全 文 ：第3 5卷第 6期
2 0 0 6年2 1月
上海师范大学学报( 自然科学版)
佃m 目试 S肠切沙目 No m 回 Un iv e. iy t( Na U t司 c Sin e, )
V ol
.
3 5
,
N o
.
6
2 0 0 6
.
Dec
.
拟南芥中离子转运蛋白载体构建及烟草转化
钟晓丽 ,朱 骏 ,张永明
(上海师范大学 旅游学院 , 上海 2X() 234 )
摘 要 : 植物修复是利用植物富集重金属离子及其化合物 , 并通过组 织代谢去除环境污染物
的环境修复技术 . 克隆 了拟南芥中的两个金属离子转运蛋白墓因 ZA 几 和 IR n 并转化烟草 ,
经 PC R及 GU S 组织化学染色鉴定 , ZA 八 和 IR 几 基因都已整合进表达载体 ,并获得了 GU S 染
色阳性植株 . 这些工作为获得富集重金属离子的转基因烟草英定 了基础 ,将有效地促进植物修
复技术的发展和应用 .
关健词 : 植物修复 ;重金属离子 ;载体构建 ;烟草转化
中图分类号 : x5 05 文献标识码 : A 文章编号 : l姗一 37( 2以拓 )肠切87 伪
0 引 言
近年来 ,在矿产资源被大童开采利用 、工业生产迅猛发展和化学药品广泛使用的同时 ,重金属污染
已 日益成为威胁人类健康 ,影响人类生活质量的严重社会问题和环境问题 [’ ,2] .植物修复技术作为一个
低成本 、高效率 、非侵人 、符合审美观的技术 , 可部分解决这一问题并且备受人们的关注 〔’ ,’1 . 但 目前许
多用于修复的超量积累植物存在生长缓慢 、植株矮小 、地上部生物量小等不足难以大规模应用 . 目前 ,利
用转基因手段将重金属富集相关基因转人高生物量植物以改变其对重金属吸收 、转运 、积累和忍耐的机
制 ,从而提高植物对重金属的富集能力 . 植物吸收重金属离子和解毒的分子机制包括鳌合作用 〔’ 一 ’ ]及跨
膜转运蛋白的作用 〔10 一 16 .
迄今为止 ,拟南芥中部分重金属离子的转运蛋白已被克隆 . IR n 基因编码了一个 eF , ’ 转运蛋白 ,
在酵母中表达能提高其对 eF , ’ 的摄取作用 ,该基因是包括一个金属结合域的完整的膜蛋白 ,并且在铁
缺乏诱导下 ,在根中特异表达〔’ 7 ] , zA n 基因则是根据动物中同源的 zn T基因从 c D NA 文库中克隆到 .
该基因有 398 个氨基酸组成 ,包括了 6 个跨膜结构域 . 在高浓度的 z n Z + 培养基中 , 过量表达该基因的拟
南芥转基因植株对 zn Z + 有较高的耐受性 ,而且在其根部有大量的 zn Z` 积累〔’ . ] . 本研究从拟南芥中克隆
了 zA n 及 IR n ,将其 。D N A接上强启动子 35 构建到过量表达载体中 ,并转人烟草表达 , 以提高转基
因植物的超富集能力 ,并可利用此实验体系开发高效的转基因植物修复系统 .
1 材料与方法
1
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1 材料
1
.
1
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1 植物材料及质粒和菌种
烟草革新 l 号 ( N i e o t ian a abt a e u m v ar . eG x in N o . l ) (本实验室提供 ) .
收稿日期 : Z IX拓 J为一 12
作者简介 : 钟晓丽 ( 1982 一 ) ,女 ,上海师范大学旅游学院硕士研究生 ; 张永明 ( 19 58 一 ) ,男 ,上海师范大学旅游学院
教授 ,博导 .
上海师范大学学报 (自然科学版 ) 2以场 年
pR T I 2 2
,
pC ^ M B认 130 1 (本实验室提供 ) ·
E
. 。
01 D5H
a ,农杆菌 E H1A 05 (本实验室提供 ) .
1
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1
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2 工具酶与化学试剂
限制性内切酶和其他基因工程工具酶购自日本介 kan 。 公司 ,其他试剂为美国 is g m a 公司产品或国
产分析纯试剂 .
1
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2 方法
1
.
2
.
