全 文 ：上海农业学报 19 9 8 , 1 4 ( 3 ) : 1 4~ 1 6
A c t a A g r i c u l t u r a e S h a
, Zg h a i
矮牵牛查尔酮黄烷酮异构酶 (hc i A )基因启动子的克隆和测序 `
范惠琴 姚泉洪 黄晓敏 彭 日荷
(上海市农业遗传育种重点实验室 、 上海市农业科学院生物技术研究中心 , 上海 2 0 11 0 6)
摘 要 通过 P C R 扩增 , 从矮牵牛中克隆了能在花瓣 、 花药 、 花粉中特异表达的查尔酮黄烷
酮异构酶 ( 。 hi A )基因启动子 ,序列分析表明 , 该启动子含 1 3 0 5 个核昔酸 , 与国外报道的序列完全
一致 。
关键词 特异表达 ; 查尔酮黄烷酮异构酶 ( 。 hi A )基因 ;启动子 ;矮牵牛
随着植物基因工程技术的蓬勃发展 ,花卉基因工程研究也随之异军突起 ,其主要研究 内容
是根据人类的需要对花卉的色 、 香 、 形三个方面的性状进行遗传操作 。迄今 ,对花卉形态改 良的
基因工程操作报道很少见 ;香味基因工程操作也是 刚刚起步仁1二; 在花色基因工程操作领域中 ,
也仅在矮牵牛 仁2 , 3 〕 、 菊花 〔牛口等少数几种花卉中有成功的报道 ,其基因工程操作方法仅 局限于反
义 R N A 技术「5』、 共抑制法比 ` , 5 〕或直接导入一个 (或几个 ) 新的目的基因仁6〕等几种方法 , 以上报
道都是采用组成型启动子控制 目的基因的表达 。 为此 ,我们尝试以矮牵牛为试验材料采用调控
型启动子控制 目的基因表达的基因工程操作新途径 ,开展 了为特异改 良花卉的色 、 香 、 形 及延
长保鲜期 的基因工程研究 。 本文报道矮牵牛 c hi A 基 因启动子的克隆和测序结果 。
1 材 料 与 方 法
L l 植物材料
矮牵牛 (尸 et un la 勿br id a) 由本室提供 。
1
.
2 化学试剂和酶类
T a g p lu s 1 D N A 聚合酶 ,购 自加拿大 S a n go n 公司 , D N A 序列测定试剂盒为美国 A BI 公
司产品 ,其它主要化学试剂为美 国 iS g m a 公司或国产 A R 级试剂 。
1
·
3 P C R 引物合成
按照有关文献 仁7习设计 P C R 引物 , 为了克隆方便起见 ,在 引物两端引入了 sP lt 和 X ba l 限
制性内切酶切点 。
5 ’ 引物 T T A C G G T A C T G C A G T G C T A G 3`
3 ` 引物 G G A C A C T G G T C T A G A G A T T T T T G C 3 `
P C R 引物由中国科学院上海植物生理研究所合成 。
1
.
4 e h iA 启动子的 p e R 扩增
取幼嫩矮牵牛 叶片 ,按 C h e么n g叫方法少量提取总 D N A , 以总 D N A 为模板 , P C R 反应条
件 : 9 4℃变性 3 0 5 , 5 2 ℃退火 4 0 5 , 7 2 C延伸 9 0 5 ,共 3 0 个循环 。
收稿 日期 : 1 9 9 8一 0 3一 1 7 初稿 ; 1 9 9 8一 0 4一 1 6 修改稿 。
* 上海市科技发展基金科技攻关项 目 , 编号 9 73 91 3 01 1 。
3期 范惠琴等 :矮牵牛查尔酮黄烷酮异构酶 (c hi A )基因启动子的克隆和测序
1
.
5 c hi A 启动子的 D N A 序列测定
采用双脱氧终止法 ,用 A B I P R IS M D y e T e r m i n a t o r D N A 测序试剂盒 , 以 P r o m e g a 质粒
纯化柱提纯质粒 ,在 A BI 3 73 型 D N A 自动测序仪上测定全链 D N A 序列 。
2 结 果 与 讨 论
2
.
1 矮牵牛 c ih A 荃因启动子 P c R 产物鉴定与克隆
P C R 产物经 1%琼脂糖凝胶电泳检查 , P C R 扩增产物为 1二 2 k b 左右 。 剩余产物经酚 : 氯
仿 ( 1 : 1) 抽提 , 乙 醇沉淀 回收 。 回收的 P C R 扩增 产 物 以 sP t l 、 X ba l 双酶切 , 克 隆 a -
p B l a s e r i p t 载体 。
2
.
