全 文 ：＊本项研究得到国家“ 863”计划的资助及国际科学与文化中心(ICSC)世界实验室的部分资助
收稿日期:1997-08-28 ,修回日期:1998-04-08
竹节花黄斑驳病毒启动子的缺失分析及功能＊
吴　标　潘瑞琴　芦　睿　田颖川
(中国科学院微生物研究所　北京　100080)
提　要　竹节花黄斑驳病毒(CoYMV)是侵染单子叶植物竹节花的一种双链环状 DNA 病毒 ,
它的启动子可介导外源基因在烟草韧皮部特异表达。为了研究其组织特异性表达的最佳启
动子区域 ,对 CoYMV 启动子进行了 5′端五种不同长度的缺失分析 , 用不同长度的启动子片
段与 GUS 基因及 NOS3′端转录中止序列构建了全长启动子及 5个缺失启动子序列的六个嵌
合GUS 基因植物表达载体。利用农杆菌将上述嵌合基因转化烟草外植体后 ,每种表达载体
都获得了一批转基因烟草植株。转化再生烟草植株的 PCR分析 、GUS 酶活测定及 GUS 组织
染色的结果表明六种类型的嵌合基因已整合到烟草染色体中 , 并有五种表达出 GUS 活性。
缺失到-870bp 的启动子比全长启动子(1040bp)的活性约高 78%,-870bp 比-585bp 启动子介
导的 GUS 活性略高但差别不明显 , 缺失到-447 和-232 时 GUS 活性有明显下降 , 但仍具有韧
皮部特异表达的特性。当缺失到 TATA box 附近的-44bp 时启动子丧失组织特异性 , GUS 活
性也降低到测不出来的水平。以上结果表明 CoYMV 启动子从转录起始位点上游-870bp ～
230bp 及-232bp下游区分别与启动子的活性和韧皮部组织特异性密切相关 ,-870bp 上游可能
存在一个负调控序列 ,所以该启动子的活性和组织特异性的最佳调控区应在-870bp 或-585bp
的下游区。CoYMV 启动子与 35S 启动子驱动 GUS 基因在烟草中表达的活性相比 , 前者为后
者的 70%左右 ,考虑到前者仅在韧皮部细胞表达而后者为组成型表达 , 所以 CoYMV 启动子
在韧皮部的活性可能与 35S 启动子相当或更高。 CoYMV 启动子在其它转基因植物中驱动
外源基因表达的特点正在研究中。
关键词　CoYM V启动子 , 缺失分析 , 韧皮部特异表达 , 转基因烟草植株
分类号　S432.4　文献标识码 A　文章编号 0001-6209(1999)01-0015-22
竹节花黄斑驳病毒(CoYMV)是一种侵染单子叶植物竹节花(Commel ina di f fusa)的
无包膜杆状病毒 。类似于花椰菜花叶病毒(CaMV),其基因组为双链环状 DNA ,每条链
都在特定的位点中断。Medberry 等人[ 1] 对 CoYMV 研究结果表明其基因组大小为
7489bp ,但转录物却比基因组长 120个核苷酸 。其 mRNA包含 3 个开放阅读框(ORF),
编码分子量为 15kD 、23kD和 216kD的蛋白质。Medberry 等人[ 2]后来对 CoYMV 启动子
进行了分析 ,通过转基因烟草证明该启动子驱动 GUS 基因特异地在韧皮部 ,韧皮部相关
细胞及根 、茎 、叶的轴向薄壁组织中 ,在整个花药中 ,尤其在绒毡层中有很高的表达。与带
双增强子的 CaMV35S 启动子相比 ,CoYMV启动子在烟草悬浮细胞中的活性仅为前者的
30%,而在玉米悬浮细胞中的活性为前者的 25%。他们[ 3]对该启动子-230bp下游的缺失
分析结果表明-159 ～ -84bp之间的序列是维管组织特异表达所必需 。CoYMV的这些特
性使之有可能成为介导外源基因在维管组织(韧皮部)中特异表达的有应用价值的启动
39 卷　1期
1999 年 2 月
微 生 物 学 报
Acta Microbiologica Sinica
Vol.39
February
　No.1
1999
DOI :10.13343/j.cnki.wsxb.1999.01.003
子。
为了探索 CoYMV 启动子在不同植物中驱动外源基因表达的特点并获得其韧皮部特
异表达的最佳启动子序列 ,我们对启动子进行了缺失分析。通过 GUS基因对每个缺失启