1 无菌苗的培养
烟草革新 1 号烟草种子用质量分数 70 % 的乙醇浸泡 1而 n ,无菌水洗两次 , 10 % 的次抓酸钠消毒
15 而n ,无菌水冲洗 3 一 5 次 ,在无菌滤纸上吸干残余水分 ,接于 12/ MS 培养基上 ,里于 26 ℃暗培养箱中 ,
待出芽后 t 于光照条件培养 ,每天光照 16 h , 光照强度 50 Em 一 2 5 一 ’ . 幼苗长大后取其叶片浸染 .
1
.
2
.
2 载体构建
首先 ,利用 TA IR ( h tP :刀~
. 肚曲 idon is
.
o gr )数据库下载了 ZA n 及 IR n 基因的 c DN A序列 ,设计
了特异性引物 :
IR n F
: CT A AA CA CA CA A CAA T CCAA A
IR n R
: CG g rA A T A侧刃℃A们叮 AA A AT A C
Z月n F : A T GG A GT C I .】℃AA G TCC CC
Z注n R : GA G AA T GCT G AT A CA AA A AC C
用拟南芥根部组织抽取总 RNA , AVM 反转录合成 c DNA
, 以此为模板 ,用天为时代公司的 1、 g 酶扩
增 zA n 及 IR n C D NA 序列 , CP R 反应条件为 94 ℃预变性 5而 n , 94 ℃变性 30 se c ; 52 ℃退火 40 se c ; 72 ℃
延伸 70 se 。 , 40 个循环 ; 72 ℃延伸 10 m in , 4℃ 保存 . cP R 产物直接与 pM 1D 8 一 T 载体相连 , zA n C
( IR n
。
)
一 T 的反向阳性质粒用 Sal l , Sm al 酶切 , 用 x h o l (与 S山 是同尾酶 ) , Sma l对中间载体 pR” 女2
进行醉切 ,用博大泰克回收试剂盒回收后连接 ,将 zA n c D NA 片段装人其 35 启动子后 ,转化大肠杆菌
感受态 ,用 Psd 将 35 5 启动子和 c DN A 一起切下 , 同时将 zA n oe ( IR ,’Oe ) 一 p R” 2[ 2 质粒和 p BA M -
c IA 130 1载体用 sP d 酶切 ,载体去磷酸化后将片段和载体回收 , 连接 ,转化大肠杆菌感受态 ,得到最终载
体 ZA n oe 和 IR n oe . 构建流程图参见图 1 .
劝 T l c (I盯 l e ) ~刊 , 知阅 反
S山 幽凹卫
上一一~ . . 奋 -一- ~P翻 1 口
P. t I 3“
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p肚代 I A130 1一 双 Tl c (】盯 Ic )
365 助 Tl e ( 1盯 l e ) 1习月 3绍 创 S
图 l zA 了 l oe 及 IR T l oe 级体构建流程
1
.
2
.
3 农杆菌介导的烟草转化
在新鲜的平板上挑取一个单菌落于 5耐 BL 液体培养基 (含 50 m岁 L 的 K a l l )中 , 28 ℃ Zo r/ m in 振荡
培养 24 h . 将 s d 菌液转人 50 血 的新鲜 BL 液体培养基 (含 50 m扩 L 的 K a n ) 中 , 继续振荡培养 , 直至
0】汤的 大于 0 . 5 小于 l ,将培养好的农杆菌菌液转人 50 d 离心管中 , 4以刃 r/ 而 n 离心 s m in 收集菌体 ;倒
第 6期 钟晓丽 ,朱 狡 , 张水明:拟南芥中离子转运蛋白载体构建及烟草转化
去上清 ,用液体 MS 培养基 50 一 l o iln 悬浮菌体 (悬浮时加人 sA 10 林M )半小时 ;把无菌烟草叶片切成
I c扩 小片放人农杆菌的 MS 悬浮液中 , 浸泡 30 一 40 m in ,取出叶片 ,用无菌滤纸上吸干菌液 , ! 于 M S + 6
一 B IA m g/ L + N AOA
.
l m岁 L + A sl o 卿 培养基上 , 26 ℃暗培养 d3 . 取出共培养培养基上的叶片 , 用无菌
水清洗数次 ,用无菌滤纸吸干残余水分 . 置于 M S + 6 一 B lA m以 L + N AOA . l m岁 L + K a n5 0 m岁 L + ce 0 0
m口L + Hy乡o m『 L 培养基上 . 16 h 光照培养 , 每两周继代一次 , 直至长出绿色的小芽 ,将小芽切下继续
在筛选培养基上培养 . 小芽成为单独植株后 , 于 M S + 6 一 BOA . s m岁 L + N A AO . l m岁 L + K asn o m岁 L +
Cef3 0 m岁L + Hy户O m岁 L 生根培养基上 . 待根长出 , 幼苗长至 sc m 左右时 ,将苗移人黑土和珍珠岩
( 3
:
l) 营养土中 .
