全 文 ：研究报告
Research Report
拟南芥和水稻非特异脂质转运蛋白的分子进化、表达模式以及在花药发育
中的功能分析
黄岳 朱璐 罗人和 张大兵 许杰 *
上海交通大学,生命科学技术学院,上海, 200240
*通讯作者, xujie3000@sjtu.edu.cn
摘 要 植物非特异脂质转运蛋白(non-specific lipid transfer proteins, nsLTPs)是一类小分子碱性蛋白，该
蛋白家族在植物的角质蜡质形成、信号转导以及生殖发育等方面发挥了重要的功能。目前植物中已经克隆
出几十个 nsLTPs基因并对它们开展了初步的功能研究，但对该基因家族在拟南芥和水稻中的基本信息、
分子进化、表达模式和功能预测方面进行系统对比的数据仍很欠缺。本研究尝试利用生物信息学的方法，
通过对比分析 45个拟南芥和 49个水稻 nsLTPs基因的亚家族分类、基因复制、蛋白结构、表达模式和功能
预测等信息，初步阐明 nsLTPs基因家族在单双子叶中可能存在的进化、表达模式和功能上的差异。同时以
花药发育过程为例，细致分析了 nsLTPs不同亚家族基因在花药发育过程中表达水平的变化，从而推测各
个亚家族蛋白在花药发育不同时期的功能。本研究以期为 nsLTPs将来在植物育种和遗传学中的应用研究
提供理论基础。
关键词 脂质转运蛋白,分子进化,表达模式,花药发育
Evolutionary and Expression Profile Analysis of the Non-specific Lipid
Transfer Proteins Genes Superfamily in Arabidopsis thaliana and Rice
(Oryza sativa)
Huang Yue Zhu Lu Luo Renhe Zhang Dabing Xu Jie *
School of Life Sciences and Biotechnology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai, 200240
* Corresponding author, xujie3000@sjtu.edu.cn
DOI: 10.13417/j.gab.034.001510
Abstract Plant non-specific lipid transfer proteins (nsLTPs) are a group of small basic protein, which play important
roles in the formation of wax and lipid, signal transduction and plant reproduction in plants. Although dozens of
nsLTPs genes have been cloned in the pasted ten years, but the comprehensive analysis of their classification,
molecular evolution and function is very lack. In this study, subfamily classification, gene structure, sub-cellular
localization and chromosomal location of all known nsLTPs in Arabidopsis thaliana and rice (Oryza sativa) were
analyzed by bioinformatics tools. Moreover, comprehensive expression profiles in different tissues and development
stages during the plant life cycle in Arabidopsis thaliana and rice were investigated. The results indicated that the
nsLTPs genes had diversification during plant evolution. Furthermore, we focused the analysis on the expression of
a subfamily of nsLTPs genes and their possible function during the anther development. Our results provide a
framework for future analysis of nsLTPs genes in defining their roles during plant development.
Keywords nsLTPs, Molecular evolution, Expression profile, Anther
基因组学与应用生物学，2015年，第 34卷，第 7期，第 1510-1521页
Genomics and Applied Biology, 2015, Vol.34, No.7, 1510-1521
基金项目：本研究由国家自然科学基金面上项目(31000593, 31370026和 J1210047)资助
植物非特异脂质转运蛋白 (non-specific lipid transfer proteins, nsLTPs)是一类分布广泛、种类繁多
的小分子碱性蛋白，其在植物体内占总可溶性蛋白的
4%左右(Kader, 1996)。植物大部分 nsLTPs都具有保
守的 8半胱氨酸残基模体(C-Xn-C-Xn-CC-Xn-CXC-
Xn-C-Xn-C)形成的 4个二硫键；以及大部分 nsLTps
还都含有从 N段起始、长度为 21个到 29个氨基酸