2 c ib A 基因启动子的序列分析
用双脱氧核昔酸终止法 ,对 D N A 进行 自动化测序 , 结果显示矮牵牛 。 hi A 基因启动子的
核昔酸序列与文献报道的完全相同 7j[ (图 1 ) 。
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图 1 c ih A 基因启动子全序列
F i g
.
1 T h e s e q u e n e e o f e h i A g e n e p r o m o t e r f r o m P e t u n i a
2
.
3 讨 论
国内外对植物花粉发育有过详尽研究 ,迄今已有几十种花药特异表达的基 因被克隆与测
序 ,且这些花药特异表达的启动子 已被成功地用于创造新的植物雄性不育系 、 恢复系川 。 相对
而言 ,人们对花朵特异基因的研究很少 , 至今仅有几例植物花朵特异 。 D N A 克隆及测序的报
道 , 而对植物花朵特异启动子的研究更少 . “ , “ 〕。 花卉出 口大国荷兰的科学家对矮牵牛查尔酮
黄烷酮异构酶基因启动子 C ih A 和 。 ih B 开展 了系统的研究 。 经转基因研究分析 , c hi A 受两个
串联启动子控制 ,可使标记基因在花瓣 、 花药和花粉中特异表达 区` 2〕 。 我们在国内首例报道通过
P C R 技术克隆了矮牵牛的花朵特异启动子 。 ih A 并测序 , 旨在由此启动子控制目的基因的表
6 1上 海 农 业 学 报 4 1卷
达 ,最终通过基因转化技术在不影响花卉植株正常发育的基础上 ,定向改良花朵的遗传特性 。
参 考 文 献
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1 0
l 1
l 2
P e lle g r i n e s h i A
,
D a m o n J P
,
V a l t o r t a N
, e t a l
.
Im p r o v e m e n t o f o r n a m e n t a l e h a r a e t e r s a n d f r a g r a n e e p r o d u e t io n i n le m o n
一 s e e n t e d g e r a n i u m t h r o u g h g e n e t i e t r a n s fo r m a t io n b y a g r o b a e t e r iu m r h i z o g e n e s
.
B i o / T e e h n o lo g y
,
1 9 9 4
,
1 2
:
6 4 ~ 6 8
.
N a p o li C
,
L e m i e u x C
,
J
o r g e n s e n R
.
In t r o d u e t i o n o f a e h im e r i e e h a l e o n e s y n t h a s e g e n e i n t o p e t u n i a r e s u l t s in r e v e r s ib l e
e o 一 s u P P r e s s i o n o f h o m o lo g o u s g e n e s in t r a n s
.
T h e P l a n t C e ll
,
1 9 9 0
,
2
:
2 7 9 ~ 2 8 9
.
V a n d e r K r o l A R
,
M u r L A
,
D e l a n g e P
, e t a l
.
A n t i s e n s e e h a le o in e s y n t h a s e i n p e t u n i a
: v i s u a li z a t i o n o f v a r i a b le t r a n s
-
g e n e e x P r e s s i o n
.
M o l G e n G e n e t
,
1 9 9 0
,
2 2 0
:
2 0 4~ 2 1 2
.
C o u r t n e y
一
C u t t e r s o n N
,
N a P o li C
,
L e m i e u x C
, e t a l
.
M o d i fi e a t i o n o f f lo w e r e o lo r in f lo r i s t
` 5 e h r y s a n t h e m u m : P r o d u e t io n
o f a w h i t e
一
f lo w e r in g v a r i e t y th r o u g h m o l e e u l a r g e n e t i e s
.
B i o / T e e h n o lo g y
,
1 9 94
,
1 2
:
2 6 8~ 2 7 2
.
V a n d e r K r o l A R
,
L e n t in g P E
,
V e n n s t r a J
, e t a l
.
A n a n t i s e n s e e h a le o n e s y n th a s e g e n e i n t r a n s g e n i e p la n t s in h ib i t s
f lo w e r p ig m e n t a t i o n
.
N a t u r e
,
1 9 8 8
,
3 3 3
:
8 6 6 ~ 8 6 9
.
M e g e r P
,
L in n F F
,
H e i d m a n n l
, e t a l
.
E p i g e n e t i e e h a n g e s in t h e e x p r e s s io n o f t h e m a i z e i n P e t u n ia hy 占八d a : r o le o f n u m -
b e r s o f i n t e g r a t e d g e n e e o p i e s a n d s t a t e o f m e t h y l a t io n
.