1
.
2
.
4 转基因烟草的 CP R 检测
CTA B 法 〔” 〕抽提水稻叶片总 DN A . cP R 扩增潮霉素抗性基因片段 :引物 H F , 5 ’ 一 GA TC GT T AT GT T .
TA CT G G CAC T
一 3 ` ; HR , 5 ’ 一 TT G G CGA C CT CGT A TT G G
一 3 ` , PC R程序 : 94 ℃ 30 5 , 5 4℃ 30。 , 72℃ 30。 , 40 个
循环 ,产物大小为 so b .P
1
.
2
.
5 G US 染色方法
参照 eJ fe I’8o n 〔划等方法并做了适当改进 ,用二甲基甲酞胺把 x 一 lG u c 配成 20 m M 母液 , 50 m树 L 的
磷酸缓冲液 ( p7H . 0) 中含有 l m树 L 的铁氛化钾和 1 mW L 的亚铁佩化钾及 10 m M N a ZEDT ;A 按磷酸缓
冲液: 甲醇 : X 一 lG u C (40 : 10 ` l) 的比例配成染色液 . 取转基因烟草再生植株或少量叶片于 Ep ep dn 。迁
管中 ,把染色液加人管中 ,加的量以浸没材料为准 . 37 ℃染色 Zd ,用质量分数 70 % 的乙醇脱色数次 , 观察
染色结果 .
2 结果与分析
2
.
1 载体构建
根据 TA IR 数据库上拟南芥 ZA n 及 IR n 基因的 c D N A 序列设计引物 , 以野生型根部组织抽取总
R NA
,反转录后作为 RT 一 P CR 模板 . RT 一 PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段分别为 689 b p ,
124 1坤 ( 图 2 ) ,与理论值相一致 ; cP R产物直接与 pM 1D 8 一 T 载体相连 ,转化大肠杆菌感受态 , 长出克隆
后 ,挑取数个克隆于含有 A m p 抗生素的 BL 培养基中 , 37 ℃培养过夜后 ,抽取质粒 , 酶切鉴定有 6 89帅 ,
124 1bp 的片段 (图 3 ) ;然后用 T 载体上的 M 13 引物与 ZA n ( IR 几 )引物鉴定方向 ,将反向克隆测序 ,
测序结果正确 ; ZA n c ( IR n c ) 一 T 的反向阳性质粒用 Sal , Sm al 酶切 , 用 灿oI ( 与 Sal 是同尾酶 ) ,
枷aI 对中间载体 pR I ,皿 2 进行酶切 , 回收后连接 ,将 ZA 乃 ( IR 乃 。 ) c DN A 片段装人其 35 5 启动子后 ,转
化大肠杆菌感受态 , 长出克隆后 ,挑取数个克隆在含有 Am p 抗生素培养基 , 37 ℃培养 ,抽取质粒 ,用 sP d
将 35 5 启动子和 c D NA 一起切下 ,鉴定有 2 . I bK 和 1 . SbK 左右的片段 ,结果正确 (图 4 ) ,最后将 ZA n oe
( IR oeT )
一 p R IT 业2 质粒和 pBA M cI 1A 301 载体用 sP d 酶切 ,载体去磷酸化后将片段和载体回收 , 连接 ,
转化大肠杆菌感受态 ,长出克隆后 ,挑取数个克隆在含有 K a n 抗生素培养基中 , 37 ℃培养 ,抽取质粒 , sP -
tI 酶切鉴定同时有 1 肠及 2 . 1 ( 1 . 5) 肠 的片段 (图 5 ) ,得到最终载体 zA n oe 和 IR n oe . 并将它们转
人 EH A 105 农杆菌 . 待农杆菌长出克隆后 , 挑取克隆在含有 K a n 抗生素培养基中 , 37 ℃培养 , CP R 鉴定
结果 .
2
.