残基形成的信号肽，控制 nsLTPs进入特定的分泌途
径(Douliez et al., 2000)。目前已经证明 nsLTPs主要
是通过结合酰基链的形式，协助脂质转移，从而参与
膜的生成，同时还参与细胞内脂质在不同细胞器膜
间的转运(Jung et al., 2005)。
目前的研究结果表明，植物的 nsLTPs主要在
胚、茎、叶等的表皮细胞，果皮等富含角质层的部位
以及花药的绒毡层细胞部位大量表达(Zhang et al.,
2008; DeBono et al., 2009;王满等, 2013)，相对应其
表达部位，也已经证明 nsLTPs在植物表皮脂类物质
的合成和胚胎发生、抑制多种病原菌、协助植物应答
环境胁迫以及植物生殖发育方面都起到主要的作用
(Kader, 1996; Kie覥bowicz-Matuk et al., 2008; DeBono
et al., 2009; Safi et al., 2015)。植物 nsLTPs对于角质
层的合成是必须的，它参与了植物部分器官保护性
疏水层的形成，尤其是参与了蜡质的合成与运输
(Hamilton, 2004)；nsLTPs还参与了植物细胞壁的伸
长过程，它与脂类物质的亲和能力对植物细胞壁的
伸长有重要作用(Nieuwland and Feron, 2005)；还有植
物果实成熟过程中 nsLTPs可以促进聚半乳糖醛酸
酶的转化，从而促进果胶的降解，完成果实的熟化
(Tomassen, 2007)；此外，在胚乳细胞储存的养料耗尽
的程序性死亡过程中，nsLTPs可以充当蛋白酶抑制
剂的角色，使周围组织如子叶等免受降解(Eklund
and Edqvist, 2003;唐征和杨凯, 2010)。
在植物生殖发育方面，已经证明 nsLTPs对于植
物的雄性生殖发育(花药的发育和花粉的形成)也有
着重要的作用(刘芳和卢长明, 2013)。比如，已经发现
了拟南芥、水稻和玉米中的大部分Ⅲ类和部分Ⅰ类
nsLTPs都可以在花粉母细胞到小孢子的发育过程中
在绒毡层内高度选择性表达，根据信号肽信息和免
疫胶体金实验，表明 nsLTPs将经由分泌途径进入药
室，被证明参与了花药壁的形成(Lauga et al., 2000)；
但在小麦中有些Ⅲ类 nsLTPs被证明仅在种子和幼
苗的几个发育阶段表达(Boutrot et al., 2005)；此外，
也有证据说明有些 nsLTPs是花粉粘附到柱头所必
须的(Liu and Lu, 2013)。
尽管目前通过正向遗传学的方法，研究者们已
经克隆出几十个植物 nsLTPs 基因并对它们的功能
有了初步探讨，但在系统对比研究拟南芥和水稻中
nsLTPs的分子进化、基因表达和功能预测方面仍很
欠缺。本研究从生物信息学的角度出发，围绕拟南芥
和水稻 nsLTPs可能的分子进化、蛋白功能和表达分
布的异同展开探讨，尤其以花药发育为例，细致分析
和推测花药发育中的不同亚家族 nsLTPs 基因在生
殖发育过程中不同时期的生物学功能，以期为将来
研究 nsLTPs在植物中的遗传学功能、以及雄性不育
应用提供相应的理论依据。
1结果与分析
1.1 拟南芥和水稻 nsLTPs 基因数据汇总信息和亚家
族信息
通过数据库分析，我们查找到 45个拟南芥和
49 个水稻 nsLTPs基因，它们的具体基因亚家族分
类、蛋白编号、蛋白大小、内含子大小、信号肽位点和
亚细胞定位等信息如表 1所示。
我们将与 nsLTPs同源性超过 30%的基因归为
一个家族(Boutrot et al., 2008)，并以此为依据把 45个
拟南芥和 49个水稻 nsLTPs分成了 10大类(Ⅰ~ Ⅸ
和 Y)亚家族(表 1)，我们可以看出，拟南芥和水稻的
Ⅰ类和Ⅱ类是属于成员数目较多的亚家族，拟南芥
中Ⅰ类和Ⅱ类分别有 12和 15个成员(共占该家族的
60%)，水稻中Ⅰ类和Ⅱ类分别有 20和 13个成员(共
占该家族的 67%)。其它亚家族蛋白数目都较少，拟
南芥中 18个和水稻中 16个 nsLTPs被不等的分布
到从Ⅳ类到Ⅸ类这 7个家族中(表 1)。除此以外，还
有几个家族成员由于和其它 nsLTPs成员表现出的一
致性低于 30%，因此他们被单独分为亚类，主要包括
拟南芥中的 AtLtpY1、AtLtpY2、AtLtpY3 和 AtLtpY4
和水稻中的 OsLtpY1、OsLtpY2和 OsLtpY3。
在分子量方面，nsLTPs 的大小和其亚家族分
类并不完全一致(表 1)，大部分植物的 nsLTPs的分
子量都比较小，除了水稻中的 OsLTPI.6 (分子量为
12 297 kD)外，拟南芥和水稻 nsLTPs的分子量通常
都在 6~10 kD之间。此外，在内含子分布和亚家族之
间，二者也不完全一致，水稻中的Ⅱ类和 IV类家族
不含有内含子，Ⅲ类和Ⅷ类家族内含子均为 200 bp左
右，其余亚家族内含子大小差距较大 (为 84~2 851 bp
区间)；而在拟南芥中Ⅱ，Ⅷ和Ⅸ类均不含有内含子，
Ⅰ类和 Y类含有的内含子差距较大(为 94~74 121 bp
区间)，其余亚家族含有的内含子差距较小(为 79~315bp
区间) (表 1)。
拟南芥和水稻非特异脂质转运蛋白的分子进化、表达模式以及在花药发育中的功能分析
Evolutionary and Expression Profile Analysis of the nsLTP Genes Superfamily in Arabidopsis thaliana and Rice (Oryza sativa) 1511
基因组学与应用生物学
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g5
24
15
);A
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tp
Y.
3(
A
t4
g0
85
30
);A
tL
tp
Y.
2(
A
t1
g6
42
35
);A
tL
tp
Y.
