全 文 ：第４２卷　第４期
２０１４年４月
西北农林科技大学学报（自然科学版）
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ　Ａ＆Ｆ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔ．Ｓｃｉ．Ｅｄ．）
Ｖｏｌ．４２ Ｎｏ．４
Ａｐｒ．２０１４
网络出版时间：２０１４－０３－２６　１７：０９ ＤＯＩ：１０．１３２０７／ｊ．ｃｎｋｉ．ｊｎｗａｆｕ．２０１４．０４．０２９
网络出版地址：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｏｉ／１０．１３２０７／ｊ．ｃｎｋｉ．ｊｎｗａｆｕ．２０１４．０４．０２９．ｈｔｍｌ
拟南芥ｘｔｃ１突变体的图位克隆分析
　［收稿日期］　２０１３－０４－０７
　［基金项目］　西北农林科技大学引进人才启动基金项目（Ｚ１ｈ１０２０８２２）
　［作者简介］　蒋　琦（１９８３－），男，陕西西安人，在读硕士，主要从事植物生化与分子生物学研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｊｉａｎｇｑｉ－１＠１６３．ｃｏｍ
　［通信作者］　王　倩（１９８１－），女，河北唐山人，在读博士，讲师，主要从事植物重要功能基因研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｒａｍｅｓｅ１０２１＠１２６．ｃｏｍ
蒋　琦ａ，ｂ，王　倩ａ，ｂ
（西北农林科技大学ａ生命科学学院，ｂ旱区作物逆境生物学国家重点实验室，陕西 杨凌７１２１００）
［摘　要］　 【目的】分析拟南芥ｘｔｃ１突变体茎部表皮蜡的组分和含量，并鉴定导致ｘｔｃ１突变体表型的基因。
【方法】通过气相色谱法分析拟南芥ｘｔｃ１突变体与Ｌｅｒ野生型茎部表皮蜡的成分；利用图位克隆确定突变基因位点，
通过在拟南芥ｘｔｃ１突变体中过量表达ＦＡＴＢ基因，验证突变位点与ＦＡＴＢ基因的关系。【结果】拟南芥ｘｔｃ１突变体
茎部表皮蜡总量约为Ｌｅｒ野生型的１／３，且各组分含量均明显减少；将突变基因定位在第１染色体顶端物理距离为８０
ｋｂ的２个标记Ｔ２７Ｇ７－３和Ｆ２２Ｏ１３－１之间，该区域含有２１个基因。Ｔ－ＤＮＡ插入突变体观察及测序分析表明，ｘｔｃ１突
变体在Ａｔ１ｇ０８５１０（ＦＡＴＢ）基因的第１个外显子上产生１４个碱基的缺失，导致翻译提前终止；在ｘｔｃ１突变体中过量
表达ＦＡＴＢ基因可恢复ｘｔｃ１突变体的正常表型。【结论】拟南芥ｘｔｃ１突变体茎部表皮蜡含量减少，且突变基因为
ＦＡＴＢ基因。
［关键词］　表皮蜡；ＦＡＴＢ；图位克隆；拟南芥
［中图分类号］　Ｑ７８ ［文献标志码］　Ａ ［文章编号］　１６７１－９３８７（２０１４）０４－０２０１－０６
Ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｘｔｃ１　ｍｕｔａｎｔｓ
ＪＩＡＮＧ　Ｑｉ　ａ，ｂ，ＷＡＮＧ　Ｑｉａｎａ，ｂ
（ａＣｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｂ　Ｓｔａｔｅ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｃｒｏｐ　Ｓｔｒｅｓｓ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｆｏｒ　Ａｒｉｄ　Ａｒｅａｓ，
Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ　Ａ＆Ｆ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａｎｇｌｉｎｇ，Ｓｈａａｎｘｉ　７１２１００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：【Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ】Ｔｈｉｓ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ａｉｍｅｄ　ｔｏ　ｅｘａｍｉｎｅ　ｔｈｅ　ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｃｏｎｔｅｎｔｓ　ｏｆ