动子在转基因烟草中的功能进行了分析 ,初步确定了 CoYMV 的最佳启动子区。本文报
道这些实验的结果并对启动子的重要区域的功能进行了讨论。
1　材料和方法
1.1　材料
1.1.1　菌种和质粒:大肠杆菌 DH5α及根癌农杆菌 LBA4404由本实验室保存;pBI121质
粒购自 Clontech 公司;CoYMV 启动子克隆 pColBam-seq302 质粒由明尼苏达大学 Ol-
szewski教授惠赠 。
1.1.2　植物材料:烟草 K326种子由中国农业科学院山东烟草研究所韩晓东研究员提
供。转化所用烟草为无菌培养的 K326幼苗。
1.1.3　试剂及仪器:限制性内切酶及修饰酶购自 Boehringer公司 ,Promega公司或 BRL
公司;同位素α-35S-dATP ,α-32P-dCTP ,购自NEN公司;T7 DNA测序盒购自 Pharmacia公
司;PCR引物由中国科学院微生物研究所技术室或上海生物技术公司合成;Taq DNA聚
合酶购自中国科学院遗传研究所或上海生物技术公司 ,其它试剂购自 Sigma公司或国内
有关厂家或公司 。GUS酶活测定使用 Hoffer Pharmacia 公司的 DyNA Quant200 型荧光
测定仪;GUS组织染色结果用解剖镜观察并照相。
1.2　方法
1.2.1　CoYMV 启动子的 5′端缺失:利用 CoYMV 启动子序列内的内切酶位点 EcoRV 、
ClaI、XbaI及 HindIII等通过完全或部分酶解从启动子的 5′端进行不同长度的缺失 ,酶解
条件及酶解后 DNA的连接 ,大肠杆菌转化等方法均按文献[ 4]进行 。
1.2.2　缺失启动子 5′端序列的测定:用 pUC19 reverse引物和 Pharmacia公司 T7测序盒
测定 5′端缺失后的启动子末端序列 。
1.2.3　中间载体的构建及根癌农杆菌的转化:用 HindIII部分酶解 , BamHI 完全酶解含
缺失后的 CoYMV 启动子质粒 ,通过电泳分离不同长度的启动子片段 ,并与用 HindI II和
BamHI完全酶解的 pBI121质粒载体(除去 35S 启动子的大片段)以 1∶10 摩尔比混合 ,用
连接酶按文献[ 4]方法连接 ,转化大肠杆菌 DH5α感受态细胞 。通过酶切图谱分析即可筛
选到不同长度 CoYMV 启动子-GUS 嵌合基因的中间载体。
将以上含不同长度 CoYMV 启动子-GUS 嵌合基因的中间载体转入根癌农杆菌
LBA4404 ,参照文献[ 5]的方法进行。
1.2.4　烟草的转化及转基因烟草的筛选:除生根培养基中卡那霉素浓度为 150mg/L 外 ,
转化和植株再生方法同前文报道[ 6] 。
1.2.5　转化再生植株的 PCR检测:(1)烟草 DNA的提取:参照文献[ 7]介绍的方法进行 。
取 10 ～ 20mg 烟草叶片放入装有 100μL 提取缓冲液(0.1mol/L Tris-HCl ,pH9.0;10mmol/
L EDTA;2%SDS)的 1.5mL Eppendo rf f离心管中用一塑料研棒匀浆 ,然后加入 200μL氯
化苄 ,摇匀后于 50℃保温 15 min;加入 50μL 3 mol/L 乙酸钠 , pH5.0 ,混匀后置 0℃放置
16 微　　生　　物　　学　　报 39 卷
15 min;以上混合液经 8 000r/min离心后取上清溶液 ,加入等体积的异丙醇沉淀 DNA ,再
经离心收集 ,真空抽干后将 DNA溶于 20μL 重蒸馏水或 TE 缓冲液(10mmol/L tris-HCl ,
1mmol/L EDTA ,pH8.0)备用。(2)烟草 DNA的 PCR分析:取 1μL(～ 20ng)烟草 DNA ,
用GUS基因引物和 CoYMV启动子引物(Cop引物)或 Nos正链引物在 10μL PCR反应
体系(其中 Taq DNA 聚合酶及 PCR反应缓冲液由厂家提供;dNTP 最终浓度为每种
0.2mmol/ L;引物浓度为 1μmoL/L)中 94℃变性 5 min ,然后以 94℃, 1 min;58℃,1 min;
