全 文 ：2011年 月
第 卷 第 期
四川大学学报 自然科学版
, 一
拟南芥谷氨酞 合成酶同其相互作用
蛋白 的转录水平分析
张皖蓉 , 文国琴 , 童仕波 , 李旭锋 , 杨 毅
四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室 , 成都
摘 要 本研究在基于前期对拟南芥 电压依赖性阴离子通道蛋白质 与 谷
氛酞 合成酶 两种基因的过量表达和抑制表达转基因突变体株系的初步生理性状分析
基础上 ,对筛选获得的转基因 代植株以及拟南芥 、 突变株 ,进行转录水平两种蛋
白特异性基因片段的地高辛标记 杂交以及半定量 一 分析 结果显示 ,在拟南
芥 、 突变株中 , 和 两种基因的转录表达均收到不同程度的抑制 而
与 两种基因之间存在间接或直接的正调控关系 ,进一步证明了两种基因在
转录水平上存在着密切联系
关键词 谷氨酞 合成酶 半定量分析 杂交
中图分类号 文献标识码 文章编号 一 一 一
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一
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引 言
谷氨酞 合成酶 属于氨酞
合成酶家族 ,结构上是具有多个亚基的蛋白
质 ,具有催化 结合氨基酸 、促进 的成
熟和校正等作用 不同的氨酞 合成酶其作
用各不相同 , 幻
脱落酸 记 是一种重要的植物激
收稿 日期 一 一
基金项目 国家自然科学基金 ,
作者简介 张皖蓉 一 ,女 ,四川成都人 ,硕士 ,主要研究方向为植物遗传与分子生物学 一 。
通讯作者 杨毅 一
四川大学学报 自然科学版 第 卷
素 ,其广泛存在于植物和真菌中 在细胞活动
中发挥着很多重要的作用 ,主要集中在两个方面
调节包括种子的休眠 、萌发 、气孔开闭和植物生长
等在内的植物发育过程 参与多种胁迫应答 ,如干
旱 、盐渍和寒冷等 ,在胁迫作用下 ,主要表现为影响
气孔关闭 、抑制种子萌发 、根的生长等方面〔一〕
功能精确的发挥依赖于生物体内一个复杂的
调控系统 ,有关 信号转导分子机理研究一直
是本领域的一个热点问题
在研究 信号通路的过程中 , 发现
作为 信号途径元件 的相互
作用蛋白质 ,参与了 代谢和信号途径 ,是
信号途径中的重要调节因子 其作用主要
有两点 一 、与 和 进行相互作用 ,
对 诱导的气孔关闭起负调控 ,
能与 形成复合物 ,抑制它的活性 ,影
响信号转导 二 、在转录水平上 , 的转录
要依赖于 和 因此 ,进一步研究
和 的相互作用 ,阐明 途径和氨酞
合成酶间互作机制 ,对 途径和氨酞
合成酶两个研究领域有重要意义
酵母双杂交系统是筛选和鉴定相互作用蛋白
质的有效方法 , 和 已经利用
该系统成功地筛选和鉴定出 信号传导过程
中新的信号分子 ,并证明它们在 信号途径中
的作用 ,川 本实验室利用酵母双杂交系统从拟
南芥 表达文库中筛选出与 相互作
用的蛋白质 ,在 网站上对筛选出的序列进行
蛋白质序列对比得出所筛选的序列为电压依赖性
阴离子通道蛋白质 一 。
的基因序列 并构建了 基因的原核表
达载体 、真核过量和抑制表达载体 ,采用农杆菌介
导的花序浸染法 〕将其转化到拟南芥中 ,得到了
转基因过量表达株系和抑制表达株系
前期研究中已经对其初步的生理性状进行了
分析 ,发现 的过量和抑制表达能影响拟南
芥植物气孔的关闭和种子的萌发 , 过量表
达导致植株对 敏感 ,而 的抑制表达则
降低植株对 的敏感性 本实验利用已获得的
过量和抑制表达株系以及 过量
和抑制表达株系 ,对其 转录水平进行了分
析 ,本研究为进一步揭示 相互作用的蛋
白质 在 应答中的功能和作用提供了
理论依据
试验材料与方法
材 料
植物材料
野生型拟南芥 。 “, 。 ,
代 过量和抑制表达转基因种子 ,
过量和抑制表达转基因种子以及拟南芥
、 突变株种子均由本实验室保存
生化试剂 、反转录试剂盒 、 反应试剂
为 公司产品 ,琼脂糖为
公司产品 ,其余均为国产分析纯试剂 以地高辛标
记的 杂交试剂盒
为 公
司产品 ,其它常规分子生物学试剂均购自成都博瑞
克生物技术公司
方 法
转基因植株的筛选和检测
将 , 代 过量和抑制表达转基因种子
以及 过量和抑制表达转基因种子于 ℃
春化 后 ,置于 · 一`上培养 ,
后种子发芽 ,一周后观察生长情况 分别挑取阳
性苗转移至土壤栽培 ,待植株发育至一定阶段后 ,
取 与 转 基 因植 株 叶片 提 取 总
,用 引物和 基因特异性引
物或 基因特异性引物搭配 ,按照 《分子克隆
手册 》步骤进行 检测阳性植株 单株收筛选出
