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2014 年 第 59 卷 第 1 期：50 ~ 58
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引用格式: 高安礼, 吴晴阳, 张宇, 等. 拟南芥钙依赖的蛋白激酶 CPK28 正向参与渗透胁迫应答反应. 科学通报, 2014, 59: 50–58
英文版见: Chang C Y, Cao C X, Wang Q, et al. The novel H1N1 influenza A global airline transmission and early warning without travel containments.
Chin Sci Bull, 2014, 59, doi: 10.1007/ s11434-013-0062-Z
《中国科学》杂志社
SCIENCE CHINA PRESS 论 文
拟南芥钙依赖的蛋白激酶 CPK28正向参与
渗透胁迫应答反应
高安礼, 吴晴阳, 张宇, 苗雨晨, 宋纯鹏*
河南省植物逆境生物学重点实验室, 棉花生物学国家重点实验室, 河南大学生命科学学院, 开封 475004
* 联系人, E-mail: songcp@henu.edu.cn
2013-07-02 收稿, 2013-08-26 接受, 2013-10-17 网络版发表
国家转基因生物新品种培育科技重大专项(2011ZX08009-002)资助
摘要 作为钙离子的感受蛋白, 钙依赖的蛋白激酶(calcium-dependent protein kinases, CDPKs)在拟
南芥生长发育、应答逆境胁迫等方面具有重要作用. 本研究探讨了拟南芥 CDPK 家族成员之一
CPK28在应答渗透胁迫中的功能. 结果表明, CPK28基因缺失导致拟南芥幼苗对 NaCl和甘露醇引
起的渗透胁迫轻度敏感, 而 CPK28 基因超表达增强了拟南芥对渗透胁迫的耐受性. 拟南芥叶肉细
胞原生质体瞬时表达结果和转化永久GFP (green fluorescent protein)融合蛋白结果均证明 CPK28定
位于细胞质膜上. RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction)和 GUS(glucuronidase)化学
染色结果表明, CPK28 基因在拟南芥多种组织中均有表达, 而且受 NaCl 和甘露醇胁迫诱导表达.
本研究进一步检测了拟南芥幼苗受NaCl和甘露醇胁迫后体内的脯氨酸含量, 发现CPK28基因超表
达植株比野生型和功能缺失突变体体内积累更多的脯氨酸. 利用半定量 RT-PCR 检测了已知的胁
迫相关基因在野生型、CPK28功能缺失突变体和 CPK28基因超表达植株中的表达模式, 发现这些
基因的表达在 3种基因型材料中没有明显的差别, 暗示 CPK28可能不是通过调节基因的转录来参
与胁迫应答过程. 另外, 本研究还发现 CPK28可以催化自身磷酸化, 这为解析 CPK28的激酶活性
调节提供了线索. 上述研究结果表明CPK28可能参与了拟南芥应答NaCl和甘露醇胁迫反应, 并正
向调节这些反应过程.
关键词
CDPK
CPK28
拟南芥
超表达
渗透胁迫
植物在生长发育过程中一直受外界环境的胁迫
和刺激. 钙离子是真核细胞中广泛存在的第二信使,
在植物应答外界胁迫和胞内信号转导过程中起着主
要作用 [1,2]. 植物感知外界刺激和胞内信号传递是通
过胞质内游离钙离子浓度的变化来实现的 , 钙离子
结合蛋白可以感知钙离子浓度的变化 , 并将钙信号
传递下去[3,4].
高等植物中有 3 种主要的钙离子结合蛋白, 分别
是钙调素或类似钙调素蛋白(calmodulin, CaM)[5]、钙
调磷酸酶 B 类似蛋白(calcineurin B like protein, CBL)
和钙离子依赖的蛋白激酶(calcium-dependent protein
kinase, CDPK)[6~9], 其中 CDPK 在一条寡肽链上同时
具有独立的激酶结构域和类似于钙调素的钙离子结
合域, 而且激酶的活性必须依赖于钙离子的结合[8,9].
植物细胞中大部分与钙离子相关的信号转导过程与
CDPK 有关[10]. 对拟南芥基因组分析发现, 拟南芥中
存在一个 CDPK 家族, 这个家族由 34 个成员组成[2],
其中部分成员以 ABA (abscisic acid)依赖或非依赖的
方式参与了植物应答干旱、盐等多种非生物胁迫过程.
例如, CPK4, CPK11 以及 CPK32 通过磷酸化 ABA 信
号通路中的转录因子 ABF (ABA-responsive element
binding factor)正向调节 ABA 信号转导过程[11,12]; 而
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论 文
CPK12 通过调节 ABI2 (ABA insensitive 2)活性负向
介导 ABA 信号途径[13]; CPK3, CPK6 以及 CPK10 通
过调节保卫细胞阴离子通道蛋白的活性参与 ABA 诱
导的气孔关闭过程[14~16], 而且 CPK3 也被证实参与了
植物盐胁迫应答过程[14]; CPK21 和 CPK23 则直接调
控了保卫细胞质膜上的阴离子通道蛋白 SLAC1 (slow
anion channel-associated 1)[17].