72℃,1 min反应 30个循环 。反应产物在 1%Agarose 凝胶上进行电泳分析。
　　引物的序列如下:
GUS引物:5′ATCGAAACGCAGCACGATAC3′
Cop引物:5′TCATCAG TAGAGGACGCACT3′
Nos+引物:5′CGCGGTGTCATCTATG TTAC3′
35S引物:5′CTGACGTAAGGGATGACGC3′
1.2.6　转基因烟草的GUS 活性检测:(1)烟草总可溶性蛋白的提取参照 Jef ferson等[ 8 ,
9]的方法 。取 0.5g 烟草叶片或 0.5g 叶脉组织 ,经液氮冷冻研磨后 ,加入 2.5ml蛋白提取
液(50mmol/L 磷酸钠缓冲液 ,pH7.0 ,10mmol/L EDTA ,0.1%Triton X-100 ,0.1%Sarko-
syl , 10mmol/L 巯基乙醇 ,25ng/mL PMSF)摇匀后于 33 000g ,4℃离心5 min ,取上清即为
烟草蛋白提取液.蛋白浓度的测定用 Bio-Rad Protein II 测定液按厂家提供的方法进行 。
蛋白提取液保存于-80C 备用 。(2)GUS 活性的荧光检测参照文献[ 8] 方法进行。以
365nm 激发光波长 ,455nm 发射波长在日立 850型荧光测定仪上测定标准 MU及样品荧
光值 。按 1000nmol/L MU 的相对荧光值为 1 000 ,将测定的蛋白荧光值换算成 MU 标准
值然后计算 GUS 比活性 ,以 pmol MU/min·mg 蛋白表示。(3)GUS 活性的组织化学检
查:取转基因或对照烟草的根和茎叶组织 ,其中茎和叶柄用解剖刀切出横截面或纵切面 ,
在固定液(0.3%甲醛 ,10μmol/L 吗啡啉乙磺酸 , pH5.6 ,0.3mol/L 甘露醇)中经真空抽气
30 ～ 60s ,然后在室温固定 45 min.按 Jef ferson[ 9]的方法进行染色反应及乙醇脱色 ,用解剖
镜观察 ,照相。
2　结果和讨论
2.1　CoYMV启动子的缺失分析及中间载体的构建
2.1.1　CoYMV启动子 5′端的缺失分析:利用CoYMV 启动子序列内不同的内切酶位点
进行了五种不同长度的缺失 ,在pColBam302基础上构建缺失后的CoYMV 启动子的亚克
隆pd1-302 、pd2-302 、pd3-302 、pd4-302及 pd5-302(图 1)。将 pColBam-seq 302用 Sal I酶
切 ,经 Klenow 酶补平后再用 EcoRV 进行部分酶解 ,分离部分酶解产生的大片段连接后即
得到缺失到-870bp的启动子质粒pd1-302;利用Cla I 对pColBam-seq 302完全酶解后分离
产生的大片段 ,用 T4 DNA 连接酶连接后即得到 pd2-302;用 SalI和 XbaI 酶解 pColBam
302经 Klenow 大片断聚合酶补平后分离大片段 ,连接后得到缺失到-447bp的 pd3-302;用
SalI酶解 ,Klenow 片段补平后再用 EcoRV 完全酶解分分离大片断 DNA ,连接后即得到缺
失到-232bp的启动子亚克隆 pd4-302;用 HindIII 完全酶解后分离大片段 ,连接后即得到
pd5-302 ,在 pd5-302中 CoYMV 启动子被缺失到-44bp。通过 PUC19 reverse 引物 ,利用
171 期 吴　标等:竹节黄斑驳病毒启动子的缺失分析及功能
T7 DNA测序盒对以上获得的缺失启动子亚克隆进行了序列分析 ,证实了如图 1所标出
的每种缺失的确切位置(序列资料略)。
图 1　CoYM V启动子的缺失分析
Fig.1 Deletion analysis of CoYMV promoter
Abbr.:B1 , BamH1;C1 , Cla1;H3 , HindIII;Kp , KpnI;P1 , PstI;RV , EcoR V;
S1 , SalI;Sc , SacI;Sm , SmaI;Sp , SphI , Xb , XbaI.