4(A
t4
g2
83
95
)
蛋
白
大
小
(a
a)
Si
ng
le
pe
pt
id
e
(a
a)
91
~1
20
67
~7
9
68
,6
9
76
~8
2
91
~9
7
81
~1
03
10
5
10
2
10
4~
10
9
89
~9
5
64
~7
9
64
~6
7
74
~7
7
91
,9
2
86
~9
0
90 77
,9
0
92
~1
20
注
:*
蛋
白
定
位
一
栏
中
,E
:内
质
网
;G
:高
尔
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体
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胞
质
膜
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泡
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i:
微
体
;M
:线
粒
体
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绿
体
;C
y:
细
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质
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:细
胞
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N
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1512
拟南芥和水稻非特异脂质转运蛋白的分子进化、表达模式以及在花药发育中的功能分析
Evolutionary and Expression Profile Analysis of the nsLTP Genes Superfamily in Arabidopsis thaliana and Rice (Oryza sativa)
我们已经知道大部分 nsLTPs都符合 8个半胱氨酸
残基 Cys1-Xn-Cys2-Xn-Cys3Cys4-Xn-Cys5XCys6-
Xn-Cys7-Xn-Cys8 形成的高度保守位点的模式，但
拟南芥中的 AtLTPI.1 和 AtLTPII.10 表现出了不同
的模式，它们分别缺失了 Cys8和 Cys6；此外(Boutrot
et al., 2008)，部分 nsLTPs也出现了额外的半胱氨酸
残基，比如水稻 OsLTPIV.1和 OsLTPIV.2中的 Cys2
和 Cys3之间，OsLTPVI.1、OsLTPVI.2、OsLTPVI.4和
AtLTPII.10 中的 Cys6 和 Cys7 之间，以及拟南芥
AtLTPII.6的 Cys7后面和 OsLTPVII.1的 Cys8后面
都有一个额外的半胱氨酸残基(Boutrot et al., 2008)。
1.2拟南芥和水稻中 nsLTPs的亚细胞定位和蛋白结
构分析
植物 nsLTPs作为脂类物质运输的转运载体，它
们不同的亚细胞定位将决定其可能具有的生物学功
能。如表 1所示，拟南芥中几乎所有的 nsLTPs成员
(除了 AtLTPII.8外)都有内质网中的定位信号肽，因此
推测拟南芥的 nsLTPs可能参与了内质网中脂类物质
的合成和运输；拟南芥 nsLTPs还定位在液泡、细胞质
膜和高尔基体中，推测其可能参与脂类代谢产物的
加工；此外，AtLtpI.8、AtLtpII.5、AtLtpII.9、AtLtpIII.2、
AtLtpY.2和 AtLtpY.3在微体中也有定位，这些蛋白
可能参与微体的催化功能；AtLtpII.8 定位在叶绿体
中，可能位于叶绿体膜，与光合作用相关；AtLtpY.3在
细胞质中，可能参与到细胞内生物膜间的脂类物质运
输。以上说明拟南芥 nsLTPs不同亚家族之间的功能
在不同亚细胞之间的定位和功能是存在差异的。
进一步分析水稻 nsLTPs的亚细胞定位结果，我
们发现水稻不同亚家族之间也存在一定差异(表 1)；
水稻Ⅰ类 nsLTPs的亚细胞定位显示，其分布很广
泛，在内质网、高尔基体、细胞质膜、液泡、叶绿体、线粒
体、微体(OsLTPI.8, OsLTPI.10)，甚至细胞核(OsLTPI.7,
OsLTPI.8, OsLTPI.10和 OsLTPI.15)中都有发现，这表
明Ⅰ类 nsLTPs在水稻的许多位置都发挥其转运脂
类物质的功能；相对而言，Ⅳ、Ⅶ和Ⅷ类 nsLTPs在水
稻中只定位于内质网和液泡中，推测其功能可能相
对单一；此外，Ⅱ类、Ⅲ类、Ⅴ类和Ⅵ类 nsLTPs定位
于内质网、高尔基体、液泡、线粒体和微体中，这类亚
家族基因的功能可能也较为特异，与所在的细胞器
的功能密切相关。
我们进一步对比分析了水稻和拟南芥 nsLTPs
的不同亚家族之间的蛋白结构，结果表明(图 1)，水
稻和拟南芥中大部分 nsLTPs都含有一个信号肽和
一个脂质转运功能结构域(AAI结构域)，水稻中信号
肽长度为 1~46 aa，拟南芥中信号肽长度为 1~60 aa。
此外，不管水稻还是拟南芥，Y类 nsLTPs都含有一
个 SCOP (structural classification of proteins)结构域，
这与其它亚家族基因有较大的差别。
图 1水稻和拟南芥脂质转运蛋白家族基因的蛋白结构
注: A:水稻脂质转运蛋白家族基因的蛋白结构; B:拟南芥脂