盐胁迫限制植物的生长表现为 2 个方面, 即引起
渗透胁迫和打破细胞内的离子平衡 . 因此维持细胞
内钾离子和钠离子的平衡是植物减轻盐胁迫的主要
手段 [18~20]. 植物通过调节钠离子转运体的活性 , 将
胞内钠离子外排或者将多余的钠离子转运至液泡以
维持细胞内的离子平衡[21,22]. 研究发现, 盐胁迫可以
刺激胞质内钙离子浓度的升高 , 钙离子感受蛋白可
以感知这种变化并将信号传递下去 [23]. 如在 SOS
(salt overly sensitive)系统中, SOS3 作为钙离子的感
受蛋白, 激活蛋白激酶 SOS2, SOS2 调节质膜上的钠
氢反向转运体 SOS1, 促进钠离子外排[24], 而且 SOS2
还可以与液泡膜上钠氢反向转运体 NHX1 (Na+/H+
exchanger 1)互作, 将钠离子转运至液泡中[25,26].
基于钙信号在植物应答逆境反应过程中所扮演
的重要角色 , 我们研究了拟南芥钙依赖的蛋白激酶
CPK28 在盐胁迫和渗透胁迫中的功能及其作用机制.
研究发现, CPK28 基因缺失导致拟南芥对盐胁迫和渗
透胁迫轻度敏感, 而 CPK28 超表达植株表现出了更
好的逆境耐受性, 暗示 CPK28 可能参与了盐胁迫和
甘露醇胁迫应答反应过程.
1 材料与方法
(ⅰ) 植物材料与生长条件. 实验材料为野生型
拟南芥 Col-0 生态型(wt), CPK28 基因的 T-DNA 插入
突变体 Salk_112540 (命名为 cpk28-1)和 WiscDSlox
264D03 (命名为 cpk28-2). 突变体遗传背景为 Col-0,
突 变 体 种 子 购 自 拟 南 芥 种 质 资 源 中 心 (Arabidopsis
Biological Resource Center, ABRC).
种子经 0.1%氯化汞表面消毒后点播于含 0.6%琼
脂粉的 MS (murashige and skoog)培养基上, 置 4℃黑
暗条件下 3 d, 然后放置于光照培养间生长(温度 22±
2℃, 光周期 16 h 光/8 h 暗, 相对湿度 70%). 胁迫处
理时, MS 培养基中含有不同浓度的 NaCl 或甘露醇.
从生长第 4 天开始, 统计子叶的复绿情况.
(ⅱ ) T-DNA 插 入 突 变 体 的 鉴 定 . 根 据 网 站
(http://signal.salk.edu/)提供的 T-DNA 插入突变体鉴
定方法 , 合成相关的引物 . 鉴定 cpk28-1 的引物为
112540LP, 112540RP 以及 T-DNA 边界引物 LBa1; 鉴
定 cpk28-2 的引物为 264D03LP, 264D03RP 以及 T-
DNA 边界引物 wisLB1(表 1).
以拟南芥基因组 DNA 作为模板, 利用基因特异
引物 LP 和 RP 进行 PCR 扩增, 野生型植株可以扩增
出相应大小的条带, 纯合突变体则不能扩增. 挑选引
物 LP+RP 不能扩增的植株, 以基因特异引物 RP 和
T-DNA 的特异引物 LB 组合进行 PCR 扩增, 纯合插
入突变体可以扩增出相应大小的条带 , 而野生型不
能扩增出条带. 根据 PCR 结果, 获得纯合的 T-DNA
插入突变体. 所得纯合突变体与野生型拟南芥 Col-0
杂交, 挑选 F2 代中纯合 T-DNA 插入突变体的后代进
行表型分析.
(ⅲ) 相关载体的构建. 超表达载体为改造过的
pSuper1300+, GUS 表达载体为 pCAMBIA1300-221,
用于研究蛋白亚细胞定位的瞬时表达载体为 pHTB-
GFP-NOS, 永久 GFP 表达载体为 pSuper1300-GFP,
His 融合蛋白表达载体为 pET-28a. 以上载体均由河
南大学植物逆境生物学重点实验室改造和保存 . 构
建点突变载体使用 QuickChang Lightning Site-Directed
Mutagenesis Kit (Agilent Technologies, 美国). 构建载
体 所 用 菌 株 为 DH5, 农 杆 菌 转 化 所 用 菌 株 为
GV3101, 原核表达所用菌株为 BL21(DE3).