图 2　不同长度 CoYMV 启动子亚克隆
质粒的 Hind Ⅲ酶解图谱
Fig.2 Hind Ⅲ dig estion of vectors harboring
different CoYMV promoter fragments
lane1～ 6 represent pd4-302 ,
pd3-302 , pd2-302 , pd1-302 ,
pColBam302 and 1kb
DNA ladder respectively.
2.1.2　CoYMV-GUS 嵌合基因表达载体的构
建:利用 HindIII酶解 pBI121 , T4 DNA 聚合酶
补齐后再用 BamHI 酶解 ,分离大片段并与 SalI
酶解 , ,T4 DNA聚合酶补齐 ,BamHI酶解pCol-
Bam-302后分离的全长 CoYMV启动子片段连
接后得到 pBcoGUS 质粒 。在对缺失启动子进
行功能分析中 ,该质粒将作为各个缺失启动子
的对照 。
　　在构建启动子亚克隆(图 1)中由于 5′端只
用了 SalI 或 SalI 下游酶切位点 , 所以在
CoYMV启动子 5′端上游质粒多克隆位点中
HindIII仍保存下来 ,所以在每个亚克隆中都存
在两个 HindIII位点。HindIII 可将 TATA box
上游不同长度的启动子片段切出(图 2),证明
了缺失的正确性。为了在 pBI121基础上构建
各缺失 CoYMV-GUS 基因表达载体 ,除最短的
CoYMV启动子表达载体 pBcopd5-GUS外都必
须按本文 1.2.3中所述方法通过 HindIII 部分
酶解 , BamHI酶解来分离不同长度的启动子片
段与 HindIII 和 BamHI 酶解的 pBI121连接后
构建成如图 3所示的不同长度 CoYMV 启动子
18 微　　生　　物　　学　　报 39 卷
-GUS 嵌合基因的表达载体。pBcopd5-GUS是通过 HindIII完全酶解 pBcopd1-GUS ,然后
将载体部分自连而形成的。通过 HindIII 酶解各表达载体 DNA 证明无误后再按 1.2.3
所述方法转化根癌农杆菌(资料略)。
图 3　不同长度 CoYMV 启动子-GUS 嵌合基因中间表达载体的构建
Fig.3 Construction of intermediate vecto rs for CoYMV prompter-GUS chimeric gene
Abbr.B1 , BamH1;H3 ,HindI II;P1 , Pst I;R1 , EcoR I;S1 , Sal I;Sm , Sma I;
Sp , Sph I;Xb , Xba I;frags , fragment;pro., promo to r.
2.1.3　转基因烟草的分析:(1)转基因烟草的 PCR检测:用含不同长度 CoYMV 启动子-
GUS嵌合基因的农杆菌转化烟草后每一种结构都获得了一批转化再生植株 。为了有目
的地进行 GUS 活性检测 ,首先用 PCR 方法选择转基因植株。由于 CoP 引物位于
CoYMV启动子的 265 ～ 285 ,所以该引物与GUS引物一起只可用于 pBCoGUS , pBCopd1-
GUS ,pBCopd2-GUS 和 pBCopd3-GUS 转化再生植株的 PCR 分析 , PCR 产物长度应在
580bp ,而 pBCop-d4-GUS 和 pBCop-d5-GUS转化再生植株的检测则需要用 Nos正链引物
和GUS引物(负链),预期产物分别为 540bp 和 350bp。对 pBI121转化的植株 ,我们用
35S正链引物和 GUS 引物进行 PCR选择其转基因植株(PCR产物应为380bp),对六种不
同嵌合基因结构的转化再生植株进行 PCR分析后 ,每种结构最少选到 5株转基因植株 ,
最多选到 9株(资料略)。(2)转基因烟草植株的 GUS 活性 ,组织化学检测:按材料与方法
所述对 PCR反应阳性植株的根 、茎 、叶柄和叶片组织或组织切片进行了GUS 活性的染色
检测 。图版 1-a 、b 、c;d 、e 、f和 g 、h 、I三组图片分别为 pBI121 、 pBCopd4-GUS转基因烟草
191 期 吴　标等:竹节黄斑驳病毒启动子的缺失分析及功能
图 4　转基因烟草的 GUS 活性的比较
Fig.4 Comparision of GUS activity of transgenic to-
bacco plants containing different CoYMV pomoter
GUS constructs
CK , 121 , Cop , p1 , p2 , p3 , p4 and p5 present plants from
non-transformed control , transfo rmed w ith pBI121 ,
pBCoGUS , pBCopd1-GUS , pBCopd2-GUS , pBCopd3-
GUS , pBCopd4-GUS and pBCopd5-GUS respectively.