质转运蛋白家族基因的蛋白结构; AAI (trypsin-alpha amylase
inhibitor):脂质转运功能结构域; SCOP (structural classification
of proteins):一个氨基酸序列
Figure 1 Protein structure of nsLTPs in Rice and A. thaliana
Note: A: ns-Ltp protein structure of Rice; B: ns-Ltp protein struc-
ture of A. thaliana; AAI (trypsin-alpha amylase inhibitor): func-
tional domain of lipid transfer; SCOP (structural classification of
proteins): an amino acid sequence
1.3拟南芥和水稻nsLTPs的 GO功能预测分析
我们进一步对水稻和拟南芥的 nsLTPs 基因进
行 GO富集分析，结果表明(图 2)，在细胞组分分类
中，拟南芥 nsLTPs主要富集在细胞组件特别是内膜
系统的生物学过程 (GO:0005575)中，推测拟南芥
nsLTPs可能与内膜系统密切相关；而在分子功能部
分的 GO分析中，表明水稻和拟南芥的脂质转运蛋
白都在结合富集(GO:0003674)、特别是脂质结合上
可能具有重要功能；在生物学过程部分的 GO分析
中，nsLTPs主要集中于脂质分子的定位和运输过程
中(GO:0008150)，比对拟南芥和水稻的 GO富集结果
表明，拟南芥的 nsLTPs在生物学过程中参与程度较
高，说明拟南芥和水稻二者存在一定的差异，这种差
异可能是基因进化的结果，也有可能是因为水稻数
据库的完善程度低于拟南芥数据库，结果还需要进
一步分析。
1.4拟南芥和水稻 nsLTPs家族在染色体的分布和基
因簇
为了解拟南芥和水稻 nsLTPs家族的成员的在
染色体上的分布，我们分别对拟南芥和水稻 nsLTPs
1513
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
家族基因进行染色体的物理定位，结果表明，拟南芥
的 nsLTPs家族基因在各个染色体上的分布较为均
匀，5 个染色体上的基因数目分别为：10、7、10、5、
17个，其中 4号染色体上最少，5号染色体上最多；而
水稻 nsLTPs在染色体上的分布并不均匀，其中在 1、
10、11和 12号染色体上分布较多，总共分布了 33个
家族基因(占总基因的 67%)，其它染色体分布较少(1~
4个基因)，在 2号染色体上没有 nsLTP基因(图 3)。
此外，根据 nsLTPs家族基因在染色体的物理定
位，我们还发现多个 nsLTPs基因分布具有基因簇的
现象，显示多个具有串联重复序列的基因聚集在一
个区域。统计结果表明，在拟南芥和水稻中分别有
18个和 26个基因以基因簇的形式存在，分别占基因
总数目的 40%和 53% (图 3)。拟南芥的 18个 nsLTPs
基因分别分布在 7个串联重复序列中，其中 1号、2
号和 3号染色体上各有 1个串联重复序列，5号染
图 2水稻和拟南芥的 nsLTPs GO生物学过程富集分析
注: *表示 p值在 0.05~1.0e-60; **表示 p值在 1.0e-60~1.0-120; **表示 p值在 1.0e-120~1.0-180
Figure 2 GO biological process enrichment analysis of nsLTPs in rice and A. thaliana
Note: *: p value between 0.05~1.0e-60; **: p value between 1.0e-60~1.0-120; **: p value between 1.0e-120~1.0-180
色体上有四个串联重复序列，每个串联重复都是属
于同一亚家族 (图 3A)。在水稻中也有类似现象，在
4、10、11、12号染色体上分别有一个基因簇，1 号染
色体上有三个基因簇(图 3B)。通过以上信息，我们可
以推测 nsLTPs串联重复序列和基因簇的出现可能
是由于它们起源于同一片段的多拷贝复制。
1.5拟南芥和水稻 nsLTPs 家族在不同组织器官的不
同时期表达模式分析
为了进一步细致分析和了解 nsLTPs 基因在拟
南芥和水稻的不同组织器官或不同发育时期的表达
特性以及可能的生物学功能，我们共获得 35个拟南
芥 nsLTPs基因及其在 31个不同的组织器官中不同
时期的表达数据，和 43个水稻 nsLTPs基因在 27个
不同组织器官中不同时期的芯片表达数据。结果表
明：大部分植物 nsLTPs 基因的表达具有广谱性特
1514
点，在不同的组织器官均有表达，但在不同组织器官
的不同部位，其表达数据有明显的差异(图 4)。
进一步对水稻和拟南芥 nsLTPs 基因表达进行
聚类分析，结果表明：拟南芥中的 nsLTPs 的基因表
达可以分成 a、b、c和 d四大组，每组含有 3到 6个
亚家族不等(图 4A)。其中 a组包含 6个成员(Ⅰ,Ⅱ
和Ⅴ类各 2个成员)，主要表达特点是较为集中于下
胚轴、茎的第一节点和根，推测该组可能对于植物的
生长，特别是胚胎早期发育以及后续的营养生长有
图 3水稻和拟南芥脂质转运蛋白基因的染色体分布示意图
注: A:拟南芥中脂质转运蛋白基因在染色体上的分布; B:水稻中脂质转运蛋白基因在染色体上的分布,水稻 2号染色体上不含