以拟南芥基因组 DNA 为模板, 利用引物 CPK28-
GUSF 和 CPK28-GUSR (表 1)扩增 CPK28 的启动子序
列. 产物双酶切后, 将其插入到 pCAMBIA1300-221
载体中, 获得 CPK28 启动子驱动 GUS 的融合表达载
体 PCPK28::GUS. 以野生型拟南芥 cDNA 为模板, 利
用上述相同的方法, 分别构建 CPK28 基因超表达载
体 p1300::CPK28, GFP 瞬时表达载体 35S::CPK28-
GFP、永久 GFP 表达载体 p1300::CPK28-GFP 以及原
核蛋白表达载体 pET28a-CPK28. 超表达载体所用引
物为 CPK28-1300F 和 CPK28-1300R; 瞬时表达 GFP
载体所用引物为 CPK28TransF 和 CPK28TransR; 永久
表达 GFP 载体所用引物为 CPK28PerF 和 CPK28PerR;
蛋白原核表达载体所用引物为 CPK28-petF 和 CPK28-
petR; 点突变载体所用引物为 D188F 和 D188R (表 1).
上述载体均进行测序验证.
(ⅳ) 转基因植株创建及原生质体转化. 将构建
的 CPK28 启动子驱动的 GUS 融合载体 pCPK28::GUS、
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表 1 本文所用的引物名称和序列 a)
引物名称 序列(5′→3′)
112540LP AGTATCGGAATACGGTTGTGC
112540RP TGATCGTGGAAGTCTTTGGAG
LBa1 ATTTTGCCGATTTCGGAA
264D03LP CAGTTCTATCCCAAAAAGGCC
264D03RP TCCAGCCCTTACTAGGGTTT
wisLB1 AACGTCCGCAATGTGTTATTAAGTTG
CPK28-GUSF TCAAAGCTTGGGGAGAAAATAATGAAACTT
CPK28-GUSR CCATCTAGAGGCTCTGATGAATCGAGAAAG
CPK28-1300F TCATCTAGAATG GGTGTCTGTTTCT
CPK28-1300R TGGCCCGGGCTATCGAAGATTCCTG
CPK28TransF ACAGGTACCATGGGTGTCTGTTT
CPK28TransR TGAGGATCCTCGAAGATTCCTG
CPK28PerF TCATCTAGAATGGGTGTCTGTTTCTC
CPK28PerR TGTACTAGTTCGAAGGATTCCTGTGAC
CPK28-petF TGAGGATCCATGGGTGTCTGTTT
CPK28-petR ACAGAGCTCCTATCGAAGATTCCTG
D188F
CACGGTCTTGTACATAGAGATATGAAAC-
CAGAGAAC
D188R CACGGTCTTGTACATAGAGCCATGAAAC-
CAGAGAAC
CPK28RTF GTGTCTGTTTCTCCGCCATTA
CPK28RTR AACCTTTTCCCTGGTTTGATA
ActinRTF TTCCTCATGCCATCCTCCGTCTT
ActinRTR CAGCGATACCTGAGAACATAGTGG
CPK28-Q-F: ACGATCACTACACCATCGGCAAGT
CPK28-Q-R TGAACCTCACGCTTGACATCCTCA
Actin-Q-F GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG
Actin-Q-R AACGACCTTAATCTTCATGCTGC
STZF GGACAAAGGGTAAGCGATCTAA
STZR AGTCAAACC GAGGCTTCTTC
ERD10F CATTCACGCTAAGTGTTCAATC
ERD10R TTCTTCTCTTCTTCCTCTGGTT
RD29aF GCTAAGAAGTTCAAGAACAGTC
RD29aR CATCAGTCACTTCCATATTACC
RD20F GTACGG AACGATTTGGAGGAA
RD20R CCATGCTTGGCTTTGTGTATG
RD29bF ATGAGAAGGGAGCATCCAAAG
RD29bR TCTGACACTCC GAGAGGATAAT
ERD15F GAGAATGGTGGAGGTCATATCG
ERD15R GAGGCTGGTGGATGTTTCT
P5CSF GATTCTTCTGAGCGATGTTG
P5CSR CTAATGGTGATGAGGTCTTCT
NHX1F CGGTCTGATAAG TGCGTATGT
NHX1R GTTCTGGTGCGGTAATAGGTAG
SOS1F GTGGCTCTTGCACTTTCTTTATC
SOS1R CATCAAGCATCTCCCAG TAAGT
a) 引物序列中的下划线为限制性内切酶识别序列
超表达载体 p1300::CPK28 和 GFP 永久表达载体
pSuper1300::CPK28-GFP 用 电 击 方 法 转 入 农 杆 菌
GV3101 中, 然后通过农杆菌浸染野生型拟南芥花序
方法获得转基因植株. 收获的种子在含有 20 g mL1
潮霉素的 MS 培养基上进行抗性筛选, 最后获得纯合
的 T2 代转基因植株.
通 过 PEG/Ca2+ 介 导 的 方 法 将 瞬 时 表 达 载 体
35S::CPK28-GFP 转入到拟南芥叶肉细胞原生质体中,
弱光下室温放置 16~20 h 后进行荧光检测.