The GUS activity for each group of plants is an average
of 5 activities from tr ansgenic plants.
及非转基因烟草的叶片 、叶柄及茎的横切面的染色结果。比 244bp(pBCopd4-GUS)更长
的CoYMV 启动子结构的转基因烟草都显示了与 pBCopd4-GUS一样的韧皮部特异染色
结果 ,而 pBCopd5-GUS 的转基因烟草(资料略)及非转基因对照烟草未给出明显可见的
GUS活性染色。pBI121转基因烟草与 CoYMV 启动子-GUS 的转基因烟草明显不同的
是 35S启动子-GUS基因的组成型表达特点 ,35S启动子介导 GUS 基因在所有被测组织
的不同细胞中都有明显的表达 ,而 CoYMV-GUS 仅限于在维管组织中表达 。以上结果还
表明 CoYMV启动子-232bp上游与转录活性有关 ,而-232bp下游则与韧皮部特异表达
有关 。这一结果与 Medberry 和 Olszewski[ 3]的结果相符 ,他们通过对-230bp下游序列的
缺失分析发现-230 ～ -220bp与 CaMV35S 启动子的 as-1 启动子元件有相似性 ,对启动
子的活性有激活作用 , -159bp ～ -84bp之间的序列是维管组织表达所必需的 。放大的
茎横切片 GUS 染色结果表明在维管组织中 GUS 活性主要表现在内外韧皮部组织 ,在木
质部和髓部无GUS 活性表达 。根部的GUS 染色也得到了类似结果 ,即GUS基因特异地
在根的维管组织表达(资料略)。所以 CoYMV 启动子在烟草的主要组织中都表现了韧皮
部特异表达的特点。(3)转基因烟草 GUS活性的测定:虽然-232bp上游序列与 CoYMV
启动子活性有关 ,但不同长度缺失后对启动子活性有多大影响则需要对每个 CoYMV 缺
失启动子-GUS 基因的转基因烟草进行 GUS 活性的定量测定 。我们用转基因烟草叶片
总蛋白进行GUS活性测定的结果表明 ,CoYMV-GUS与 pBI121转基因烟草的 GUS 活性
相差近 10倍 ,即前者仅为后者的 1/10
左右 ,而用 CoYMV-GUS 烟草叶总蛋
白和叶脉总蛋白进行 GUS 活性测定
结果表明 ,叶脉蛋白中 GUS 活性是叶
总蛋白中GUS 活性的 5倍左右(资料
略)这种差异主要是由于 CoYMV 启
动子组织特异性表达造成的 。为了更
准确地 反映 并比 较各 种长 度的
CoYMV启动子的活性 ,我们从各个启
动子-GUS组合的转基因烟草中各取 5
株 PCR阳性植株提取其叶脉(主脉和
大的侧脉)总蛋白后进行 GUS 活性测
定 ,结果如图 4所示。图 4 结果表明
与 35S 启动子相比 , CoYMV 启动子
(-870bp)仅为前者的 70%左右(比较
121与 P1),但考虑到韧皮部细胞占叶
脉总细胞量的比例不超过 10%,所以
在韧皮部 CoYMV 启动的 GUS 活性
可能会与 35S-GUS 的活性相当或更
高 ,CoYMV 启动子在韧皮部应是一个
强启动子 。缺失到-870bp 的启动子
20 微　　生　　物　　学　　报 39 卷
比全长启动子转基因植株(比较图 5 中 CoP 与 P1)的 GUS活性约高 78%, -870bp 比-
585bp启动子介导的 GUS 活性略高(图 4 ,P2),但差别不明显(不超过 13%)。缺失到-
447或-232bp时GUS 活性与-870或-585bp 相比有明显下降(约降低 75%),但仍保
留了韧皮部特异表达的特性(图版 I)。 -44bp启动子-GUS 转基因植株(图 4 , P5)与非转
基因对照植株一样(图 4 , CK)未能检测出 GUS 活性 ,在组织化学染色中也未能表现出
GUS染色活性。
　　以上结果表明-232bp ～ 44bp与 CoYMV 启动子的组织特异性表达有关 ,而-232bp
上游区与启动子活性有关 。由于-870bp 启动子比全长启动子活性高约 78%,我们认为
-870bp上游可能存在一个负调控序列 ,所以 CoYMV 启动子驱动韧皮部特异表达的最
佳启动子功能区应在-870bp下游。在本研究中CoYMV 启动子 3′末端都在转录起始位
点下游 12bp处 ,下游其它有关序列对启动子活性及表达特性的影响有待进一步的研究。
致谢　衷心感谢中国科学院遗传研究所王兰岚 、陈正华教授及中国科学院微生物研究所
田雨清等在显微照相工作中的帮助和支持。
参 考 文 献
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[ 9] Jef ferson R A.P lant Molecular Biology Reporter , 1987 , 5:387～ 405.