有 nsLTPs基因,黑色框中代表的是基因簇
Figure 3 Localization of nsLTPs genes on the rice and A. thaliana chromosomes; The chromosome numbers are indicated on the top of
the figure
Note: A: Chromosome map of ns-Ltp in A. thaliana; B: Chromosome map of ns-Ltp in rice, there is no nsLtps on chromosome 2, black
box represents the gene cluster
着重要作用。b组包含 8个基因(Ⅱ, Ⅴ, Ⅷ和 Y类各
1个成员,Ⅰ和Ⅵ类 2个成员)，主要特点是在花发育
的各时期有一定表达，特别是莲座叶中表达量较高，
在衰老的叶片和茎叶中也有部分表达，说明该组对
于花的发育特别是莲座的发育有着重要的作用。c组
主要包含 13个基因(Ⅰ类 6个成员、Ⅱ类 4个成员和
Ⅳ类 3个成员)，c组成员的表达主要分布于花发育
的 9到 12时期，此外在 12期和 15期的各个花器官
中均有较高的表达，说明 c组基因在花的发育和花
拟南芥和水稻非特异脂质转运蛋白的分子进化、表达模式以及在花药发育中的功能分析
Evolutionary and Expression Profile Analysis of the nsLTP Genes Superfamily in Arabidopsis thaliana and Rice (Oryza sativa) 1515
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
图 4水稻和拟南芥脂质转运蛋白基因在组织器官表达模式和聚类分析
注: A:拟南芥脂质转运蛋白基因在 31个组织以及不同发育时期的表达数据; B:水稻中转运蛋白基因在 27个组织及不同发育
时期的表达数据(Ⅰ类:红色;Ⅱ类:橙色;Ⅲ类:黑色;Ⅳ类:浅绿;Ⅴ类:绿色;Ⅵ类:浅蓝;Ⅶ类:蓝色;Ⅷ类:深蓝;Ⅷ类:紫色; Y
类:深红色); 1:子叶; 2:莲座叶 2; 3: 莲座叶; 4: 莲座叶 6; 5:莲座叶 8; 6:莲座叶 10; 7:莲座叶 12; 8:第十七叶叶柄; 9:下胚轴;
10:叶近端半; 11:叶远侧半; 12:过渡期至开花后的整个莲座; 13:衰老叶片; 14:茎叶; 15:茎的第一节点; 16:根; 17: 9不同花发
育时期; 18: 10/11不同花发育时期; 19: 12不同花发育时期; 20: 15不同花发育时期; 21:花梗; 22:萼片; 23:花瓣; 24:雄蕊; 25:
心皮; 26:整株植株; 27:愈伤组织; 28:悬浮细胞; 29:干种子; 30:发芽的种子; 31:胚芽; 32:胚艮; 33:胚芽鞘; 34:幼苗; 35:短茎;
36:叶; 37:干; 38:整个节间; 39:根; 40:根尖; 41:茎顶端分生组织; 42:顶叶; 43:小穗; 44:内外稃; 45:柱头; 46:子房; 47:发育中
的花药; 48:成熟花药; 49:胚囊; 50:胚胎; 51:胚乳
Figure 4 Hierarchical cluster display of expression profiles for rice and A. thaliana nsLTPs genes in different tissues and/or organs
Note: A: Expression data of ns-Ltp in 31 different tissues and organs of A. thaliana; B: Expression data of ns-Ltp in 27 different tissues
and organs of rice (Ⅰ: Red;Ⅱ: Orange;Ⅲ: Black;Ⅳ: Light green;Ⅴ: Green;Ⅵ: Light blue;Ⅶ: Blue;Ⅷ: Dark blue;Ⅷ: Purple; Y:
dark red); 1: Cotyledon; 2: Rosette leaf 2; 3: Rosette leaf 4; 4: Rosette leaf 6; 5: Rosette leaf 8; 6: Rosette leaf 10; 7: Rosette leaf 12; 8:
Leaf 7 petiole; 9: Hypocotyl; 10: Leaf 7 proximal half; 11: Leaf7 distal half; 12: Entire rosette after transition to flowering; 13: Senesc-
ing leaf; 14: Cauline leaf; 15: 1st node; 16: Root; 17: Flower stage 9; 18: Flower stage 10/11; 19: Flower stage 12; 20: Flower stage 15;
21: Pedicels; 22: Sepals; 23: Petals; 24: Stamens; 25: Carpels; 26: Whole_plant; 27: Callus; 28: Suspension_cell; 29: Dry_seed; 30:
