全 文 ：中国农学通报 第24卷 第4期 2008年 4月
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农业生物技术科学
观赏花卉品质特性主要包括花形、花色、花姿、花
香，花的大小、质地和观赏寿命等[1]。其品质的优劣直接
关系到它的观赏价值和商品价值。特别是近年来随着经
济的快速发展，人们生活水平的不断提高，对花卉新品
种的需求越来越迫切，传统育种技术选育稀有品种的难
度很大，基因工程技术为花卉改良提供了新途径。在花
卉基因工程研究中，花器官特异表达启动子是一个非常
重要的因素。自1987年以来，有些花器官特异表达启动
子被克隆，对花卉基因工程的研究起到了促进作用[2]。
高等植物发育过程中花的形成是一个十分复杂的
过程，在这个过程中，大量基因的协同表达受到不同启
动子的调节和控制，其中花特异表达启动子起到了十
分重要的作用，因为植物花特异表达启动子可使特定
基因只在花器官中表达。本实验利用PCR技术克隆得
到花特异表达启动子PCHS，为培育花卉新品种和提
高花卉观赏价值奠定基础。
基金项目：中国热带农业科学院基金资助项目“百合T-DNA插入突变库的建立和筛选”（编号：Rky0529）。
第一作者简介：李刚，男，1981年出生，硕士。通信地址：571101海南省海口市 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 A102室。Tel：
0898-66890772；E-mail：gangmosi@126.com。
通讯作者：金志强，男，1962年出生，中国热带农业科学院热带生物技术研究所研究员，博士生导师，主要从事热带水果采后保鲜的分子生物学研究。
通信地址：571101海南省海口市 中国热带农业科学院热带生物技术研究所。Tel：0898-66890347；E-mail：zhiqiangjin2001@sohu.com。
收稿日期：2008-01-11；修回日期：2008-01-16。
拟南芥中花特异表达启动子PCHS的分离及
其功能初探
李 刚,陶妹英,贾彩红,张建斌,徐碧玉,金志强
（中国热带农业科学院生物技术研究所,海口571101）
摘 要:根据已发表的拟南芥启动子序列(AF248988)设计合成一对引物,以拟南芥(Arabidopsis)基因组
DNA为模板,通过PCR技术获得了约含500bp大小的DNA片段,经纯化后测序得到 531bp的目的片
段。通过DNAman进行序列分析表明,与文献报道的PCHS启动子序列有99%的同源,含有4个花特异
表达的调控元件。将此启动子替换pBI121上的CaMV35S启动子构建植物表达载体,农杆菌介导法浸染
矮牵牛花、茎、叶、根。GUS瞬时表达结果表明,在花上出现较深的蓝色,而在茎上的蓝色很浅,在根和叶
中不显蓝色,初步确定该启动子具有较强的花特异表达特性。
关键词:花特异表达启动子;克隆;GUS染色
CloningandFunctionAnalysisofaFlower-specificExpressionPromoterPCHS
LiGang,TaoMeiying,JiaCaihong,ZhangJianbin,XuBiyuJinZhiqiang
(InstituteofTropicalBioscienceandBiotechnology,ChineseAcademyofTropical
AgriculturalSciences,Haikou571101)
Abstract:Apolymerasechainreaction（PCR）amplificationwasusedtoisolateaflower-specificexpression
promoterPCHSfromArabidopsisgenomicDNA.SequenceanalysisrevealedthatPCHSwas531bpintotal
lengthandsharedsignificantnucleotidesidentity99%withGenBankdatabases,whichcontainedfourflower-
specificexpressionregulatoryelements.IntermediatevectorpPCHSwasconstructedbyinsertingthepromoter
totheupstreamofGUSinpB1121,wheretheoriginalCaMV35SpromoterwasreplacedbythePCHSpro-
moter.Theflower,stem,leaf,androotofpetuniahybridaweretransformedviaAgrobacteriumtumefaciens.
HistochemicallocalizationofGUSactivityindicatedthatthePCHSpromotercouldconferaflower-specific
expressionpaterntoGUS.
