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拟南芥中光信号系统中关键基因CRY1、CRY2和COP1启动子的表达模式分析



全 文 :植物生理学通讯 第46卷 第6期, 2010年6月 541
收稿 2009-12-29修定  2010-03-08
资助 国家自然科学基金(30830012)、中国科技部基金
(2006AA10A102)和国家转基因作物专项基金(2009ZX0
8009-081B)。
* 通讯作者(E-mail: hqyang@sjtu.edu.cn; Tel: 021-34206005)。
拟南芥中光信号系统中关键基因CRY1、CRY2和COP1启动子的表达模
式分析
汤淼, 杨洪全*
上海交通大学农业与生物学院, 上海200240
提要: 通过构建表达光信号系统关键基因CRY1、CRY2和COP1启动子与GUS融合基因的拟南芥转基因植株, 并对转基因
植株进行GUS组织化学染色的结果表明, CRY1、CRY2和COP1的表达模式不受光条件的调控, 并且在各器官有广泛的表
达。分别分析CRY1基因启动子在cop1突变体以及COP1基因启动子在cry1突变体遗传背景中表达模式的结果表明, CRY1
和COP1在转录水平上不存在明显的相互调控关系。
关键词: 隐花色素; COP1; GUS染色; 表达模式; 拟南芥
Analysis of Expression Patterns of CRY1, CRY2 and COP1 Promoters in
Arabidopsis thaliana
TANG Miao, YANG Hong-Quan*
School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200240, China
Abstract: Based on GUS histological staining results, we demonstrated that the expression of three key genes
in light signalling pathway, namely CRY1, CRY2 and COP1, were not regulated by light conditions in Arabidopsis
thaliana. We also showed that CRY1, CRY2 and COP1 were extensivly expressed in all organs of grown plants.
By analysing the expression pattern of CRY1 in cop1 mutant, and COP1 in cry1 mutant, we concluded that these
two genes may not regulate each other at the transcriptional level.
Key words: cryptochromes; COP1; GUS histological staining; expression pattern; Arabidopsis thaliana
拟南芥蓝光受体隐花色素(cryptochrome, CRY)
主要包括CRY1和CRY2, 它们在光信号调控植物
的一些生理功能过程中起关键作用, 这包括抑制下
胚轴的伸长、促进花色素苷的积累和子叶展开
(Ahmad和Cashmore 1993; Ahmad等1995; Lin等
1995, 1998; Jenkins 1997)、调节开花时间(Bagnall等
1996; Guo等1998; Mockler等2003; Liu等2008)、
调控气孔开放(Mao等2005)、气孔发育(Kang等
2009)以及生物节律性等(Mas 2005)。已有的CRY
家族蛋白结构的研究表明, CRY蛋白包括一个和光
裂解酶(photolyase)同源性很高的N端结构域
(cryptochrome N-terminal domain, CNT) (Sancar
2004), 以及同源性较低的C端延伸区(cryptochrome
C-terminal domain, CCT)。CCT为CRY的信号传
导功能区(Yang等2000), 而CNT在蓝光下能够形
成同源二聚体并由此激活CCT的功能(Sang等
2005; Yu等2007)。CRY1和CRY2均可定位于核
内, 但它们之间有差异。CRY2无论在光下或黑暗