DELETION ANALYSIS AND FUNCTIONAL STUDIESOF
THE PROMOTER FROM COMMELINA YELLOWMOTTLE VIRUS
Wu Biao　Pan Ruiqin　Lu Rui　T ian Yingchuan
(Inst itute of Microbiology , Chinese Academy of Sciences , Bejjing 100080)
Abstract　Commelina Yellow Mott le Virus(CoYMV)is a double-stranded , circular DNA virus and
its promoter could direct GUS gene specifically expressing in phloem tissue of transgenic tobacco
plants.To determine the optimal promoter sequence for phloem-specific gene expression , CoYMV
promoter was deleted from its 5′end to form promoter fragments with 5 different lengths.Chimeric
GUS genes were const ructed using the promoter deletion based on the binary vector pBI121.T rans-
genic tobacco plants evidenced by PCR analysis were obtained with each kind of chimeric GUS gene
st ructure by Agrobacterium mediated transformation.The results of GUS activity assay and histo-
chemical staining showed that most of the chimeric GUS genes were expressed in transgenic plants.
211 期 吴　标等:竹节黄斑驳病毒启动子的缺失分析及功能
The GUS activity with the promoter deleted to -870bp w as about 78%higher than that of the full
length promoter(1040bp)and was a little higher than that of the promoter deleted to -585bp , but
the dif ference is not significant.The GUS activity reduced significantly when the promoter was
deleted to -447bp or -232bp , whereas the property of phloem-specific expression pattern was still
retained.When the promoter was deleted to -44bp , just upstream adjacent to the TATA box , its
tissue-specificity was lost and the activity was reduced to undetectable level.These results suggest
that the region between -870bp ～ 232bp and downst ream of -232bp of CoYMV promoter could
be responsible for promoter activity and tissue specific expression , respectively.A negative regulation
sequence might exist upstream of -870bp of the CoYMV promoter.Therefore , we recommend
that the optional CoYMV promoter sequence for phloem specific expression could be dow nst ream
from -870bp or -585bp.In comparison with CaMV 35S promoter , the GUS activity when driven
by -870bp CoYMV promoter was about 70%of that when driven by the 35S promoter.Consider-
ing the fact t hat 35S promoter_GUS gene is constitutively expressed , while the CoYMV promoter-
GUS gene is expressed only in phloem tissues , the activity of the latter in phloem may be the same
with or even higher than that of the 35S promoter.
Key words　CoYMV promoter , Deletion analysis , Phloem-specific expression , T ransgenic tobacco
plant
图　版　说　明
Explanation of plate
转基因烟草的 GUS组织化学检测
Histochemical assay of GUS act ivi ty of t ransgenic tobacco tissues a , b, c;d.e , f and g , h , i show the GUS staining
pat tern of leaves , cross-seciton of pet ioles and stems from transgenic plants derived from pBI 121 , pBcopd4-GUS
and control plants respectively.Magnificaitons:a , 6 fold;d, g , 7 flod;others, 10 fold.
22 微　　生　　物　　学　　报 39 卷