ｃｕｔｉｃｕｌａｒ　ｗａｘ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｓｔｅｍｓ　ｏｆ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｘｔｃ１ｍｕｔａｎｔ　ａｎｄ　ｉｄｅｎｔｉｆｙ　ｔｈｅ　ｍｕｔａｎｔ　ｇｅｎｅ　ｔｈａｔ　ｒｅｓｕｌｔｅｄ　ｉｎ　ｘｔｃ１
ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ．【Ｍｅｔｈｏｄ】Ｔｈｅ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｕｔｉｃｕｌａｒ　ｗａｘ　ｏｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｘｔｃ１ｍｕｔａｎｔ　ａｎｄ　ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ
Ｌｅｒ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｗｅｒｅ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ｂｙ　ｇａｓ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ．Ｔｈｅ　ｇｅｎｅ　ｌｏｃｉ　ｏｆ　ｍｕｔａｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ｐｏｓｉ－
ｔｉｏｎａｌ　ｃｌｏｎｉｎｇ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ＦＡＴＢｇｅｎｅ　ｗａｓ　ｏｖｅｒ－ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｘｔｃ１ｍｕｔａｎｔ　ｔｏ　ｅｘｐｌｏｒｅ　ｔｈｅ　ｒｅｌａｔｉｏｎ－
ｓｈｉｐ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｘｔｃ１ｌｏｃｉ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ＦＡＴＢｇｅｎｅ．【Ｒｅｓｕｌｔ】Ｔｏｔａｌ　ｗａｘ　ｌｏａｄ　ｏｎ　ｓｔｅｍｓ　ｏｆ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｘｔｃ１ｍｕ－
ｔａｎｔ　ｗａｓ　ａｒｏｕｎｄ　１／３ｏｆ　ｔｈａｔ　ｏｆ　ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ　Ｌｅｒ　ａｎｄ　ｅａｃｈ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｄｒａｍａｔｉｃａｌｙ　ｌｏｗｅｒ　ａｓ　ｗｅｌ．ｘｔｃ１ｗａｓ
ｌｏｃａｔｅｄ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｗｏ　ｍａｒｋｅｒｓ　ｗｉｔｈ　２１ｇｅｎｅｓ　ｗｉｔｈ　ａ　ｐｈｙｓｉｃａｌ　ｄｉｓｔａｎｃｅ　ｏｆ　８０ｋｂ（Ｔ２７Ｇ７－３ａｎｄ　Ｆ２２Ｏ１３－１）ｏｎ
ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　１．Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ　ｏｆ　Ｔ－ＤＮＡ　ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ　ｍｕｔａｎｔｓ　ａｎｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｒｅｖｅａｌｅｄ
ｔｈａｔ　ｘｔｃ１ｍｕｔａｎｔ　ｃａｒｒｉｅｄ　１４ｂｐ　ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｆｉｒｓｔ　ｅｘｏｎ　ｏｆ　Ａｔ１ｇ０８５１０（ＦＡＴＢ），ｗｈｉｃｈ　ｒｅｓｕｌｔｅｄ　ｉｎ　ａ　ｐｒｅ－
ｍａｔｕｒｅ　ｓｔｏｐ　ｃｏｄｏｎ．Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＦＡＴＢｇｅｎｅ　ｉｎ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｐｌａｎｔｓ　ｃｏｕｌｄ　ｒｅｓｃｕｅ　ｔｈｅ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ　ｏｆ　ｘｔｃ１
ｍｕｔａｎｔ．【Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ】ＦＡＴＢｇｅｎｅ　ｗａｓ　ｔｈｅ　ｍｕｔａｔｅｄ　ｇｅｎｅ　ｔｈａｔ　ｒｅｄｕｃｅｄ　ｗａｘ　ｌｏａｄ　ｏｎ　ｘｔｃ１ｓｔｅｍｓ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｃｕｔｉｃｕｌａｒ　ｗａｘ；ＦＡＴＢ；ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ　ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
　　表皮蜡覆盖在植物的地上器官表面［１］，对植物 的生长有一系列重要的保护作用，如：阻止植物表层
细胞水分蒸发，避免紫外线损伤［２］，减少叶片表面的
水分积累，减少灰尘、花粉及空气污染物的沉积［３］。
其在植物防御细菌、真菌侵害及植物与昆虫的相互
作用中也有重要作用［４－５］。其化学成分是能够被有
机溶剂萃取的混合物，主要包含链长为２０～３４碳的
超长链脂肪酸及其衍生物，如：醛、初级醇、次级醇、
烷烃、酮和酯类等［１］。
参与拟南芥表皮蜡合成、运输及调控的基因已
相继被克隆，如参与拟南芥超长链脂肪酸合成的酮
酯酰缩合酶（ＫＣＳ）的ＣＥＲ６、ＣＥＲ２家族［６－８］，酮酯酰
还原酶（ＫＣＲ）的 ＫＣＲ１与 ＫＣＲ２［９］，羟酯酰脱水酶
（ＨＣＤ）的 ＰＡＳ２［１０］，以及烯脂酰还原酶（ＥＣＲ）的
ＣＥＲ１０［１１］；参与拟南芥表皮蜡合成的酰基还原途径
的ＣＥＲ４和 ＷＳ［１２－１３］；参与拟南芥表皮蜡合成的脱
羧途径的ＣＥＲ１和ＣＥＲ３［１４－１５］；参与拟南芥表皮蜡
运输的ＡＢＣ转录蛋白ＣＥＲ５家族［１６－１７］；参与拟南芥
表皮蜡合成调控的组成外切体复合物的亚基蛋白
ＣＥＲ７［１８］。然而有关拟南芥表皮蜡合成、运输及调
控的许多问题仍未解决，如对参与拟南芥表皮蜡合
成的脱羧途径的ＣＥＲ１和ＣＥＲ３的具体生物学功能
尚不清楚。
Ｃｏｎｗａｙ等［１９］研究发现，用双环氧丁烷突变拟
南芥Ｌｅｒ野生型种子可以获得多出１对子叶的突变
体ｘｔｃ１，即第１对真叶转变为子叶；这对多出的子叶
比正常的子叶小，形状不规则，且含有许多在子叶细
胞中具备而正常真叶中没有的淀粉粒、蛋白体、脂类
体等；然而，ｘｔｃ１真叶子叶化表型具有可变的外显率
和表达性，即ｘｔｃ１／ｘｔｃ１植株后代中平均３０％具有
真叶子叶化表型；此外，ＸＴＣ１基因的突变对地上器
官具有多效性影响，比如ｘｔｃ１突变体的花瓣提前打
开，突变体茎表面比野生型更绿，说明ｘｔｃ１突变体
茎部的表皮蜡含量可能减少。推测ＸＴＣ１基因可
能参与脂类代谢，且特异地参与表皮蜡合成或运输。
因此，本研究鉴定了ｘｔｃ１突变体表皮蜡缺失表型，
并图位克隆导致ｘｔｃ１突变体表型的基因，旨在为深
入了解植物表皮蜡合成及运输提供资料。
１　材料与方法
１．１　材　料
１．１．１　植物材料　拟南芥 Ｃｏｌｕｍｂｉａ－０（Ｃｏｌ野生
型）和Ｌｅｒ野生型为本实验室所有，ｘｔｃ１突变体由
Ｄｒ．Ｐｏｅｔｈｉｇ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐａ－
ｓａｄｅｎａ）惠赠，Ｓａｌｋ－０２０８５６等２１个基因的 Ｔ－ＤＮＡ
插入拟南芥突变体从拟南芥生物资源中心（Ａｒａｂｉ－
ｄｏｐｓｉｓ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｒｅｓｏｕｒｃｅ　ｃｅｎｔｅｒ，ＡＢＲＣ）购得。