Germinating_seed; 31: Plumule; 32: Radicle; 33: Coleoptile; 34: Seedling; 35: Shoot; 36: Leaf; 37: Stem; 38: Whole_internode; 39:
Root; 40: Root_tip; 41: SAM; 42: Flag_leaf; 43: Spikelet; 44: Palea_lemma; 45: Stigma; 46: Ovary; 47: Developing_anther; 48: Ma-
ture_anther; 49: Embryosac; 50: Embryo; 51: Endosperm
1516
器官的建成中有重要的作用。d组成员包含来自不同
亚家族的 8个成员(Ⅰ,Ⅱ, Y类各 1个成员,Ⅸ类 2个
成员，Ⅲ类 3个成员)，虽然 d组成员来自于 6个不同
的亚家族，分布驳杂，但是表达模式却相对统一，均主
要集中于花发育的 9、10、11时期，这说明 d组成员在
拟南芥花发育的 9到 11期具有重要的作用。
对比拟南芥，水稻聚类分析结果也可分为 a、b、c
和 d四个组，每组包含来自 4到 6个不同的亚家族
的成员(图 4B)。其中 a组有 17个基因(Ⅰ类 6个成
员,Ⅱ类 3个成员,Ⅳ类 4个成员,Ⅴ类 2个成员,Ⅲ
类和Ⅵ类各 1个成员)，a组的表达特点是较为广泛，
在水稻的各个时期和各个器官都有较多表达，尤其
在愈伤组织、悬浮细胞、胚芽、胚根、根、根尖、经顶端
分生组织、发育中的花药和胚胎等分生组织部位的
表达量较高，推测这类基因可能与细胞的分裂密切
相关，可能对于新细胞的膜器官的形成有重要作用。
b组共计 7个基因(Ⅰ和Ⅷ类 2个成员,Ⅱ、Ⅵ和Ⅶ类
各 1个成员)，该组的表达特点是主要分布在发育中
的花药和成熟的花药中，在柱头和胚乳中也有一定
分布，因此可以推测 b组成员可能参与到花药的形
成中，对于水稻的生殖生长具有重要的作用。c组共
计 12个基因(Ⅰ类 6个成员,Ⅱ类 4个成员,Ⅴ和Ⅵ
类各 1个成员)，c组的成员主要来自Ⅰ类和Ⅱ类，其
表达分布也较为统一，在胚芽、胚芽鞘、幼苗、矮茎、
顶叶、小穗、内外稃、胚乳中均有分布，推测其功能主
要是参与胚胎和早期植株的发育，对于水稻的营养
生长有着重要的作用。d组共计 7个基因(Ⅰ类 2个
成员, Ⅱ类 3个成员, Ⅵ和 Y类各 1个成员)，d组成
员主要分布在干种子、发芽的种子、胚胎、胚乳和胚
根中，可以看出 d组成员对于种子及胚胎的重要性，
对于水稻的繁殖有着重要的作用。
通过对拟南芥和水稻 nsLTPs表达部位的初步
分析，我们发现拟南芥和水稻的 nsLTPs表达都具有
组织部位和各个发育时期的广泛性，间接说明植物
nsLTPs可能对于拟南芥和水稻的各个器官的发育都
有至关重要的作用。但进一步通过对拟南芥和水稻
nsLTPs时空表达数据进行聚类分析，发现拟南芥和
水稻 nsLTPs家族功能差异较大，这种差异可能是在
植物进化过程中逐渐形成的，使 nsLTPs基因的多样
性和丰度都有一定程度的提高。
1.6拟南芥和水稻 nsLTPs家族在花药的功能分析
花药发育和花粉形成是植物完成世代交替的重
要环节，认识植物花药发育和花粉形成的分子机理，
对于提高人们对植物基本生命现象的认识以及通过
作物杂交育种提高农业产量具有重要意义。在花药
的发育过程中，脂类物质的形成和运输对于花粉外
壁的形成过程至关重要，而植物 nsLTPs可能对花药
发育过程中脂类的运输具有重要的生理功能。因此，
为了进一步全面分析 nsLTPs在拟南芥和水稻花药
发育过程中的功能，我们对 35个拟南芥和 43个水
稻 nsLTPs在花药发育过程中的表达模式进行聚类
分析。分析结果表明(图 5A)，在拟南芥中可以分为 a、
b、c和 d四个组，其中 a组基因共计 11个(Ⅰ类 6个
成员,Ⅱ类 3个成员,Ⅵ和 1个 Y类各 1个成员)，a
组基因的表达分布主要在拟南芥花药发育的后期(即
15期)，其中 AtLtpI.5、AtLtpI.3AtLtpI.3、AtLtpII.12主
要在 15期的雄蕊中表达。b组包含 1个Ⅰ类成员，2
个Ⅱ类成员，2个Ⅴ类成员，1个Ⅵ类成员和 1个Ⅷ
类成员共计 7个基因。b组成员除了个别在花发育的
过程中有所表达外，最主要的特征是它们在衰老的
叶片中也有较高水平的表达，推测成员可能参与细
胞的凋亡过程，比如将衰老细胞中的脂类营养物质
转运到体内的其他细胞中去。c组主要包括 3个Ⅱ类
成员，2个Ⅲ类成员，1个Ⅳ类成员，1个 V类成员，2
个Ⅸ类成员共 9个基因。观察其表达模式，可以发现
其中 3 个Ⅱ类成员在花发育的中期 (stage10/11、
stage12和 stage12的雄蕊)有较高程度的表达，c组中
的其他成员则在花发育的早期(stage9)有较为集中的
表达，可以推测 c组成员在拟南芥花的早期和中期
发育过程中具有重要的作用。d组主要包含 4个Ⅰ类
成员，1个Ⅲ类成员，2个Ⅳ类成员，1个 Y类成员总
计 8个基因，将其芯片表达数据汇总观察，可以发现
d组成员的表达模式较为一致，均在花发育的早期和
中期有着一定程度的表达。不同于 c组成员的是，d
组成员贯穿拟南芥花发育的早期和中期，而 c组成
员的表达模式更为特异。同样，在水稻中挑选花药发
育的不同时期(图 5B)进行分析：结果表明水稻 nsLTPs
可分为 a、b、c和 d四个组。其中 a组包含 2个Ⅰ类
成员、4个Ⅱ类成员、3个Ⅳ类成员、2个Ⅴ类成员、1
个Ⅵ类成员总计 12个基因。可以看到 a组成员表达