(ⅴ) 激光共聚焦显微镜检测蛋白质的亚细胞定
位 . GFP 荧光检测在激光共聚焦显微镜 FV1000
(Olympus, 日本)上进行 . 瞬时表达的原生质体荧光
图像用 60×油镜采集; 检测转永久 GFP 植株的根细胞
荧光, 图像采集用 40×镜头. GFP 和叶绿体由 488 nm
激发光所激发, 荧光采集波长分别为 500~530 (GFP)
和 650~750 nm(叶绿体荧光).
(ⅵ) GUS 组织化学染色. 挑选 5 个纯合的不同
株系的转 GUS 基因植株幼苗或组织, 浸泡于 GUS 染
色液(3 mmol L1 X-Gluc; 0.1 mol L1 磷酸钠缓冲液,
pH 7.0; 0.1% Trition X-100; 8 mmol L1 -巯基乙醇)
中, 37℃避光放置 6 h, 然后用 70%乙醇、95%乙醇以
及无水乙醇进行梯度脱色, 脱色后拍照. 检测胁迫处
理对 CPK28 基因的表达影响时, 先将转 GUS 基因幼
苗胁迫处理后, 再按照上述方法进行染色, 同时, 选
取来自同一个株系的未处理幼苗作为对照.
(ⅶ) 半定量和实时荧光定量 RT-PCR 分析. 取
培 养室中正常 生长和胁迫 处理的拟南 芥幼苗提 取
RNA. RNA 提 取 和 cDNA 第 一 链 合 成 分 别 按 照
TRIZOL (Invitrogen, 美国)提取方法和 M-MLV 试剂
盒(Promega, 美国)说明书进行. 以 Actin2 作为内参,
半定量 RT-PCR 检测 CPK28 以及与胁迫相关的标记
基因的表达量. 实时荧光定量 RT-PCR 采用 SYBR
Premix Ex Taq 试剂盒(TaKaRa, 大连), 在 MX3005p
荧光定量 PCR 仪(Strategene, 美国)上进行扩增和检
测, 所用程序为 94℃预变性 30 s, 94℃ 15 s, 55℃ 20 s,
72℃ 15 s, 循环 40 次, 检测完成后转入熔解曲线检
测程序.
CPK28 的半定量 PCR 引物为 CPK28RTF 和 CPK28-
RTR; 内参 Actin2 半定量 PCR 引物为 ActinRTF 和
ActinRTR; CPK28 的定量 PCR 引物为 CPK28-Q-F 和
CPK28-Q-R; 内参 Actin2 的定量引物为 Actin-Q-F 和
Actin-Q-R. 以上引物及胁迫相关基因的半定量检测
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论 文
所用引物列于表 1.
(ⅷ) 植物体内脯氨酸含量的测定. 称取 25 mg
正常生长或胁迫处理的拟南芥幼苗放入 1.5 mL 离心
管中, 加入 200 L 3%磺基水杨酸溶液, 在冰上用研
磨棒仔细研磨, 再加入 300 L 3%磺基水杨酸溶液,
置 100℃水浴锅中 30 min. 待样品恢复至室温, 3000×g
离心 10 min, 取 200 L 上清于 1.5 mL 离心管中, 然
后加入 200 L 茚三酮, 置 100℃水浴锅中 30 min. 样
品冷却至室温后再加入 400 L 甲苯, 剧烈震荡 10 s,
静置 1~2 h. 取上相 200 L, 测其 520 nm 处的吸光值.
将 100 mg mL1 的脯氨酸母液分别稀释至 80, 60, 40,
20, 10 mg mL1, 按照上述方法测其 520 nm 处的吸光
值, 最后得到标准脯氨酸浓度和吸光值的标准曲线.
(ⅸ) 原核蛋白的诱导表达与去磷酸化反应检测.