的阳性苗 几 代种子 ,用同样的方法再次筛选最终
得 代种子
转基因植物半定量 分析
选取野生型植株 与 过量表达株
系 一 、 一 、 抑制表达株系
一 一 、 一 一 、 过量表达株系
、 一 、 抑制表达株系 一 、
各两种及 、 突变株采用 试剂盒提
取总 ,取 拜 检测 完整性 再采用反
转录试剂盒以 为引物 ,合成 。 ,按说
明书操作 ,合成 第一链 ,于一 ℃中保存
然后采用已设计好的 、 、 、
四个基因和内参 的半定量 引物 见下
表 ,按照 《分子克隆手册 》步骤进行 、
、 的最佳退火温度分别为 ℃、
℃、 ℃ ,循环数除 为 个外 ,其余都为
个 平行测定 次 ,取各基因表达量的平均值
第 期 张皖蓉等 拟南芥谷氛跳 合成酶同其相互作用蛋白 的转录水平分析
表 、 、 、 一、 的半定 引物
一 一 、 、 、 、
基因 半定量引物 扩增长度
上游引物 一 一
下游引物 气 一
上游引物 气 一
下游引物 七 一
上游引物 一 一
下游引物 一
转基因植物 杂交分析
采用异硫氰酸肌法大量提取上述植株总
,取 拼 检测 完整性 取野生型
以 为引物合成的 ,按照
说明书的步骤 ,采用上表中 和 的特
异性引物进行 ,纯化后获得的特异性片段分
别用地高辛标记为探针 ,对探针标记效率进行检
测 ,确定杂交浓度为
用紫外分光光度仪对所提取总 进行定
量测定 ,平行测定 次 ,取其平均值后 ,将变性胶上
样量定为 拼 电泳 后 ,将变性胶依
次用 水 、 溶液
、 水 漂洗 ,剪取与胶相同大小的
正电荷尼龙膜一同在 中浸泡 用
进行转膜 此后依据试剂盒说明书步骤进行
杂交
结果与分析
拟南芥转基因筛选植株的鉴定
将实验室保存的 和 过量表达
和抑制表达转基因拟南芥种子消毒后在
固体培养基上进行筛选得到转基因植
株阳性苗 见图
图 培养基上筛选的 转基因植物
箭头所指的是 过量表达 和抑制表达 的阳性转基因植物
对 两种转基 因植株总 进行 检测 ,
证明实验室保留并种植的仍为含 或
两种基因且插人方向正确的转基因植株
引物同 基 因或 基因上 、下
游特异性引物配对分别对阳性植株 代进行初
步检测 ,通过 扩增和电泳检测 ,前者获得
的条带 图 ,后者获得 的条带 图 ,
说明说明两种转基 因植物中的基 因片段均保留完
好并且插人方向无误 为了保证转基因植株纯合子
的后续研究 ,本实验继续对转基因 代种子进行
筛选 ,播种于 · 一`固体培养基
上培养 ,并选择生长良好的 代阳性苗移栽至土
壤中继续培养
半定量 一 分析
通过酵母双杂交筛选出的谷氨酞 合成
酶相互作用蛋白— 电压依赖性阴离子通道蛋白
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,其在 信号通路中存在着尚待突破的
重要意义 本实验的目的旨在对两种具有相互作用
的蛋白基因序列在相对转基因植株中的 进
行半定量 ,去发现两者在转录水平上的相互作用
一一
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图 转基因植株的鉴定 图 转基因植株的鉴定
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图 、 突变株与 、 转基因植株在 特异性引物在的转录表达量
,
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图 、 突变株与 、 转基因植株在 特异性引物在的转录表达量
,
实验结果显示在 、 突变株中 ,
与 两种基因的转录表达均受到不同程度的
抑制 图 、 在过量表达的 转基因株系
中 ,其 基因的转录表达与其抑制表达株系
相比较高 ,同样的 ,在过量表达的 转基因株
系中 ,其 基因的转录表达与其抑制表达株
系相比较高 表明在转基因拟南芥植株中 ,这两种
基因在转录水平上呈现出了相对一致的状态
分析
杂交是通过将 转移 到固相载
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参考文献 〕 , ,
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〔 〕 ,
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贾捷 , 金由辛 氨酞 合成酶的分子网络和功
能 〕 生物化学与生物物理进展 , ,
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〔责任编择 白林含