在第 7 染色体上的定位
Fig.3 Mapping of cl7(t) on rice chromosome 7
13 期 倪大虎等：水稻闭花授粉基因 cl7(t)的遗传分析与基因定位 2565
表 2 基因预测及在染色体上的位置
Table 2 Predicted genes and the location on chromosome 7
预测基因
Predicted gene
编码产物
Encoding product
位置
Location (bp)
LOC-Os07g42410 未知蛋白 Unknown protein (+)25381698—25389547
LOC-Os07g42430 未知蛋白 Unknown protein (+)25404280—25405952
LOC-Os07g42470 未知蛋白 Unknown protein (+)25423241—25425365
LOC-Os07g42550 未知蛋白 Unknown protein (-)25458460—25459671
LOC-Os07g42560 未知蛋白 Unknown protein (-)25466051—25467726
LOC-Os07g42400 转运蛋白 Transposon protein, putative, unclassified, expressed (+)25371994—25376165
LOC-Os07g42460 转运蛋白 Transposon protein, putative, unclassified, expressed (-)25418275—25421409
LOC-Os07g42530 转运蛋白 Transposon protein, putative, unclassified, expressed (+)25449405—25455175
LOC-Os07g42540 转运蛋白 Transposon protein, putative, unclassified, expressed (+)25456839—25457923
LOC-Os07g42370 锌指蛋白 Zinc-finger protein, putative ,expressed (+)25347985—25351810
LOC-Os07g42380 RNA 识别功能域蛋白 RNA recognition motif containing protein , putative ,expressed (+)25357841—25362767
LOC-Os07g42390 DUF581 结构域蛋白 DUF581 domain containing protein,expressed (-)25363519—25365553
LOC-Os07g42395 DNA 指导 RNA 合成酶 II 亚基 RPB9 DNA-directed RNA polymerase IIsubunit RPB9, putative, expressed (-)25369221—25371856
LOC-Os07g42420 3-羰酰基合成酶 3-oxoacyl-synthase, putative, expressed (-)25392943—25398603
LOC-Os07g42440 羟基酸氧化酶 1 Hydroxyacid oxidase 1, putative,expressed (+)25408332—25413871
LOC-Os07g42450 核糖体蛋白 S2 Ribosomal protein S2, putative, expressed (-)25413427—25415686
LOC-Os07g42490 蔗糖合成酶 Sucrose synthase, putative, expressed (+)25429639—25435182
LOC-Os07g42500 FYVE 锌指结构域蛋白 FYVE zinc finger domain containing protein, expressed (+)25435731—25439801
LOC-Os07g42510 AP2 结构域昼白 AP2 domain containing protein, expressed (-)25440818—25442695
LOC-OS07G42520 DIR 基因编码蛋白 Dirigent, putative, expressed (+)25446542—25447385
LOC-Os07g42570 DIR 基因编码蛋白 Dirigent, putative, expressed (+)25469551—25470120
+：正义链；-：负义链 +: Positive chain;-: Negative chain

3 讨论
水稻是强自花粉授粉作物，但开花期间，花丝伸
长，花药外露，花粉向周围环境传播，仍可造成一定
的异交结实[24]。对于转基因水稻而言，转入的基因可
以随水稻的花粉向其它品种或水稻近缘种漂移，造成
环境污染[25]。基因漂流及其可能引起的环境后果已成
为人们关注焦点之一[26]。现有技术如距离和花期隔
离、物理屏障等只能限制或减少基因漂流，并不能从
根本上解决基因漂流的问题。利用生物学限控措施防
止基因漂流已成为国际研究的热点。目前提出的生
物学限控措施包括雄性不育[27-28]、种子不育[29-30]、
闭花受精 [5,18-19]、无融合生殖 [31-32]、基因拆分 [33-34]
和基因删除[35-36]等。雄性不育和种子不育不适用于以
有性生殖方式繁殖的作物；基因拆分和基因删除目前
只在烟草上得到验证；无融合生殖虽然是植物界中广
泛存在的不经正常受精作用而产生种子的一种特殊生
殖方式，但在水稻中的应用还未取得实质性进展。闭
花受精是在花朵未开放时成熟花粉粒在花粉囊内萌
发，花粉管穿出花粉囊，伸向柱头，进入子房，把精
子送入胚囊，完成受精。闭花受精能使植物避免外来
花粉干扰而保持纯种[37]，因此，闭花受精是控制基因
漂流的理想方法。被子植物（60 个科约 300 种植物）
中广泛存在着闭花受精现象[38]。木豆（pigeonpea）[37]、
硬粒小麦 [39]的闭花受精受单个隐性基因控制。
Turuspekov 等[7]报道，大麦中紧密连锁的 2 个基因 cly1
和 cly2 控制闭花受精。
在已报道的水稻闭花授粉突变体中，花器官发生
变异是导致闭花授粉的主要原因。Nagao 等[5]报道的
d7 使外稃和内稃融合，致使花药不外露，d7 基因已定
位于第 7 染色体。突变体 CL-SNU 是由于浆片缺失，
导致开花时内外颖不能张开，控制 CL-SNU 突变体闭
花基因定位于第 1 染色体[18,20]；Yoshida 等[19]利用错
义突变的方法得到一个 B 类型 MADS-box 基因
SUPERWOMAN1（SPW1）突变的突变体。本研究利
用 EMS 处理粳稻品种 H02 获得一个闭花突变体
2566 中 国 农 业 科 学 45 卷
8m30，该突变体的内外颖、浆片、子房、柱头、花丝、
花药等花器官发育正常，没有发现缺失或变异，结构
与野生型没有明显差异，与已报导的水稻闭花基因
d7[5]，ld(t)（lodiculeless spikelet）[18,20]和 spw1-cls[19]
的表现不相同，推测该突变体闭花授粉性状是由新
的位点突变引起。本研究初步定位结果表明，cl7(t)
位于第 7 染色体，与 Nagao 等[5]报道的 d7 位于同一
染色体，但两者表型有明显不同，d7 的内外颖发生
融合，尽管开花时浆片膨大，内外颖仍不能张开，
而 cl7(t)的内外颖没有发生融合现象。由于 d7 的定
位或克隆相关信息未见报导，所以二者是否是同一
基因仍需进一步研究。值得注意的是，与野生型 H02
相比，突变体 8m30 除表现闭花性状外，同时引起
株型变紧、穗长变短且直立，籽粒长宽比变小等农
艺性状的变化，推测 cl7(t)基因可能影响到细胞的
增殖或细胞的大小，使突变体的细胞数量减少或者
细胞变小，引起株型、穗型、籽粒等性状的改变。
当然，其真相还需进一步精细定位、基因克隆及功
能分析验证，这一工作正在进行之中。
4 结论
通过 EMS 对优良粳稻品种 H02 进行诱变，获得
一个新的闭花授粉突变体 8m30，该突变体与野生型相
比，株高变矮、穗长变短、籽粒变小。遗传分析表明，
该突变体受1对隐性核基因控制，位于第7染色体SSR
标记 RM21964 和 RM234 之间的 160 kb 范围内，与
RM21971 共分离。

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（责任编辑 李 莉）