数据主要分布在 6、7、8、9这四个时期，也就是说 a
组水稻 nsLTPs基因主要作用于水稻花药发育的早
期和中期。b组主要包含 7个Ⅰ类基因和 3个Ⅱ类基
因，可以看到 B类成员的来源相对单一，他们的亲缘
性更为接近，而表达分布显示它们主要分布在花药
发育的 10、11、12这三个时期，可以推测 b组成员对
于花药发育的后期起到了重要的作用。c组主要包括
拟南芥和水稻非特异脂质转运蛋白的分子进化、表达模式以及在花药发育中的功能分析
Evolutionary and Expression Profile Analysis of the nsLTP Genes Superfamily in Arabidopsis thaliana and Rice (Oryza sativa) 1517
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
图 5水稻和拟南芥脂质转运蛋白基因在花药中的系统聚类
注: A:拟南芥花的不同发育时期: Stage 9 (早期), Stage 10/11和
Stage 12 (中期), Stage 15 (后期)以及特异性器官 Flower Stage 12
Stamen (中期雄蕊)和 Flower Stage 15.Stamen (后期雄蕊),以及
衰老叶片的芯片数据; B: 水稻花药不同发育时期: stage 6~7
(早期), stage 8~9 (中期), stage 10~12 (晚期)的芯片数据
Figure 5 Hierarchical cluster display of expression profiles for
Rice and A. thaliana nsLTPs genes during the anther develop-
ment
Note: A: Different anther development stage of A. thaliana: Stage9
(early stage), Stage 10/11 and Stage 12 (middle stage), Stage 15 (lat
er stage) and flower Stage 12 stamen (middle stage stamen) and
flower stage 15 stamen (later stage stamen); B: Different anther de
velopment stage of rice: Stage 6~7 (early stage), stage 8~9 (middle
stage), stage 10~12 (later stage)
3个Ⅰ类基因，2个Ⅳ类基因，1个Ⅴ类基因，1个Ⅵ
类基因，1个Ⅶ类基因。通过对 c组基因的芯片表达
数据进行分析可以发现，其表达主要集中于 9期、10
期和 11期，主要参与了这几个时期的花药发育。而 d
组含有 3个Ⅰ类基因，3个Ⅱ类基因，2个Ⅲ类基因，
2个Ⅵ类基因和 1个 Y类基因总计 11个。从 d组的
表达数据可以看出，其表达量在 8b、9和 10期最为集
中，d组基因主要参与到水稻花药发育的这几个时期。
通过对拟南芥和水稻 nsLTPs家族在花药发育
阶段的芯片表达数据对比，我们可以发现，在花药发
育的各个时期，均有本家族基因的表达，但是表达数
据上又可以观察到家族基因的特异性和复杂性，推
测可能存在家族内部的差异和互补表达，进一步证
明了功能上和表达上的协调与控制。
2讨论
植物 nsLTPs基因是一类功能十分重要的转运
蛋白家族，在植物的各个组织部位和发育时期中都
有广泛的分布，本文通过分析拟南芥和水稻中
nsLTPs家族基因的基因信息、染色体分布和芯片表
达等数据，揭示了以这两个物种为例的 nsLTPs的功
能结构和表达分布等重要信息。
从蛋白结构上来看，可能是物种不同环境中进
化上的差异造成了不同的 nsLTPs亚家族，从而表现
出不同的蛋白功能。从蛋白的亚细胞定位上可以看
出，拟南芥的 nsLTPs基因更多的定位于内质网上，
可能更多的参与内质网合成的疏水化合物的运输(李
长生等, 2009)，而与之相对的是水稻中的 nsLTPs分
布更为广泛——从细胞核到细胞质都有分布，推测
对于整个细胞内部的物质运输都起到重要作用。
在 nsLTPs亚家族分类方面，根据蛋白序列同源
相似性原则，除了Ⅰ类和Ⅱ类 nsLTPs以外，还有几
个花药特异性的蛋白与植物 nsLTPs表现出较高的同
源性，所以被归类为Ⅲ类 nsLTPs (Lauga et al., 2000;
Boutrot et al., 2005)；此外，一些研究发现了新的
nsLTPs家族基因，根据其基因的同源性，新发现的基
因被分成 6个新的 nsLTPs基因，从Ⅳ到Ⅸ，其中拟
南芥中不存在Ⅶ类 nsLTPs基因，水稻中不存在Ⅸ类
基因，体现了植物 nsLTPs 基因的多样性(Boutrot et
al., 2008)。
从拟南芥和水稻的 nsLTPs家族基因的染色体
分布可以看出，部分的家族成员在染色体上以基因
簇的方式呈现，特别是一些基因有紧密连锁的关系，
这说明在 nsLTPs家族基因进化的过程中可能由同
一片段起源，而且发生了多拷贝复制。在基因进化的
过程中，基因复制导致蛋白结构发生相应的改变，从
而改变了原有的功能，实现了新的功能。基因复制作
为基因进化的驱动力，为旧有的基因带来了新的序
列和更加多样化的蛋白，正如复制在 nsLTPs家族中
的作用。
nsLTPs的 GO功能分析表明，在生物学过程中