１．１．２　菌株和质粒　大肠杆菌 ＤＨ５α、农杆菌
ＭＰ９０、ｐＭＤ４００供体载体和ｐＭＤＣ３２目标载体均
为本实验室所有。
１．１．３　试　剂　ＰＣＲ高保真酶购自Ｔａｋａｒａ，质粒
提取试剂盒、ＤＮＡ片段纯化试剂盒购自北京博大泰
克，Ｇａｔｅｗａｙ　ＢＰ　ＣｌｏｎａｓｅＴＭＥｎｚｙｍｅ　Ｍｉｘ和Ｇａｔｅｗａｙ
ＬＲ　ＣｌｏｎａｓｅＴＭ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｍｉｘ试剂盒购于Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
公司，其他试剂均为国产。
１．２　植物培养
将悬浮于１ｇ／Ｌ琼脂糖中的拟南芥Ｌｅｒ野生
型、Ｃｏｌ野生型、ｘｔｃ１突变体和其他２１种Ｔ－ＤＮＡ插
入突变体种子于４℃放置３ｄ，取出种子置于黑土和
蛭石（体积比１∶１）的混合土中，覆盖塑料膜以保
湿，２０℃光照培养箱培养（每天１６ｈ光照），至抽苔
时去掉塑料膜。
１．３　植物转化
按照 Ｇａｔｅｗａｙ　ＢＰ　ＣｌｏｎａｓｅＴＭ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｍｉｘ和
Ｇａｔｅｗａｙ　ＬＲ　ＣｌｏｎａｓｅＴＭ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｍｉｘ试剂盒说明，
构建入门载体和目标载体ｐＭＤＣ３２－３５Ｓ－ＦＡＴＢ。使
用蘸花法转化ｐＭＤＣ３２－３５Ｓ－ＦＡＴＢ质粒到ｘｔｃ１突
变体中［２０］，待蘸花植株的种子成熟后，收获种子，用
含７５μｇ／ｍＬ潮霉素的 ＭＳ培养基筛选，得到过量
表达ＦＡＴＢ的转基因植株。
１．４　表皮蜡的提取与分析
将拟南芥 Ｌｅｒ野生型、ｘｔｃ１突变体和ｘｔｃ１－
ＦＡＴＢ 转基因植株的茎分别浸泡在 ５ ｍＬ 含１
μｇ／μＬ　Ｃ２４烷烃的三氯甲烷中３０ｓ，用氮气干燥浓
缩后转入气相色谱分析管中，加１０μＬ　Ｎ，Ｏ－三氟乙
酰胺和１０μＬ吡啶，于７０℃加热１ｈ，氮气干燥，加
入１００μＬ三氯甲烷，进行气相色谱－氢焰离子（ＧＣ－
ＦＩＤ）和气相色谱－质谱（ＧＣ－ＭＳ）分析。
１．５　ＤＮＡ提取及ＰＣＲ检测
采用 ＣＴＡＢ 法［２１］提取拟南芥ｘｔｃ１突变体、
ｘｔｃ１突变体与Ｃｏｌ野生型杂交经鉴定的Ｆ２ 代植株
和Ｌｅｒ野生型植株叶片的基因组ＤＮＡ。ＰＣＲ扩增
体系为：２×ＰＣＲ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｍｉｘ　１０μＬ （含 １００
ｍｍｏｌ／Ｌ　ＫＣｌ、２０ ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、３ ｍｍｏｌ／Ｌ
ＭｇＣｌ２、４００ｍｍｏｌ／Ｌ　ｄＮＴＰ），Ｔａｑ　ＤＮＡ 聚合酶（５
Ｕ／μＬ）０．２μＬ，引物（１０μｍｏｌ／Ｌ）各１μＬ，模板
ＤＮＡ　１μＬ，ｄｄＨ２Ｏ补至２０μＬ。反应条件为：９４℃
预变性５ｍｉｎ；９４℃变性３０ｓ，５５℃退火３０ｓ，７２℃
延伸３０ｓ，３５个循环；７２℃延伸７ｍｉｎ，扩增产物经
２０～４０ｇ／Ｌ琼脂糖电泳，ＥＢ染色，ＢＩＯＲＡＤ凝胶成
２０２ 西北农林科技大学学报（自然科学版） 第４２卷
像系统观察、照相、读带。
１．６　图位克隆
ｘｔｃ１突变体与Ｃｏｌ野生型杂交产生Ｆ１ 代植株，
Ｆ１ 代植株自交得到约１　７００株Ｆ２ 代植株，从中鉴定
出４１０株具有ｘｔｃ１突变体表型的植株作为基因定
位群体。图位克隆参考 Ｌｕｋｏｗｉｔｚ等［２２］描述的方
法。试验所用标记均来自拟南芥网站（ｗｗｗ．ａｒａｂｉ－
ｄｏｐｓｉｓ．ｏｒｇ）。表１列出了使用标记的名称、所在细
菌人工染色体（ＢＡＣ）的名称、类型、引物序列、Ｌｅｒ
和Ｃｏｌ　２种生态型扩增片段的大小。
表１　用于定位拟南芥突变基因的标记
Ｔａｂｌｅ　１　Ｍａｒｋｅｒｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｍａｐ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｍｕｔａｎｔ　ｇｅｎｅ