将 构 建 好 的 原 核 表 达 载 体 转 入 到 大 肠 杆 菌 BL21
(DE3)中, 挑取单个菌落接种于 5 mL LB (Luria-Bertani)
液体培养基中, 37℃培养过夜. 过夜培养物以 1:100
的比例接种到 300 mL LB 液体培养基中, 待 A600 为
0.5 左右时, 加入 IPTG (isopropyl -d-thiogalactoside),
使其终浓度为 0.2 mmol L1, 28℃诱导 6 h, 离心收集
菌体, 重悬于 10 mL 破菌缓冲液(200 mmol L1 NaCl,
20 mmol L1 Tris-HCl, 1 mmol L1 PMSF (phenylme-
thanesulfonyl fluoride), pH 7.6)中, 超声波破菌. 18000×g,
4℃离心 50 min, 取上清, 用螯合了镍离子的琼脂糖
凝 胶 柱 (Qiagen, 德 国 )进行 亲 和层 析 , 最 后 用 含有
250 mmol L1 咪唑的破菌缓冲液洗脱目的蛋白. 蛋白
激酶的去磷酸化反应体系为 20 L, 含有 50 mmol L1
Tris, 5 mmol L1 MgCl2, 2 g CPK28 蛋白激酶和 2 U
的小牛肠碱性磷酸酶 CIAP (calf intestine alkaline
phosphatase). 37℃反应 1 h 后, 反应体系中加入 5 L
的 4×SDS-PAGE (lauryl sodium sulfate-polyacrylamide
gel electrophoresis)上样缓冲液(250 mmol L Tris-
HCl, 10% SDS (sodium dodecyl sulfate), 0.5%溴酚蓝,
50%甘油, 5% -巯基乙醇), 100℃ 5 min, 冰上放置
5 min, 然后用 12%聚丙烯酰胺凝胶电泳. 电泳结束
后, 利用电转法将蛋白印迹到硝酸纤维素膜上, 用含
有 5%脱脂奶粉的 TBST (Tris-buffered saline Tween-
20) (20 mmol L1 Tris-HCl, 150 mmol L1 NaCl, 0.05%
(v/v) Tween 20)室温封闭 2 h. 按 10000:1 的稀释比例
加入一抗, 4℃孵育过夜, 用 TBST 漂洗 3 次, 每次 10
min. 然后按照 5000:1 的稀释比例加入二抗, 室温孵
育 2 h, TBST 漂洗 3 次, 每次 10 min. 取辣根过氧化
物酶底物溶液 A 和溶液 B (天根生化科技有限公司,
北京)各 1 mL, 室温反应 5 min, 放入 X 光胶片黑暗中
曝光适当的时间, 显影.
2 结果
2.1 CPK28 基因缺失导致拟南芥对盐及甘露醇胁
迫敏感, 而基因超表达增强了胁迫耐受性
研究发现, 在拟南芥 CDPK 家族中, 有多个成员
参与了依赖于 ABA 或不依赖于 ABA 的干旱、盐等
胁迫反应过程[11,13,14,16], 作为拟南芥 CDPK 家族成员
之一, CPK28 是否也参与了这些逆境应答过程? 本研
究获得了 CPK28 基因的 T-DNA 插入纯合突变体
cpk28-1 和 cpk28-2. 测序结果表明, 这 2 个突变体中
的 T-DNA 分别插入在 CPK28 基因组的不同位置,
cpk28-1 的 T-DNA 插入在 5′UTR, cpk28-2 的 T-DNA
插入在第 3 个外显子上(图 1(a)). 利用 RT-PCR, 本研
究检测了 CPK28 基因在突变体中的表达情况. 结果
显示, 在 cpk28-1 突变体中, 可以检测到 CPK28 基因
图 1 CPK28基因突变体和超表达植株的鉴定
(a) cpk28 突变体中 T-DNA 的插入位置; (b) 半定量 RT-PCR 检测不同
材料中CPK28 基因的表达情况, 以Actin2 为内参; (c) 3 个独立的CPK28
超表达转基因株系的定量 RT-PCR 结果, 以 Actin2 为内参, 相对表达
量的标准差为 3 次独立定量 PCR 结果所得. 半定量和定量 RT-PCR
检测的植物材料均为 MS 培养基上生长 15 d 左右的幼苗
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的全长 CDS (coding sequence), 而且表达量比野生型
明显上调(图 1(b)), 表明 cpk28-1 可以作为一个潜在
的超表达植株进行研究. 而在突变体 cpk28-2 中, 没
有检测到 CPK28 基因的转录产物, 表明 cpk28-2 是一
个功能完全缺失的突变体(图 1(b)). 为了进一步研究
CPK28 基因的功能, 本研究创建了 3 个独立的 CPK28
超表达转基因植系(OE1, OE2, OE3). 定量 PCR 结果
显示, 在这 3 个超表达株系中, CPK28 的表达量均为
为野生型中的 30 倍以上(图 1(c)).
本研究以野生型、突变体以及超表达植株为材料,
检测了多种激素处理和非生物学胁迫下 , 这些材料
对激素和非生物学胁迫的反应情况 , 以一定时间的
种子萌发率和子叶复绿率为表型指标, 结果发现, 野
生型、突变体以及超表达植株对各种激素处理没有表
现出差别(结果未显示). 当用 NaCl、甘露醇处理时,
这 3 种基因型材料在子叶复绿方面表现不同(图 2(a),
(c)). 在正常生长条件下, 野生型、突变体以及基因超表
达植株子的叶复绿率没有差别, NaCl 处理下, CPK28 超
表达植株以及 cpk28-1 的子叶变绿率比野生型和功能
缺失突变体 cpk28-2 高, 尤其在 100 mmol L1 NaCl
处理时, 差异最为明显(图 2(b)). 本研究又统计了在
甘露醇处理下, 野生型、突变体和超表达这 3 种基因
型材料的子叶复绿率, 结果显示, 在 150 mmol L1 甘
露醇处理下, 野生型、突变体和超表达之间子叶复绿
率差别最为明显(图 2(d)). 以上结果表明, CPK28 基
因的缺失导致拟南芥对盐胁迫和甘露醇胁迫轻度敏
感, 而 CPK28 基因超表达则提高了拟南芥对盐胁迫
和渗透胁迫的耐受, 这些结果暗示 CPK28 可能参与
了盐、甘露醇等逆境胁迫诱导的植物应答过程, 并正
向调节胁迫诱导的应答反应.