2 农杆菌介导的烟草转化
将转化后的烟草接人垫有一张灭菌滤纸 (以免农杆菌生长过旺 ) 的共培养基上 ,共培养 d3 洗菌后 ,
在筛选培养基上诱导芽的分化 , 1周后 , 叶面开始起泡 , 3 一 4 周后 ,新的愈伤组织在叶面伤口处形成 , 4 -
5 周后 , 出现从愈伤组织上分化出的新芽 , 当芽长到 1c m 左右时移到无任何激素的 MS 培养基上诱导生
根 , 5 ~ 6 周后 ,新根开始生出 , 等苗长到 sc m 时 ,移栽到土中生长 .
2
.
3 转荞因小苗的 P C R 分子鉴定
C T AB 法提取转基因烟草总 DN A , 用潮霉素基因上设计的引物及 ZA n 。 , IR IT 。 的特异性引物进
上海师范大学学报 (自然科学版 ) 2以巧年
119 b7 P
80 b5 p
5加 b P
M : 入DNA/ 钾 t l M kaz er
图 2 别 n e DNA及 RI n 。 DNA 代 R扩增片断
M : 入DNA/ ps d M kxa er
图 3 RI n 。 一 T及 Az n 。 一 T S目F Sm目 醉切鉴定
M : 入DNA/ P at l M kaz er M : 入DNA/ P s d M毗 er
图 4 扭 n 。 一 pR’ n 2 2及甜 n 。 一 pRl l 2 2 p. t l醉切鉴定 I朋 e l为 Az ” oe 的阳性克隆 ; hna 曰 为 130 1自连 ;
L切曰 , 4 为 IR n 二 的阳性克隆
图 5 甜 n oe 和 IR n oe 载体 .tP l 醉切鉴定
行 CP R 扩增 , 结果如图 6 和图 7 , 图 6 可以看到转基因烟草为模板的 PC R 产物电泳结果显示含有潮霉
素基因 s o bp 左右的条带 , 而野生型对照没有条带 ; 图 7 可以看到用 ZA n 。 , IR n c 的特异性引物 CP R
扩增都有目的条带而野生型没有条带 .
8 05 bP
5的饰
12 4 1b P
日蚝比 p
M : 入DNA/ sp t】M毗。
lj l l e l 以 。 ” oe 转基因小苗 D N A 为模板扩增结果 ;
L切心 以 扭 n 二转基因小苗 D N A 为棋板扩增结果 ;
肠汉口 以盯生型烟草 DN人为棋板扩增结果 ;
】』 . 目 为不加任何棋板的阴性对照
图 6 转基因植株分子鉴定
2
.
4 转甚因烟草的 G U S 组织化学染色
M :功NA/ p成 1 M alk er
L切 e l 以 劫 n oe 转基因小苗 DN A为棋板扩增结果 ;
L明以 以 IR n 二转基因小苗 D N A 为棋板扩增结果 ;
L切日 以野生型烟草 D N人为棋板扩增结果 。
图 7 转基因植株分子鉴定
第 6期 钟晓丽 ,朱 骏 ,张永明 :拟南芥中离子转运蛋白载体构建及烟草转化
参照 eJ fe sr on 等方法 ( 198 6) 并做了适当改进 ,进行 GU S 组织活性检测 ,结果如图 2 一 4 , 可以看到转
基因小苗的叶和茎组织中呈现蓝色或蓝色斑点 .
人 :左边 zA ” oe 小苗在叶和茎中呈现蓝色 ,右面为野生型 W l , 作为阴性对照
B :左边 IR n oe 小苗在茎中呈现蓝色 , 右面为野生型 胃T 作为阴性对照
图 8 转基因植株 GUS染色
组中
从 CP R及 G US 鉴定结果可以看出 ZA n oe 及 IR 八 oe 的 T 一 D N A 区段已经成功地插人了烟草基因 .
讨 论
在模式植物拟南芥中 , 已经克隆了一些重金属离子跨膜转运蛋白. 我们挑选了 z n 离子转运相关的
基因 ZA n 及与 eF 离子转运相关的基因 IR n ,将其 cD N A序列装在过量表达载体上 , 转人烟草中 , 目
前 ,已经得到了阳性的转基因烟草 ,为了观察野生型烟草和转化子在不同离子浓度下的耐受性 , 待植株
长大收种后 ,将过量表达这 2 个基因的转基因烟草种子在富含不同浓度的 z n , ` 和 eF Z ’ 的培养基或土坡
中筛选 ,并用原子吸收等方法来分析其根部组织的金属离子积累情况 ,进一步验证在烟草中过 t 表达的
ZA n 及 IR n 基因是否能有效地提高烟草对金属的超富集能力 .
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(贵任编挥 :任芳萍 )