标记
Ｍａｒｋｅｒ ＢＡＣ
类型
Ｔｙｐｅ
引物Ｆ
Ｐｒｉｍｅｒ　Ｆ
引物Ｒ
Ｐｒｉｍｅｒ　Ｒ
Ｌｅｒ片段／ｂｐ
Ｌｅｒ　ｆｒａｇｍｅｎｔ
Ｃｏｌ片段／ｂｐ
Ｃｏｌ　ｆｒａｇｍｅｎｔ
Ｆ１２Ｋ１１ Ｆ１２Ｋ１１ ＳＳＬＰ　 ｇａａｇａｇｃｃｔｇｔｃａｃｃａａｃｔａｃｇ　 ｔｃｇａａｔｃｔａａｃｃａａａｔｇｔｃｔｔｃａｇｇ　 １８１　 ２２６
Ｆ９Ｌ１ Ｆ９Ｌ１ ＳＳＬＰ　 ｔｇｔｇｃａｔｇｇｔａｔｔａｔａｇｇｔｇｇ　 ａａｔｃｇｃｃｔａｃｔａｔａｔｃｔｔｔｃａｇ　 ２００　 １４０
Ｔ２３Ｇ１８ Ｔ２３Ｇ１８ ＳＳＬＰ　 ａｔｇａｇｔｇｇｃｃａａｇｔｇｔｔａｃｇ　 ｃａａｃａａｇａａｇｃａｇｔａｃａｃｔｇ　 １８３　 １９９
Ｆ７Ｇ１９ Ｆ７Ｇ１９ ＳＳＬＰ　 ｇｇａｔｇｃａｔｔａｃａａｇｔｃａａｃａｇｇ　 ｃａｇａｃａｇａａｃａｔｇｇａｔａｔｇｇｇｔ　 ２７８　 ３２２
Ｔ２７Ｇ７－１ Ｔ２７Ｇ７ ＳＳＬＰ　 ｃｔｔｃａｇｇｃｃｃａｔａｔｔｃｇｔｔｔｇ　 ｔｃｔｔａｔｃｃｔｔｔｇａｇｇｃｔｔｔｃａｇ　 １２８　 １３８
Ｔ２７Ｇ７－２ Ｔ２７Ｇ７ ＳＳＬＰ　 ｇｔｇｃｃｔａｃａｇｇａｔｔｇａｔｇｃｃ　 ａｇａｃｔａａｇａａｔｔｔｃａａｃｃｔｇａｔｇ　 ２３３　 ２５３
Ｔ２７Ｇ７－３ Ｔ２７Ｇ７ ＳＳＬＰ　 ｔａｇｃｔｔｃａｔｃｇａｃｇａｔｇｔｃａｇ　 ｃｔａｃｔａｔｃｃａａｔｃａｔｇｔｇｔｔｃｇ　 １９４　 ２１４
Ｆ２２Ｏ１３－１ Ｆ２２Ｏ１３ ＳＳＬＰ　 ｃａｔａｔｇａｔｔａｃｔｇｃｇａｔｇｃｔｔ　 ｇａｇｇａｔａａｔｔｃｔｃｇｃｔａｔｇｃ　 １１１　 １１７
Ｆ２２Ｏ１３－２ Ｆ２２Ｏ１３ ＳＳＬＰ　 ｔａｔｇａｃａｔａｃｃｔａｇｇａａａｃｇａｇ　 ｇａｃｃａｃａｔｇｔｃａｃｃｔｔｔａｇｇａ　 １８０　 ２１０
１．７　ＦＡＴＢ基因及突变基因的测序
２１个基因的 Ｔ－ＤＮＡ插入突变体拟南芥植株
中，除 Ｔ－ＤＮＡ 插入在Ａｔ１ｇ０８５１０基因上的Ｓａｌｋ－
０２０８５６突变体具有ｘｔｃ１突变体的表型（如Ｓａｌｋ－
０２０８５６的茎比Ｌｅｒ野生型的茎更绿）外，其他２０个
基因的Ｔ－ＤＮＡ插入突变体的表型均与Ｌｅｒ野生型
无任何差异，初步确定Ａｔ１ｇ０８５１０基因为ｘｔｃ１突变
的候选基因。
用于ＦＡＴＢ基因编码区测序的引物见表２，由
深圳华大基因生物技术有限公司测定ＰＣＲ产物序
列，利用正反向引物双向测序。
表２　用于野生型和ｘｔｃ１突变体拟南芥中突变基因测序的引物序列
Ｔａｂｌｅ　２　Ｐｒｉｍｅｒｓ　ｕｓｅｄ　ｆｏｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｔｈｅ　ｍｕｔａｎｔ　ｇｅｎｅ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ　ａｎｄ　ｘｔｃ１ｍｕｔａｎｔｓ
名称
Ｐｒｉｍｅｒ　ｎａｍｅ
序列
Ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ
名称
Ｐｒｉｍｅｒ　ｎａｍｅ
序列
Ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ｆａｔｂｆ１Ｆ ｔｇｇｃａｇｔｇｔｃｔｔｔｇａａｃｇｃｔｔ　 ｆａｔｂｆ３Ｆ ｔｔｇｇｔｃｔｃａｔｇｇｇｔｔａｇｃｔａｔｔ
ｆａｔｂｆ１Ｒ ｃｃａｇｔｇａｃａａｃａｇｇｔａａｃｃｇ　 ｆａｔｂｆ３Ｒ ｇａｇａｇｔｃｔｔａｃａａｇｃｔｇｇｔｃａ
ｆａｔｂｆ２Ｆ ｔａｔｇｔａｔｇａａｃａａｇｃｔｃｔｔａｔｇｃ　 ｆａｔｂｆ４Ｆ ａｔｇｔｔｃｇａｔｃｔｇｇｔｃｔｃａｃｔｇｔ
ｆａｔｂｆ２Ｒ ａｃｃａａｔｇａａｔｇａｔｃａｇａｔｇａａｇａ　 ｆａｔｂｆ４Ｒ ｃａａｇｃａａｇｇｔｇｇｔａｇｔａｇｃａｇ
２　结果与分析
２．１　ｘｔｃ１突变体拟南芥茎表皮蜡含量的变化
为了研究拟南芥ｘｔｃ１突变体茎表皮蜡的变化，
采用气相色谱－氢焰离子（ＧＣ－ＦＩＤ）和气相色谱－质谱
（ＧＣ－ＭＳ），分别检测５株Ｌｅｒ野生型和５株ｘｔｃ１突
变体拟南芥植株茎表皮蜡的组成，结果见图１。
图１　拟南芥Ｌｅｒ野生型与ｘｔｃ１突变体植株茎表皮蜡的组成比较