2.2 CPK28 基因在拟南芥多种组织中表达并受
NaCl和甘露醇胁迫诱导
为了检测 CPK28 基因在拟南芥组织中的表达情
况, 本研究构建了转 GUS 基因的植株, 利用 CPK28
基因上游 1500 bp 的启动子区域, 驱动 GUS 基因的表
达, 并通过 GUS 酶所催化的显色反应, 观察转基因
植株的显色情况. 结果表明, CPK28 基因在植物萌发
的胚根、根、子叶、莲座叶、花和果荚中均有表达, 其
中在根和叶中的表达量最多 , 而且在幼嫩组织中表
达较强(图 3(a)).
2.1 节中的表型实验结果显示 CPK28 可能正向参
与了 NaCl 和甘露醇诱导的胁迫反应过程 , 那么
CPK28 基因的表达是否受 NaCl 和甘露醇的诱导? 本
研究分别对正常生长和胁迫处理 6 h 的拟南芥幼苗进
行定量 PCR 分析. 结果显示, NaCl 和甘露醇处理后,
CPK28 基因的表达量有所上调(图 3(b)), 表明 CPK28
基因受 NaCl 和甘露醇诱导表达. 本研究又进行了
GUS 染色实验, 结果显示, NaCl 和甘露醇处理后,
GUS 染色加深(图 3(c)), 表明 CPK28 基因受 NaCl 和
图 2 拟南芥野生型、CPK28基因突变体和超表达植株对 NaCl和甘露醇胁迫的表型分析和子叶复绿率统计数据
在含有 100 mmol L1NaCl 的 MS 培养基上生长 6 d 的幼苗表型(a)和子叶复绿率统计(b); 在含有 150 mmol L1 甘露醇的 MS 培养基上生长 6 d
的幼苗表型(c)和子叶复绿率统计(d). 每个处理约 90 株幼苗. 标准差为 3 次独立实验结果所得
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论 文
图 3 拟南芥 CPK28基因的组织表达以及对 NaCl及甘露醇
胁迫的响应分析
(a) CPK28 基因启动子驱动的 GUS 组织染色结果; (b) 定量 RT-PCR 检
测 CPK28 基因受 NaCl 和甘露醇胁迫后的表达情况. 正常生长 8 d 的野
生型拟南芥幼苗分别在含有 NaCl 和甘露醇的 MS 培养基上处理 6 h,
然后进行定量 RT-PCR 检测, Actin2 作为内参. 相对表达量的标准差为
3 次独立的定量 RT-PCR 结果所得; (c) CPK28 基因响应 NaCl 和甘露醇
胁迫的 GUS 染色结果. 正常生长 8 d 的转 GUS 基因植株分别在含有
NaCl 和甘露醇的 MS 培养基上处理 12 h, 然后进行 GUS 组织染色
甘露醇诱导表达, 与定量 PCR 结果一致.
2.3 CPK28蛋白定位于细胞质膜上
CDPK 家族的蛋白定位于多个细胞器中, 分别执
行特定的生物学功能[27]. 为了深入解析 CPK28 在应
答盐胁迫和甘露醇胁迫中的作用机制 , 本研究首先
通过转化拟南芥叶肉细胞原生质体瞬时表达方法来
确定 CPK28 蛋白的亚细胞定位, 结果表明带有 GFP
标签的 CPK28 融合蛋白定位于细胞质膜上(图 4(a1),
(a2)). 为了与 GFP 瞬时表达所获结果进行验证, 本研
究创建了带 GFP 标签的永久转基因植株, 检测转基
因植株根细胞中的 GFP 荧光分布, 结果发现 CPK28
定位于细胞质膜上(图 4(b1), (c1)). 为了进一步确认该
结果, 本研究又进行了根细胞的质壁分离实验. 结果
表明, 用 0.8 mol L1 的甘露醇处理后, 分布着 GFP 荧
光的细胞质膜与细胞壁发生了分离(图 4(b2), (c2)),
该结果进一步证明了 CPK28 定位于细胞质膜上. 本
研究还发现, 转空载 GFP 的对照植株发生质壁分离
的 时 间 要 少 于 转 CPK28 基 因 的 植 株 , 说 明 由 于
CPK28 基因的超表达, 植株增加了对甘露醇渗透胁
迫的耐受性.