条件下均在细胞核内(Kleiner等1999), 而CRY1在
细胞核和细胞质中都有定位(Yang等 2000)。
CRY的许多功能是通过与其他光受体共同作
用实现的, 包括红光/远红光受体光敏色素(phyto-
chrome, PHY)和蓝光受体向光素(phototropin,
PHOT), 而且往往涉及到下游的一些关键信号因子,
其中COP1是光形态建成负调控因子。COP1因其
突变体cop1在黑暗下具有组成型光形态建成表型
(constitutive photomorphogenic)而得名。COP1在
黑暗条件下定位于细胞核, 而光照条件下定位于细
胞质(von Arnim和Deng 1994)。定位于细胞核的
COP1具有E3泛素连接酶的活性, 能够促进某些光
植物生理学通讯 第46卷 第6期, 2010年6月542
形态建成正向调控转录因子如HY5的泛素化而降
解, 从而对光形态建成起负调控作用(Wang等
2001)。有研究表明, COP1作为CRY的下游因子,
能够通过与CCT1和CCT2相互作用, 起传递光信
号的作用, 并可能影响CRY1在细胞内的定位
(Wang等2001; Yang等2001)。另外, COP1还可
作为PHY、PHOT等光受体的下游因子, 在调节气
孔开放和开花时间中均起到关键的作用(Yi和Deng
2005; Kang等2009)。
综上所述, CRY1的活性、存在形式和亚细胞
定位均受光的调控, CRY和COP1的相互作用及
COP1的细胞定位也受光的调控。另外在蛋白质
水平上, CRY1稳定性不受光照强度调控(Ahmad等
1998), 而CRY2蛋白在蓝光下不稳定, 会迅速降解
(Lin等1998)。但到目前为止, 关于CRY1、CRY2
和COP1基因在不同的光照条件下以及在不同组织
器官中的表达模式还没有见到详细的研究报道。
为此, 本文将光信号系统关键基因CRY1、CRY2和
COP1启动子与GUS融合的植物表达载体分别导
入拟南芥, 获得转基因植株, 并对在白光(即全色光)
与黑暗条件下分别培养的转基因植株进行GUS组
织化学染色, 探讨CRY1、CRY2和COP1 3个基
因启动子在拟南芥中的表达模式。由于CRY1和
COP1蛋白的相互作用也暗示二者在基因转录水平
上可能存在相互调控, 本文通过分别分析CRY1基
因在cop1突变体以及COP1基因在cry1突变体遗
传背景中的表达模式, 研究二者在基因的转录水平
上是否存在相互调控。
材料与方法
拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)哥伦比亚生态
型(Col-0)以及CRY1突变体cry1-104 (Bruggemann
等1996)、COP1突变体cop1-4 (Deng等1992)种
子由本实验室保存。
启动子分析载体pCAMBIA1300-CRY1pro-
GUS、pCAMBIA1300-CRY2pro-GUS和
pCAMBIA1300-COP1pro-GUS由本实验室构建并
通过农杆菌转化方法得到相应的CRY1::GUS、
CRY2::GUS与COP1::GUS转基因植株(Kang等
2009)。利用转基因植株的潮霉素抗性进行筛选,
在第3代每种转基因植株分别得到3个纯合株系,
选取CRY1::GUS-2-4、CRY2::GUS-2-3与COP1::
GUS-2-1 3个纯合株系用来进行GUS染色。
转基因植株cry1-104 COP1::GUS由COP1::
GUS-2-1和突变体cry1-104杂交得到, 进行杂交实
验后, 杂交二代的幼苗再用潮霉素抗性筛选, 在杂
交三代中得到纯合株系cry1-104 COP1::GUS-2-1-
6进行染色实验。采用同样的方法得到cop1-4突
变体背景下的CRY1::GUS转基因植株并选取纯合
株系cop1-4CRY1::GUS-2-4-3进行染色实验。
拟南芥幼苗采用无菌培养, 将种子用20%漂水
加1~2滴Tween-20, 灭菌15 min, 灭菌后的种子在
超净台上用无菌水冲洗4次, 铺种于MS固体培养
基(含2%蔗糖、0.8%琼脂)上。在4 ℃冰箱中放
置3 d后, 分别放置在白光或黑暗下生长, 6~7 d后
(白光下幼苗长出第1对真叶)进行GUS染色实验或
种植入土中。植物生长的相对湿度为45%, 恒温
温度21 ℃。白光光照强度约为140 mmol·m-2·s-1,
光周期为全日照。
GUS染色时, 将需进行GUS染色分析的植物
材料浸没于GUS染液中(100 mmol·L-1磷酸缓冲