Ｆｉｇ．１　Ｃｕｔｉｃｕｌａｒ　ｗａｘ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｏｎ　ｓｔｅｍｓ　ｏｆ　Ｌｅｒ　ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ　ａｎｄ　ｘｔｃ１　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｐｌａｎｔｓ
３０２第４期 蒋　琦，等：拟南芥ｘｔｃ１突变体的图位克隆分析
　　图１显示，Ｌｅｒ野生型拟南芥茎表皮蜡的各组
分在ｘｔｃ１突变体中均能检测到，但是ｘｔｃ１突变体的
各组分含量均低于Ｌｅｒ野生型；Ｌｅｒ野生型和ｘｔｃ１
突变体拟南芥植株的茎表皮蜡总量分别为１８．２和
５．６μｇ／ｃｍ
２，前者是后者的３倍多。
２．２　ｘｔｃ１突变体突变基因的定位
利用图位克隆方法对ｘｔｃ１突变体的突变位点
进行基因定位。经过初定位发现，突变位点与第１
条染色体上端的Ｆ１２Ｋ１１标记和Ｆ９Ｌ１标记具有明
显连锁。在Ｆ１２Ｋ１１和Ｆ９Ｌ１之间设计引物进一步
定位，相关分子标记的电泳图见图２。结合图３发
现，突变位点可能处于相距约８０ｋｂ且具有２１个基
因的Ｔ２７Ｇ７－３和Ｆ２２Ｏ１３－１　２个标记之间。
图２　拟南芥ｘｔｃ１突变体突变位点的分子标记电泳图
１．Ｆ１２Ｋ１１Ｌｅｒ片段；２．Ｆ１２Ｋ１１Ｃｏｌ片段；３．Ｆ９Ｌ１Ｌｅｒ片段；４．Ｆ９Ｌ１Ｃｏｌ片段；５．Ｔ２３Ｇ１８Ｌｅｒ片段；６．Ｔ２３Ｇ１８Ｃｏｌ片段；
７．Ｆ７Ｇ１９Ｌｅｒ片段；８．Ｆ７Ｇ１９Ｃｏｌ片段；９．Ｔ２７Ｇ７－１Ｌｅｒ片段；１０．Ｔ２７Ｇ７－１Ｃｏｌ片段；１１．Ｔ２７Ｇ７－２Ｌｅｒ片段；１２．Ｔ２７Ｇ７－２Ｃｏｌ片段；
１３．Ｔ２７Ｇ７－３Ｌｅｒ片段；１４．Ｔ２７Ｇ７－３Ｃｏｌ片段；１５．Ｆ２２Ｏ１３－１Ｌｅｒ片段；１６．Ｆ２２Ｏ１３－１Ｃｏｌ片段；１７．Ｆ２２Ｏ１３－２Ｌｅｒ片段；
１８．Ｆ２２Ｏ１３－２Ｃｏｌ片段；Ｍ．ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ
Ｆｉｇ．２　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｏｆ　ｍｕｔａｔｉｏｎ　ｓｉｔｅ　Ｍａｒｋｅｒｓ　ｏｆ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｍｕｔａｎｔ　ｘｔｃ１
１．Ｆ１２Ｋ１１Ｌｅｒ　ｆｒａｇｍｅｎｔ；２．Ｆ１２Ｋ１１Ｃｏｌ　ｆｒａｇｍｅｎｔ；３．Ｆ９Ｌ１Ｌｅｒ　ｆｒａｇｍｅｎｔ；４．Ｆ９Ｌ１Ｃｏｌ　ｆｒａｇｍｅｎｔ；５．Ｔ２３Ｇ１８Ｌｅｒ　ｆｒａｇｍｅｎｔ；
６．Ｔ２３Ｇ１８Ｃｏｌ　ｆｒａｇｍｅｎｔ；７．Ｆ７Ｇ１９Ｌｅｒ　ｆｒａｇｍｅｎｔ；８．Ｆ７Ｇ１９Ｃｏｌ　ｆｒａｇｍｅｎｔ；９．Ｔ２７Ｇ７－１Ｌｅｒ　ｆｒａｇｍｅｎｔ；１０．Ｔ２７Ｇ７－１Ｃｏｌ　ｆｒａｇｍｅｎｔ；
１１．Ｔ２７Ｇ７－２Ｌｅｒ　ｆｒａｇｍｅｎｔ；１２．Ｔ２７Ｇ７－２Ｃｏｌ　ｆｒａｇｍｅｎｔ；１３．Ｔ２７Ｇ７－３Ｌｅｒ　ｆｒａｇｍｅｎｔ；１４．Ｔ２７Ｇ７－３Ｃｏｌ　ｆｒａｇｍｅｎｔ；１５．Ｆ２２Ｏ１３－１Ｌｅｒ
ｆｒａｇｍｅｎｔ；１６．Ｆ２２Ｏ１３－１Ｃｏｌ　ｆｒａｇｍｅｎｔ；１７．Ｆ２２Ｏ１３－２Ｌｅｒ　ｆｒａｇｍｅｎｔ；１８．Ｆ２２Ｏ１３－２Ｃｏｌ　ｆｒａｇｍｅｎｔ；Ｍ．ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ
图３　ｘｔｃ１突变位点在拟南芥第１条染色体上端的定位信息
Ｆｉｇ．３　Ｌｏｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｘｔｃ１ｍｕｔａｔｉｏｎ　ａｔ　ｔｈｅ　ｔｏｐ　ｏｆ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅⅠ
２．３　ｘｔｃ１突变体突变基因的鉴定
根据拟南芥基因组信息，Ａｔ１ｇ０８５１０基因由５
个外显子和４个内含子组成，编码负责催化脂酰基
载体蛋白的脂酰基－ＡＣＰ硫酯酶Ｂ（Ｆａｔｔｙ　ａｃｙｌ　ｔｈｉｏ－
ｅｓｔｅｒａｓｅ　Ｂ，ＦＡＴＢ）［２３］。以ｘｔｃ１突变体及Ｌｅｒ野生