2.4 渗透胁迫处理下 CPK28超表达植株中积累较
多的脯氨酸
植物可以通过调节细胞内渗透调节物质 , 如可
溶性糖、甜菜碱、脯氨酸等小分子有机物的含量来适
应干旱、盐等胁迫[28~30]. 为了探究 CPK28 参与盐、甘
露醇胁迫应答的生理学机制 , 本研究测定了不同材
料在胁迫处理后体内脯氨酸的含量 . 结果发现 , 用
100 mmol L1 NaCl 和 150 mmol L1 甘露醇分别处理
拟南芥幼苗 24 h 后, 植株体内脯氨酸的含量均明显
增加, 而且超表达植株和 cpk28-1 比野生型和 cpk28-2
体内积累更多的脯氨酸(图 5). 这些结果暗示在逆境
胁迫条件下, CPK28 基因的超表达引起了植物体内更
多的脯氨酸积累 , 这也解释了超表达植株更耐受胁
迫的生理机制.
2.5 盐胁迫和渗透胁迫相关基因的表达分析
目前在拟南芥中已经鉴定出了盐胁迫和甘露醇胁迫
应答过程中多个中间元件[31,32]. 为了解析 CPK28 参与
盐胁迫和甘露醇渗透胁迫的分子机制 , 本研究检测
了与胁迫反应相关的基因(包括转录调节因子、离子
转运体以及抗性小分子物质合成代谢相关的基因)在
野生型、超表达以及突变体中的表达情况 . 半定量
RT-PCR 结果表明, NaCl 和甘露醇处理诱导了胁迫相
关基因的表达上调, 但是在所检测的几种材料之间,
这些基因在转录水平上没有表现出明显差异(图 6).
我们推测, CPK28 可能与 CPK3[14]作用机制比较相似,
即激酶不是直接调节基因的转录水平 , 而是在蛋白
水平通过磷酸化下游底物来参与胁迫反应.
2.6 CPK28激酶的去磷酸化与 SDS-PAGE分析
Matschi 等人[33]报道 CPK28 与 CDPK 家族其他
2014 年 1 月 第 59 卷 第 1 期
56
图 4 CPK28蛋白在细胞中的定位
(a1) 转 pHBT-GFP-NOS 叶肉细胞原生质体的 GFP 荧光分布; (a2) 转 35S::CPK28-GFP 叶肉细胞原生质体的 GFP 荧光分布; (b1) 转永久 S1300-
GFP 植株根细胞的 GFP 荧光分布; (c1) 转永久 S1300-CPK28-GFP 植株根细胞的 GFP 荧光分布; (b2), (c2) 0.8 mol L1 甘露醇处理根细胞, 发生
质壁分离后的荧光分布
图 5 NaCl和甘露醇处理后拟南芥幼苗体内脯氨酸的含量
图 6 半定量 RT-PCR检测胁迫相关基因
正常生长 8 d 的拟南芥幼苗分别在含有 100 mmol L1 NaCl 和 150
mmol L1 甘露醇的 MS 培养基上处理 6 h, 然后进行半定量 RT-PCR
检测, Actin2 作为内参
成员一样, 是一种受钙离子调控的激酶, 且特定位点
氨基酸的磷酸化可以增强激酶的催化活性 , 但这些
位点的磷酸化是由其他激酶催化 , 还是由激酶自身
催化, 目前没有报道. 位于 CPK28 激酶区的 188 位天
冬氨酸是 CDPK 家族中保守性极高的氨基酸之一 ,
该位点可能为 ATP 结合位点, 突变后激酶完全没有
活性 [33]. 为了探讨磷酸化对蛋白的影响 , 本研究纯
化了带有 His 标签的 CPK28 蛋白和 188 位氨基酸突
变的 CPK28-D188A 蛋白, 通过 SDS-PAGE 分析激酶
的条带迁移变化. 结果如图 7 所示, 点突变蛋白 D188A
与野生型 CPK28 在凝胶中的迁移速率明显不同, 表
现为 D188A 迁移速率变快. 为了验证这种迁移率的
改变是否由于蛋白磷酸化造成的, 本研究将这 2 种蛋
白在体外进行了去磷酸化, 然后再进行 SDS-PAGE.
结果显示, 去磷酸化的野生型蛋白 CPK28 的迁移速
率 变 快 , 与 完 全 失 活 的 D188A 迁 移 率 一 致 , 而
D188A 去磷酸化后迁移速率不受影响(图 7). 根据这
种结果, 我们推测, 由于 D188A 没有激酶活性, 其不
能催化自身磷酸化 , 而且也没有外界激酶对其磷酸
化; 而野生型蛋白 CPK28 可以催化自身磷酸化.