液、50 mmol·L-1高铁氰化钾、50 mmol·L-1亚铁
氰化钾、10 mmol·L-1 EDTA、5 mg·mL-1 X-Gluc和
0.1% Triton), 真空抽气15 min, 以去除材料内部的
气体。抽气后的材料置于GUS染液中于37 ℃恒
温下处理约5 h。对于含有叶绿素的幼苗和组织,
染色后用不同梯度(35%、70%和95%)乙醇作脱
色处理至材料中的原有色素全部脱去, 或颜色不再
改变为止, 最后对材料进行观察和拍照。
结果与讨论
1 CRY1、CRY2和COP1基因的表达模式不受光
照条件的调控
光照和黑暗处理的CRY1::GUS幼苗经GUS染
色处理后, 在黑暗处理下生长7 d的黄化苗中,
CRY1::GUS在子叶中有强而均匀的表达(图1-A),
下胚轴和根中CRY1::GUS的活性明显比子叶中弱,
而且表达主要集中在维管束中(图1-B、C)。而根
尖的GUS染色呈阴性(图1-D), 说明CRY1在根尖
不表达或表达量极小。CRY2::GUS在子叶中的表
达模式与CRY1::GUS基本上一致(图1-I), 但染色
更深, 说明其表达量更高; 下胚轴和根部CRY2::GUS
植物生理学通讯 第46卷 第6期, 2010年6月 543
图1 CRY1::GUS、CRY2::GUS与COP1::GUS转基因植株幼苗不同部位的GUS染色
Fig.1 GUS staining results of different parts in CRY1::GUS, CRY2::GUS and COP1::GUS tr nsgenic seedlings
A: 黑暗处理的CRY1::GUS幼苗子叶; B: 黑暗处理的CRY1::GUS幼苗下胚轴; C: 黑暗处理的CRY1::GUS幼苗根部成熟区; D: 黑
暗处理的CRY1::GUS幼苗根尖; E: 白光处理的CRY1::GUS幼苗子叶; F: 白光处理的CRY1::GUS幼苗下胚轴; G: 白光处理的CRY1::
GUS幼苗根部成熟区; H: 白光处理的CRY1::GUS幼苗根尖; I: 黑暗处理的CRY2::GUS幼苗子叶; J: 黑暗处理的CRY2::GUS幼苗下
胚轴; K: 黑暗处理的CRY2::GUS幼苗根部成熟区; L: 黑暗处理的CRY2::GUS幼苗根尖; M: 白光处理的CRY2::GUS幼苗子叶; N: 白
光处理的CRY2::GUS幼苗下胚轴; O: 白光处理的CRY2::GUS幼苗根部成熟区; P: 白光处理的CRY2::GUS幼苗根尖; Q: 黑暗处理的
COP1::GUS幼苗子叶; R: 黑暗处理的COP1::GUS幼苗下胚轴及根部; S: 黑暗处理的COP1::GUS幼苗根部成熟区; T: 黑暗处理的
COP1::GUS幼苗根尖; U: 白光处理的COP1::GUS幼苗子叶; V: 白光处理的COP1::GUS幼苗下胚轴; W: 白光处理的COP1::GUS幼
苗根部成熟区; X: 白光处理的COP1::GUS幼苗根尖。
的表达在维管束中最强, 而皮层部分的细胞也可见
到染色反应(图1-J、K)。总体而言, CRY2::GUS
的表达由上至下也呈减弱趋势, 但在根尖分生区的
局部表达较强(图1-L)。COP1::GUS的表达模式
与CRY1::GUS完全一致, 染色反应出现在子叶(图
1-Q)及下胚轴和根部的维管束(图1-R、S)中, 而根
尖中的COP1表达极少或不表达(图1-T)。
在白光处理下生长7 d的幼苗中, CRY1::GUS
植物生理学通讯 第46卷 第6期, 2010年6月544
在子叶中广泛表达, 其中以叶脉中的活性最高(图1-
E), 表明叶脉中CRY1表达量最高; 而在下胚轴及根
部, CRY1::GUS的染色反应比叶片中弱并主要集中
于维管束中(图1-F、G), 根尖中GUS染色呈阴性
(图1-H); CRY2::GUS在子叶中的表达模式与
CRY1::GUS相同(图1-M), 在下胚轴和根部的表达
主要集中在维管束中, 但部分皮层细胞也有明显的
染色反应(图1-N、O), 根尖中可以见到较强的表
达(图1-P); COP1::GUS与CRY1::GUS有同样的表
达模式, 染色反应广泛出现于子叶中并且在叶脉中
最强(图1-U), 在下胚轴和根部的表达集中于维管束
中(图1-V、W), 根尖处没有任何染色反应(图1-X)。
上述结果表明, CRY1、CRY2和COP1在下胚
轴和根部的表达模式与表达强度均不受光的调控,
在子叶中的表达模式也不受光照条件的影响。已
有研究表明, 光照与黑暗条件下的拟南芥幼苗中
CRY1蛋白含量相似(Lin等1996), 而CRY1的蛋白