Keywords:flower-specificexpressionpromoter,clone;GUSstaining
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1材料和方法
1.1植物材料
拟南芥（Arabidopsis）野生型种子由本研究所郭建
春研究员馈赠。拟南芥种子用70%乙醇浸泡约 45s
后，再用0.1%升汞处理约8min，期间不断轻微摇动。
用无菌水冲洗3遍后于MS培养基上。于28℃，光照
3000Lx培养箱中培养，20d后以嫩茎和嫩叶为材料，
提取基因组DNA。
矮牵牛(Petuniahybrida)种子购自海南省海口市金
牛岭公园，商品名为梦幻白色，产地为美国，以生长良
好的白色矮牵牛嫩叶、嫩茎、根、花为材料，用蒸馏水冲
洗1遍，在70%酒精中浸泡30s，再用0.1%升汞消毒5
min（花和嫩叶2min），无菌水漂洗3次，每次 5min。
将消毒过的叶片、花瓣剪成0.5cm×0.5cm的小块，根
和嫩茎剪成0.8cm的长条形小块，接种在MS培养基
上，于培养箱中预培养2d备用。
1.2菌种和质粒
大肠杆菌E.coliDH5α、根癌农杆菌 GV3101、植
物表达载体pBI121均由本实验室保存。
1.3PCR扩增
拟南芥基因组 DNA的提取参照改良的 CTAB
法[3]。根据已报道的拟南芥启动子序列[4]，通过Omiga
软件分析设计引物PCHS1和PCHS2，并在引物中分
别加入了HindⅢ和BamHⅠ位点，下
划线为酶切位点：
PCHS1：5’GGGAAGCTTGAGTTAAGTATGCAC
GTGTAA3’
PCHS2：5’GGGGATCCTATAGTATACACCAAC
TTGGG3’
引物由北京赛百盛基因技术有限公司合成。以拟
南芥基因组DNA为模板，PCHS1和PCHS2为引物进
行PCR反应，PCR参数为：94℃预变性5min；94℃变
性 1min，58℃退火 1min，72℃延伸 45s，35个循环；
72℃延伸7min。
1.4PCR产物的测序及序列分析
PCR产物经0.1%琼脂糖凝胶电泳后，以DNA回
收试剂盒将PCR产物回收纯化，方法参照产品说明
书。回收后的PCR产物克隆到pGEM-T载体上，转化
E.coliDH5α，筛选重组质粒，命名为T-PCHS。重组质
粒的筛选方法参照[5]进行，对插入片段的克隆由宝生物
工程(大连)有限公司进行序列测定。
测序结果的同源性分析采用分析采用 DNAman
序列分析软件（www.bio-soft.net）。启动子的分析采用
promoterprediction和 WebSignalScanProgram两个
软件进行。
1.5表达载体的构建
植物表达载体pBI121经HindⅢ和BamHⅠ双酶
切，切除CaMV35S，回收载体大片段，T-PCHS经Hind
Ⅲ和BamHⅠ酶切后，回收PCHS，连接，转化大肠杆菌
E.coliDH5α，在卡那霉素抗性培养基（LB+Kan100
mg/L）上筛选阳性重组子，命名为pPCHS。
1.6农杆菌转化和瞬时表达检测
电激转化法将pPCHS导入农杆菌GV3101，农杆
菌介导法浸染经预培养的矮牵牛材料。按照王关林[6]
等人的方法，将浸染后的矮牵牛材料暗培养2d，进行
GUS组织化学染色。
2结果与分析
2.1PCHS启动子的扩增
以拟南芥基因组DNA为模板，PCHS1和PCHS2
为引物进行PCR反应，扩增产物电泳检测其大小约
500bp（图1）。将此片段回收后与pGEM-Teasyvector
相连，获得重组质粒T-PCHS，经HindII和BamHI双
酶切产生约500bp的片段（图2），说明500bp片段已
经插入pGEM-Teasyvector中。
图1PCR产物PCHS电泳图谱 图2重组质粒T-PCHS的酶切鉴定(HindⅢ+BamHⅠ)
2000bp
750bp
500bp
M 1
2000bp
1000bp
750bp
500bp
250bp
M 1
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2.2序列分析
经序列测定扩增产物为531bp，序列分析该片段
与文献报道序列的同源性达到99%，只存在3个碱基
的差异，如图3所示，其中阴影部分为引物。该序列具
有启动子的基本转录元件：TATAbox（TATTAAT）位
于-200、-254、-256和-429处；CAATbox位于-263和
-290处。在第 12～18个碱基之间有一个 G-box
（CACGTG），它是花核蛋白的结合域，是光、厌氧生活
和ABA应答元件，受光和UV诱导调控，并与花特异
表达有关[7~9]；在第30～35碱基之间有一个Q-element，
它是首次在玉米花粉特异基因ZM13的调控区鉴定为
“quantitativeelement”[10]；在第 225～231之间有一个
polen-box，它通常是在晚期的花粉特异基因的调控区
中检测到[11]；在369～374之间也有一个polen-box。