型拟南芥的基因组 ＤＮＡ 为模板，设计引物对
ＦＡＴＢ 进行扩增和测序。结果（图４）显示，突变体
在ＦＡＴＢ基因起始密码子后的第４３７个碱基处发
４０２ 西北农林科技大学学报（自然科学版） 第４２卷
生１４个碱基的缺失，导致形成终止密码子（ＴＡＧ），
使得蛋白质翻译提前终止，这样一个残缺的多肽链
理论上不具备正常生理功能。
图４　ｘｔｃ１突变位点基因与ＦＡＴＢ基因序列的比对
Ｆｉｇ．４　Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｘｔｃ１ａｎｄ　ＦＡＴＢ
　　为了进一步验证ＦＡＴＢ 基因突变是否导致
ｘｔｃ１突变体的表型，本研究构建了ｐＭＤＣ３２－３５Ｓ－
ＦＡＴＢ双元载体，并用其转化ｘｔｃ１突变体，结果得
到了８株转基因植株（ｘｔｃ１－ＦＡＴＢ），这些植株的茎
部都呈现灰绿色，与Ｌｅｒ野生型茎的颜色相似（图
５）。经ＧＣ－ＦＩＤ检测，表型恢复的转基因植株ｘｔｃ１－
ＦＡＴＢ茎部表皮蜡总量为２６．２７μｇ／ｃｍ
２，Ｌｅｒ野生
型为１８．７１μｇ／ｃｍ
２，ｘｔｃ１突变体为５．９８μｇ／ｃｍ
２（图
６）。ｘｔｃ１－ＦＡＴＢ转基因植株中的３５Ｓ强启动子可
能导致其植株茎部表皮蜡总量高于Ｌｅｒ野生型。此
外，在８株ｘｔｃ１－ＦＡＴＢ 转基因植株中，未观察到
ｘｔｃ１突变体的真叶子叶化及花瓣提前打开等表型。
以上结果证明，ＦＡＴＢ基因突变是导致形成ｘｔｃ１突
变体的原因，即ＦＡＴＢ基因为突变基因。
图５　１０周龄Ｌｅｒ野生型（左）、ｘｔｃ１突变体（中）与
ｘｔｃ１－ＦＡＴＢ（右）拟南芥植株的表型
Ｆｉｇ．５　Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ　ｏｆ　１０－ｗｅｅｋ－ｏｌｄ　ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ　Ｌｅｒ（ｌｅｆｔ），
ｘｔｃ１（ｍｉｄｄｌｅ）ａｎｄ　ｘｔｃ１－ＦＡＴＢ（ｒｉｇｈｔ）ｐｌａｎｔｓ
图６　拟南芥Ｌｅｒ野生型、ｘｔｃ１突变体与ｘｔｃ１－ＦＡＴＢ
转基因植株茎部表皮蜡总量的比较
Ｆｉｇ．６　Ｔｏｔａｌ　ｗａｘ　ｌｏａｄｓ　ｏｎ　ｓｔｅｍｓ　ｏｆ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ
Ｌｅｒ，ｘｔｃ１ｍｕｔａｎｔｓ　ａｎｄ　ｘｔｃ１－ＦＡＴＢｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｐｌａｎｔｓ
３　讨　论
在植物质体中合成的Ｃ１６：０－脂酰基载体蛋白
（Ｃ１６：０－ＡＣＰ）、Ｃ１６：１－ＡＣＰ、Ｃ１８：０－ＡＣＰ和Ｃ１８：１－
ＡＣＰ经脂酰基硫酯酶（ＦＡＴ）催化可释放出游离的
脂肪酸和ＡＣＰ［２４－２５］。在拟南芥中，根据底物偏好性
将ＦＡＴ分为ＦＡＴＡ和ＦＡＴＢ　２个家族［２６］。体外
酶活试验结果表明，ＦＡＴＡ对不饱和脂肪酸Ｃ１８：１－
ＡＣＰ的催化活性最高，对Ｃ１６：０－ＡＣＰ、Ｃ１６：１－ＡＣＰ
和Ｃ１８：０－ＡＣＰ的催化活性分别为Ｃ１８：１－ＡＣＰ催化
活性的１．６５％，９．３７％和１１．８４％；而ＦＡＴＢ对饱
和脂肪酸Ｃ１６：０－ＡＣＰ的催化活性最高，对Ｃ１６：１－
ＡＣＰ、Ｃ１８：０－ＡＣＰ和Ｃ１８：１－ＡＣＰ的催化活性分别
是 Ｃ１６：０－ＡＣＰ 活 性 的 ２１．７７％，３６．２９％ 和
７５．８８％［２３］。因此，ＦＡＴＢ 基因的突变导致从质体
转运到内质网的Ｃ１６：０和Ｃ１８：０饱和脂肪酸减少，
使得内质网上合成超长链脂肪酸的前体减少，最终
导致表皮蜡水平的降低。这与本研究中ｘｔｃ１突变
体茎表皮蜡的所有组分均比Ｌｅｒ野生型显著减少的
结果一致。
　　据报道，拟南芥ｘｔｃ１突变体的幼苗与野生型相
比多出１对子叶，这很可能是由ｘｔｃ１突变体胚胎发
育异常导致的［１９］。本研究中图位克隆和转基因结
果显示，突变基因是ＦＡＴＢ，但是有关ＦＡＴＢ 基因
突变导致多余子叶表型出现的详细机理尚不清楚，
有待进一步研究。