含量不受光照条件的影响(Ahmad等1998), 据此可
以认为, CRY1基因在启动转录的水平上很可能也
不受光照条件的影响, 本文结果也证实了这一推
论。由于黄化苗的子叶细胞较小而且密度大, 因此
相对于白光下幼苗的子叶而言, GUS染色显示的
颜色更深, 至于二者的表达量是否存在细微差异, 尚
待精确的定量实验加以验证。
值得注意的是, 相对于CRY1和COP1, CRY2
有更为广泛的表达(如下胚轴和根部皮层细胞, 图1-
K、O), 特别是根尖中的CRY2有较高的表达水
平。Toth等(2001)用CRY1和CRY2的启动子与荧
光报告蛋白融合进行的研究表明, CRY2在根中表
达, 但检测不到CRY1在根部的表达。而Canamero
等(2006)的研究表明, CRY1和CRY2蛋白均在根中
表达, 并由此推测根中的CRY1和CRY2都能够转
录, 但CRY1的表达水平明显低于CRY2, 从而导致
上述试验中荧光蛋白信号无法检测, 本文从启动子
的表达水平证实了此种推论。此外还有研究报道,
在cry2突变体中用CRY2自身启动子启动表达的
CRY2-GFP融合蛋白在子叶、下胚轴和根部广泛
表达, 但在根尖处没有检测到荧光信号(Endo等
2007), 由于CRY2蛋白在光下的不稳定性, 因此认
为这种结果的不一致可能与光介导的CRY2基因表
达的转录后调控有关。
2 CRY1、CRY2和COP1基因在野生型拟南芥植
株的叶片和花器官中广泛表达
除了CRY1、CRY2和COP1基因在幼苗各部
位的表达以外, 本文又对相应成体植株不同时期的
叶片以及盛花期的花器官进行GUS染色的结果表
明, 在土壤中生长7 d (从种子吸涨算起14 d, 下同)
的CRY1::GUS植株中, 染色反应在幼嫩叶片的叶脉
和叶肉细胞均非常明显; 而在成熟叶片中, CRY1::
GUS的表达主要集中于叶脉中(图2-A)。CRY2::
GUS (图2-E)与COP1::GUS (图2-I)的表达模式与
CRY1::GUS一致。为避免GUS染色中可能出现的
不均匀而导致的偏差过大, 我们又取土壤中生长7
d植株的成熟叶片单独进行染色的结果显示,
CRY1::GUS (图2-C)、CRY2::GUS (图2-G)与
COP1::GUS (图2-K)均在叶脉及部分叶肉细胞中表
达, 其中以CRY2::GUS的表达为最显著。
土壤中生长10 d (从种子吸涨算起17 d, 下同)
的植株经完全相同的染色处理后的结果显示, 无论
是CRY1::GUS (图2-B)、CRY2::GUS (图2-F)还
是COP1::GUS (图2-J)均广泛表达于幼嫩叶片与成
熟叶片中, 其中CRY2::GUS在成熟叶片中的表达尤
为明显。
转基因植株花器官进行染色后, CRY1::GUS
(图2-D)、CRY2::GUS (图2-H)与COP1::GUS (图
2-L)显示出相同的表达模式。萼片各部分均有明
显的染色反应, 另外表达还集中在花丝和柱头附近
区域, 花瓣染色反应呈阴性。
总之, CRY1、CRY2和COP1三个基因在幼苗
及成体植株的各个器官中均有广泛表达。这表明
3个基因对植物的发育都有作用。其中CRY1和
CRY2蛋白在叶片、花、茎和根等不同器官中均
能检测到(Lin 等 1996, 1998), 但基因在这些部位中
表达模式的详细研究尚缺少报道。本文在基因转
录启动水平上揭示了其表达的广泛性, 并发现
CRY1、CRY2和COP1的基因表达存在普遍的重
叠, 这种表达重叠可能与CRY和COP1在蛋白水平
上的相互作用有一定的关系(Yang等2001)。
叶片是植物接受光信号的主要器官, 蓝光受体
CRY1和CRY2在叶片中的广泛表达有利于提高植
物对蓝光信号的感受程度, 而其他一些光受体基因
如PHYA和PHYB也显示出类似的表达模式(Somers
植物生理学通讯 第46卷 第6期, 2010年6月 545
图2 CRY1::GUS、CRY2::GUS与COP1::GUS转基因植株叶片和花器官的染色
Fig.2 GUS staining results of leaves and flowers of CRY1::GUS、CRY2::GUSand COP1::GUStransgenic plants
A: 在土壤中生长7 d的CRY1::GUS植株地上部分; B: 在土壤中生长10 d的CRY1::GUS植株地上部分; C: 在土壤中生长7 d的
CRY1::GUS植株成熟叶片; D: CRY1::GUS植株的花器官; E: 在土壤中生长7 d的CRY2::GUS植株地上部分; F: 在土壤中生长10 d的