2.3植物表达载体构建及瞬时表达结果
构建的含有花特异表达启动子及携带GUS基因
的植物表达载体pPCHS如下图所示图4，酶切鉴定表
明载体构建成功,结果见图5。
图3PCHS启动子序列和文献报道的序列的比较
代表报导的序列
图4启动子及携带GUS基因的植物表达载体pPCHS
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在对转化的矮牵牛进行 GUS染色以前，对
GV3101空菌株和带有pPCHS质粒的GV3101菌液进
行 GUS染色，发现空菌株没有显示蓝色，而带有
pPCHS质粒的GV3101呈现蓝色，说明GV3101空菌
株本身不带有GUS基因（见图6）。因此，将转化后暗
培养2d的不同材料经X-Gluc染色，用无水乙醇脱色
后在显微镜下观察照相。结果发现阳性对照pBI121转
化的各种材料均出现蓝斑；而被pPCHS农杆菌浸染的
材料仅花瓣和茎上出现蓝色斑，花瓣上几乎全部呈现
蓝色斑，且颜色较深；在茎上出现了微量的浅淡的蓝色
斑点，在根和叶上未观察到任何蓝色；所有的阴性对照
均没有蓝色斑点出现（见图7）。说明PCHS启动子可
驱动GUS基因在植物的花和茎中表达，且在花中高效
表达，初步表明PCHS启动子为花特异表达启动子。
图5pPCHS载体构建及酶切鉴定 (HindⅢ+BamHI)
图6GV3101空菌株及带pPCHS质粒的农杆菌菌液的GUS染色
1.空菌株;2.空菌株;3.带pPCHS质粒的GV3101
3讨论
植物基因育种利用的启动子包括组成型和特异型
两大类。组成型启动子驱动的外源基因在转基因植物
的所有时期和组织中都表达，这不仅造成了能量的浪
费，而且会带来转基因植物的安全性问题[12,13]。因此，特
异性启动子的研究和应用日益受到人们的重视[14~16]。
花特异表达启动子是组织特异性启动子，在植株生长
到一定时期，其中的一些组织特异调控元件才驱动它
所控制的基因在花中特异性表达，这样既不会对植株
本身的生长造成影响，同时又有利于控制目的基因表
达的时间和组织，并且在后代的性状上很容易地辨别
该基因是否表达以及表达的强弱。Faktor[17]等将Frencj
beanCHS15基因的启动子与GUS报告基因融合后转
入烟草，其启动的GUS基因在花中的表达主要是限定
在花瓣的色素部分。说明其具有很强的花瓣特异表达
特性。我们的研究结果与其一致。
做为花特异表达启动子至少包括两个特异元件[18]
polen-box[11]和Q-element[10]，其中polen-box可以任意
地驱动花粉特异基因的表达[19]。本研究克隆的花特异
表达启动子包含了四个花特异表达调控元件：G-box
（CACGTG）、Q-element（AGTCA）、polen-box（AAAT-
GA、TCATTT）。GUS基因瞬时表达结果表明，该启动
花 茎 叶 根
1
2
3
1 2 3
2500bp
2000bp
1500bp
1250bp
1000bp
750bp
500bp
250bp
图7矮牵牛材料GUS活性的组织化学染色
1.pPCHS;2..pBI121(阳性对照);3.(阴性对照)
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子驱动的GUS基因比pPBI121载体35S启动子驱动
的GUS基因在花瓣中有较强的表达特性，在茎中微量
表达，而在叶和根中没有表达，初步认为PCHS启动子
是花特异表达启动子。
目前，一些转基因植物获得环境释放，并进行了商
品化生产，产生了巨大效益。但是转基因植物带来效益
的同时其潜在的生态风险和可能带来的环境问题一直
受到各国科学家的关注。有关转基因植物的安全性评
价已有大量研究报道[20,21]，这些研究表明转基因植物在
生态学方面主要的潜在风险：一是转基因植物本身带
来的潜在风险；二是转基因植物通过基因漂移对其他
物种带来影响，从而给整个生态系统带来危害。基因漂
移是指基因通过花粉授精杂交等途径在种群之间扩散
的过程。转基因植物基因通过花粉向近缘非转基因植
物转移，使得近缘物种有获得选择优势的潜在可能性，
使这些植物含有了抗病、抗虫或抗除草剂基因而成为
“超级杂草”。这样会促使大量化学农药的再次应用，造
成严重的环境危害[22]。因此将特异启动子与花粉特异
基因结合转化植物，使转基因植物不能产生正常花粉
粒或使花粉自然调亡，可以免除一些植物花粉对环境
造成的污染，有效控制转基因植物外源基因通过花粉
逃逸到自然环境中的可能。本研究所获得的PCHS启
动子为培育花粉败育的转基因植物提供了依据，因为
此启动子中含有的polen-box元件可以驱动花粉特异
基因的表达。将此启动子与花粉特异性基因结合转化
植物和花卉，在植物上便可以免除一些植物花粉对环
境造成的污染；在花卉方面使花卉不能产生正常花粉
粒或使花粉自然调亡，以此来延长花卉开花期。
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