3 讨论
已有研究表明, 拟南芥 CDPK 家族成员参与了
激素应答及非生物学胁迫诱导的多种信号转导过程,
例如, CPK4 和 CPK11 通过调控 ABA 信号途径参与
了植物对盐和干旱胁迫的反应 [11], CPK6, CPK10,
CPK21 以及 CPK23 通过调控保卫细胞质膜上的阴离
子通道介导了植物的抗旱反应[15~17], 而 CPK3 被证明
57
论 文
图 7 CPK28激酶的去磷酸化反应和 SDS-PAGE分析
一抗为抗 His 抗体. +表示进行了去磷酸化反应后再进行 SDS-PAGE,
表示没有进行去磷酸化反应
参与了不依赖于 MAPK 的盐胁迫反应过程[14]. 本研
究探讨了 CPK28 在多种激素处理和非生物学胁迫下
的生物学功能, 结果发现 CPK28 基因缺失导致拟南
芥幼苗对盐胁迫和甘露醇引起的渗透胁迫敏感 , 而
CPK28 超表达植株表现了更好的逆境耐受性; 基因
表达分析也显示, CPK28 的转录受盐胁迫和甘露醇胁
迫诱导 . 这些结果表明 CPK28 可能正向参与调节
NaCl、甘露醇等逆境胁迫所引起的植物应答过程. 本
研究检测了已知的胁迫应答基因以及逆境信号转导
途径中一些中间元件基因在野生型、cpk28 缺失突变
体以及超表达植株中的表达模式 , 发现这些基因在
所研究的几种基因型材料之间没有明显差别. CDPK
家族的另一个成员 CPK3 的研究结果表明 , 尽管
CPK3 参与了盐胁迫应答过程, 但已知的胁迫应答反
应基因的表达模式在野生型和 cpk3 突变体中没有变
化[14]. 从本研究的现有结果来看, CPK28 参与的盐胁
迫应答反应机制与 CPK3 相似, 即激酶可能不是直接
调节基因的转录水平 , 而是在蛋白水平上磷酸化下
游底物来参与胁迫反应 . 这些结果也印证了 CDPK
家族成员在功能上的冗余性和多样性.
拟南芥 CDPK 家族成员分别定位于多个细胞器
中, 如定位于细胞核中的 CPK4 和 CPK11 通过磷酸
化 ABA 信号途径中关键的转录因子 ABFs, 进而影响
基因转录水平来调控 ABA 信号途径[11]; 而定位于细
胞质膜上的 CPK23 则是与质膜上的离子通道蛋白互
作 , 进而改变离子通道蛋白的活性来调控信号传导
过程[17]. 利用瞬时表达 GFP 融合蛋白和构建转永久
GFP 融合基因的方法, 我们检测了 CPK28 的亚细胞定
位 , 两者的结果均证实 CPK28 定位于细胞质膜上 .
本研究没有发现 CPK28 通过转录水平调节胁迫应答过
程, 我们推测, 与定位于质膜上的 CPK3 相似, CPK28
可能通过调控下游蛋白的磷酸化水平来参与盐胁迫
应答反应[14]. 如果能找到 CPK28 作用的底物, 那将为
解析 CPK28 参与胁迫应答的分子机制提供直接证据.
植物通过合成一些小分子物质如可溶性多糖、甜
菜碱、脯氨酸等来增加植物对盐胁迫和渗透胁迫的耐
受性. 本研究发现, 在受到盐胁迫和甘露醇引起的渗
透胁迫时, CPK28 基因超表达植株体内的脯氨酸含量
高于野生型和突变体 , 该结果从生理水平上解释了
基因超表达植株具有更强的盐胁迫和渗透胁迫耐受
性原因. 然而, 植物是如何感知胁迫信号, 又是如何
通过 CPK28 参与的胁迫信号途径来调控脯氨酸的合
成和代谢, 这些机制和过程都还不清楚, 有待于下一
步的实验来解析.
Matschi 等 人 [33] 用 质 谱 方 法 检 测 了 植 物 体 内
CPK28 激酶的磷酸化位点和状态, 并证明了 CPK28
中特定氨基酸的磷酸化是激酶保持完全活性必需的,
但这些位点的磷酸化由其他激酶催化 , 还是由自身
催化, Matschi 等人的研究没有涉及. 本研究通过比
较野生型蛋白 CPK28 和没有激酶活性的点突变蛋白
D188A 在凝胶中的迁移速率, 首次发现没有激酶活
性的 D188A 的迁移速率比野生型 CPK28 快, 而脱磷
酸后的 CPK28 的迁移速率和 D188A 一致, 因此推测
蛋白磷酸化改变了其在凝胶中的迁移速率 , 而且这
种磷酸化是由激酶自身催化的(图 7), 即 CPK28 发生
了自我磷酸化. 综合本研究和 Matschi 等人[33]的研究
结果, 我们推测, CPK28 自我磷酸化可能与其激酶活
性密切相关. 根据 Wernimont 等人[34]的研究结果, 我
们模拟了 CPK28 的晶体结构, 通过分析发现某些特
定氨基酸的磷酸化可能对于其维持活性构象具有重
要作用. 我们设想, CPK28 激酶与钙离子结合后, 首
先催化自我磷酸化, 形成一种稳定的活性构象, 这种
构象对于其催化下游反应是必需的 . 上述假设的最
终解决, 对 CPK28 的激酶活性调节机制具有重要意义.
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