CRY2::GUS植株地上部分; G: 在土壤中生长7 d的CRY2::GUS植株成熟叶片; H: CRY2::GUS植株的花器官; I: 在土壤中生长7 d的
COP1::GUS植株地上部分; J: 在土壤中生长10 d的COP1::GUS植株地上部分; K: 在土壤中生长7 d的COP1::GUS植株成熟叶片; L:
COP1::GUS植株的花器官。
和Quail 1995)。叶片中的这些光受体的信号传导
和相互作用参与控制许多生理过程, 如查尔酮合成
酶基因的表达(Wade等2001)和开花时间的调控
(Liu等2008)。
尽管CRY1、CRY2和COP1在开花期间的调
节中都有作用, 但这种调节主要与叶片对光信号的
感受有关(Kobayashi和Weigel 2007), 而且在cry1、
cry2和cop1-4等突变体中, 花器官均能正常发育并
产生可育的后代。至于CRY和COP1在花器官中
表达的意义, 尚待进一步阐明。
COP1作为一种E3泛素连接酶, 参与许多光信
号关键因子的泛素化降解过程并对植物发育有至关
重要的作用(Moon等2004)。而本文结果中COP1在
幼苗和成体植株中的广泛表达也可以反映出COP1
在植物各个生长时期和各个发育过程中的作用。
3 拟南芥CRY1与COP1基因在转录水平上缺少
明显的相互调控作用
cry1-104 COP1::GUS转基因植株白光下生长
植物生理学通讯 第46卷 第6期, 2010年6月546
7d的幼苗进行GUS染色, 结果显示, COP1::GUS
在子叶中广泛表达, 叶脉中的表达尤为显著(图3-
A、B), 下胚轴和根部的表达集中在维管束中(图3-
C、D), 根尖处染色反应呈阴性(图3-E)。这一结
果与其在野生型背景下的表达模式结果一致(前面
的结果和图1)。
将幼苗移栽到土壤中, 7 d后取其地上部分整
体染色的结果显示, 染色反应仅见于幼嫩叶片中(包
括叶脉和叶肉细胞)以及成熟叶片的叶脉(图3-F);
分离成熟的叶片进行单独染色后可以看到COP1::
GUS在叶脉及部分叶肉细胞中均有表达(图3-H)。
在土壤中生长10 d后的植株, 其染色结果与7 d时
的基本一致(图3-G)。盛花期花器官的染色反应出
现在萼片、花丝及临近柱头的区域(图3-I)。这些
结果均与COP1::GUS在野生型背景下的表达模式
一致(前面的结果及图2)。
总之, 从比较COP1在野生型和cry1突变体背
景下的表达模式中可以见到, COP1基因在转录水
平上的表达模式不受CRY1调控。至于CRY1是否
会对特定部位COP1转录水平的高低有较弱的调控
作用, 尚待精确的定量实验加以分析。
为了验证作为下游基因的COP1在转录水平
是否对CRY1存在反馈调控, 本文还对白光条件下
生长7 d的cop1-4 CRY1::GUS转基因幼苗进行了
GUS染色, 结果显示CRY1::GUS的表达集中在子
叶(图4-A)以及下胚轴和根部的维管束(图4-B、C)
中, 而在根尖处表达量极少或不表达(图4-D)。这
种表达模式与CRY1::GUS在野生型中的表达模式
图3 cry1-104 COP1::GUS转基因植株的染色
Fig.3 GUS staining results of cry1-104 COP1::GUS transgenic plants
A: 幼苗子叶边缘部分; B: 幼苗子叶中央部分; C: 幼苗下胚轴; D: 幼苗根部; E: 幼苗根尖; F: 在土壤中生长7 d的植株地上部分; H:
在土壤中生长7 d的植株的成熟叶片; G: 在土壤中生长10 d植株地上部分; I: 盛开期花器官。
图4 cop1-4 CRY1::GUS转基因植株的染色结果
Fig.4 GUS staining results of cop1-4 CRY1::GUS tran genic plants
A: 子叶; B: 下胚轴; C: 根部成熟区; D: 根尖。
植物生理学通讯 第46卷 第6期, 2010年6月 547
相同(前面的结果及图1)。然而本文采用的cop1-4
突变体为COP1功能弱化突变体(完全丧失COP1功
能的突变体在幼苗期死亡)(Stacey等2000), 这种残
存的COP1功能会不会对本文结果产生干扰, 尚无
法确定, 但可以肯定的是, COP1对于幼苗中CRY1
在转录水平上的表达模式没有明显的反馈调控作
用。
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