M o le e u la r G e n e r a l G e n e t i e s
,
1 9 9 0
,
2 2 2
:
5 2 9~ 3 36
.
A r ie n J V T
,
S u s a n A
,
H a r t m a n
, e t a l
.
R e g u la t i o n o f e h a le o n e f la v a n o n e i s o m e r a s e ( C H I ) g e n e e x p r e s s io n in P et u n i a hy
~
br id a
: t h e u s e o f a l t e r n a t i v e p r o m o t e r s i n e o r o l la
, a n t h e r s a n d p o l l e n
.
P la n t M o l e e u la r B io lo g y
,
1 9 5 9
,
1 2
:
5 3 9~ 5 5 1
.
C h e n g W Y
,
H u b e r t N
,
L a n d r y B 5
.
A s im Pl e a n d r a P id D N A m i e r o e x t r a e t i o n m e t h o d f o r P la n t
, a n im a l a n d in s e e t s u i t
-
a b le f o r R A P D a n d o t h e r P C R a n a ly s e s
.
P C R M e t h s A p p l i e s
,
1 9 9 3
,
3
:
6 9~ 7 0
.
C e le s t in a M
,
V e r o n iq u e G
, e t a l
.
A e h im a e r i e r ib o n u e le a s e
一
in h ib i t o r g e n e r e s t o r e
s
fe r t i li t y t o m a l e
s t e r i le p la n t s
.
N a t u r e
,
1 9 9 2
,
3 5 7
:
3 8 4 ~ 3 8 7
.
T w e n D
,
W in g R
,
M e C o r m i e k 5
.
I s o l a t io n a n d e x p r e s s i o n o f a n a n t h e r
一 s p e e i f i e g e n e f r o m t o m a t o
.
M o l G e n G e n e t
,
1 9 8 9
,
2 1 7
:
2 4 0~ 2 4 5
.
S a m a e h A
,
H a r e v e n D
,
L i f s e h i t z E
.
B io s y n th e t i e t h r e o n in e d e a m i n a s e g e n e o f t o m a t o
:
I s o l a t i o n
, s t r u e t u r e a n d u p r e g u la
-
t io n in f lo r a l o r g a n s
.
P r o e N a t l A e a d cS i
,
1 9 9 1
,
8 8
:
2 6 7 8 ~ 2 68 2
.
T u n e n A
,
M u r L
,
M o l J N M
.
P o l le n
一 a n d a n t h e r
一 s p e e if i e e h i p r o m o t e r s f r o m p e t u n i a
:
T a n d e m p r o m o t e r s r e g u la t io n o f
th e e h i a g e n e
.
T h e p la n t e e ll
,
1 9 9 0
,
2
:
3 9 3 ~ 4 0 1
.
C L O N I N G A N D S E Q U E N C I N G O F F L O W E R S P E C I F I C
C H A L C O N E F L A V A N O N E I S O M E R A S E ( C H I A )
P R O M O T E R F R O M P E T U N I A
F a n H u i q i n Y a o Q u a n h o n g H u a n g X i a o m i n P e n g R ih e
( S h a n g h a i K卿 L a bo ar t o即 of P l a n t G e n e t i c s a n d B er e d i n g , B i o t e c h R e s e a cr h eC n t e r ,
S h a n g h a i A c a d e ” ly of A g ir
c u l t u ar l S c i e n c e s
,
S h a n g h a i 2 0 1 1 0 6 )
A b s t r a c t T h e p r o m o t e r o f e h a l e o n e f l a v a n o n e i s o m
e r a s e ( e h iA ) g e n e w a s a m p l i f i e d
f r o m p e t u n i a g e n o m i
e D N A b y p o l y m e r a s e e h a i n r e a e t io n
.
T h e s e q u e n e e a n a l y s i s o f t h e p r o
-
m o t e r i n d i e a t e d t h a t t h e e l o n e d f r a g m
e n t e o n t a i n e d 1 3 0 5 n u e l e o t id e s
, a n d t h e n u e l e o t id e s e
-
q u e n e e o f t h e e l o n e d e h iA p r o m o t e r 15 t h e s a m e w i t h t h e s e q u e n e e r e P o r t e d a b r o a d
.
K e y w o r d s S p e e i f i e e x P r e s s i o n ; C h a l e o n e f l a v a n o n e i s o m e r a s e ( e h iA ) ; P r o m o t e r ; P e t u n i a