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ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ　ｔｈａｔ　ｉｓ　ｒｅｑｕｉｒｅｄ　ｆｏｒ　ｃｕｔｉｃｕｌａｒ　ｌｉｐｉｄ　ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ［Ｊ］．
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［１８］　Ｈｏｏｋｅｒ　Ｔ　Ｓ，Ｌａｍ　Ｐ，Ｚｈｅｎｇ　Ｈ，ｅｔ　ａｌ．Ａ　ｃｏｒｅ　ｓｕｂｕｎｉｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＲＮＡ－
ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ／ｄｅｇｒａｄｉｎｇ　ｅｘｏｓｏｍｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｙ　ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ　ｃｕｔｉｃｕｌａｒ
ｗａｘ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌ，２００７，１９（３）：
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ｔｈａｔ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍ　ｌｅａｖｅｓ　ｉｎｔｏ　ｃｏｔｙｌｅｄｏｎｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ
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［２０］　Ｃｌｏｕｇｈ　Ｓ　Ｊ，Ｂｅｎｔ　Ａ　Ｆ．Ｆｌｏｒａｌ　ｄｉｐ：Ａ　ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　Ａｇ－
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ
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ｔｙ　ｏｆ　ｐｌａｎｔ　ＦａｔＡ　ａｎｄ　ＦａｔＢ　ａｃｙｌ－ＡＣＰ　ｔｈｉｏｅｓｔｅｒａｓｅｓ［Ｊ］．Ａｒｃｈ
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［２４］　Ｋｏｏ　Ａ　Ｊ，Ｏｈｌｒｏｇｇｅ　Ｊ　Ｂ，Ｐｏｌａｒｄ　Ｍ．Ｏｎ　ｔｈｅ　ｅｘｐｏｒｔ　ｏｆ　ｆａｔｔｙ　ａｃｉｄｓ
ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ［Ｊ］．Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ，２００４，２７９（１６）：１６１０１－
１６１１０．
［２５］　Ｂｒｏｗｓｅ　Ｊ，Ｓｏｍｅｒｖｉｌｅ　Ｃ．Ｇｌｙｃｅｒｏｌｉｐｉｄ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ
ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ａｎｎｕａｌ　Ｒｅｖｉｅｗ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９１，４２（１）：
４６７－５０６．
［２６］　Ｊｏｎｅｓ　Ａ　Ｄ　Ｈ，Ｖｏｅｌｋｅｒ　Ｔ　Ａ．Ｐａｌｍｉｔｏｙｌ－ａｃｙｌ　ｃａｒｒｉｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ
（ＡＣＰ）ｔｈｉｏｅｓｔｅｒａｓｅ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｅｖｏｌｕｔｉｄｎａｒｙ－ｏｒｉｇｉｎ　ｏｆ　ｐｌａｎｔ　ａｃｙｌ－
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６０２ 西北农林科技大学学报（自然科学版） 第４２卷