nsLTPs主要参与水稻中从定位到运输这个整体过
1518
程，可以看出其功能十分完备，而拟南芥中的 nsLTPs
的富集数据显示，除了定位运输以外，更表明其功能
与脂质具有密切关系。这种富集结果的不同可能是
由于进化差异所致，也可能是水稻的数据库完善度
还不够(Boutrot et al., 2008)。
对拟南芥和水稻的 nsLTPs家族的不同时期和
组织部位的表达谱芯片表达和聚类分析，发现
nsLTPs在拟南芥中的分布十分广泛，在选取的 31个
组织器官中都有数目不等的家族成员有所表达，但
是其表达数据仍遵循着一定的规律(图 5)。这一定程
度上佐证了部分 nsLTPs基因对于角质层的合成和
花药部分绒毡层的形成有重要的作用，还有许多
nsLTPs参与到蜡质等的合成运输过程中去，对于拟
南芥的幼嫩新生组织的生长具有重要的作用(张明永
和梁承邺, 2000)。
植物生殖生长是一个非常重要而且复杂的过
程，其中花药的形成是必不可少的一环。本研究也着
眼于拟南芥和水稻的花药的发育时 nsLTPs的表达
情况。可以从拟南芥和水稻不同发育时期的不同组
织部位的芯片数据发现，拟南芥中 nsLTPs家族较为
清晰的分成 a、b、c和 d四组，其中 c类主要在花药
发育的早期表达，d组主要在花药发育的中期表达，a
组主要在花药发育的晚期表达，而 b组比较特殊，它
的表达量在衰老的叶片中最多。而水稻中也有类似
的情况，a 组在花药发育的早期表达较高，c 组和 d
组在花药发育的中期表达较高，b组在花药发育的晚
期较高。通过比对这两种植物的 nsLTPs的表达数
据，我们可以发现 nsLTPs在花药发育的不同时期的
表达情况有较大差异，表现出了较高的广谱性和互
补性，从而显现出完善的功能分工和协调控制。
3材料与方法
3.1拟南芥和水稻中 nsLTPs基因数据收集
我们分别从拟南芥信息资源数据库(The Ara-
bidopsis information resource, TAIR, http://www.ara-
bidopsis.org/)和水稻基因注释计划信息资源数据库
(Rice Gene Annotation Project, http://rice.plantbiology.
msu.edu)获取拟南芥和水稻 nsLTPs家族基因的基本
信息；包括基因信息、亚家族的分类、基因的别名、蛋
白的大小和内含子的数目等信息。拟南芥的 nsLTPs
家族使用 ATTED-II (http://atted.jp/)得到亚细胞定位
的结果，水稻的 nsLTPs 亚细胞定位预测是通过
PSORT、TargetP 1.1、MITOPROT和 ChloroP1.1 (http://
cubic.bioc.columbia.edu/cgi/-var/nair/resonline.pl)来完
成的(朱璐等, 2013)。
3.2 GO功能分类
对获取的拟南芥和水稻的 nsLTPs 进行 Gene
Ontology(GO)功能分类，主要使用的是基于数据库和
网络工具的分析方法(GOAnalysisToolkit andDatabase
for Agricultural community, http://bioinfo.cau.edu.cn/
agriGO/index.php)，主要包括分子功能 (molecular
function)、生物过程(biological process)以及细胞组分
(cellular component)三种方式。
3.3 nsLTPs家族在染色体分布和基因进化复制分析
拟南芥的染色体分布采用 TAIR网站的染色体
画图工具(chromosomemap tool, http://www.arabidopsis.
org/jsp/ChromosomeMap/tool.jsp)绘制，把所有收集到
的 nsLTPs基因定位于染色体上。水稻的染色体分布
采用(Rice InDel MARKERS DATABASE)将收集到
的水稻基因放到染色体上，对家族连锁进行分析(朱
璐等, 2013)。
3.4 nsLTPs家族蛋白结构分析
分别使用 SignalP 3.0 (http://www.cbs.dtu.dk/ser-
vices/SignalP/)和 Signal Peptide Prediction (http://bio-
informatics.leeds.ac.uk/prot_analysis/Signal.html)来预
测拟南芥和水稻的 nsLTPs家族的信号序列，使用
PROSITE 获得活性位点数据，蛋白结构通过
SMART，Pfam和 Interproscan数据库查找获得；内含
子数目通过 TIGR(http://www.tigr.org/tigr-scripts/os-
a1_web/gbrowse/rice/)查找获得。
3.5 nsLTPs基因表达谱信息收集和聚类分析
对于收集到的拟南芥和水稻的 nsLTPs基因，分
别在公共资源信息数据库 CREP database (http://crep.
ncpgr.cn)处理，拟南芥的数据在 BAR，Bio-Array Re-
source for Plant Biology, 的 Arabidopsis eFP Browser
(http://bar.utoronto.ca/welcome.htm)查找，水稻的 nsLTPs
基因数据在 Rice Oligonucleotide Array Database
(http://www.ricearray.org/)查找，获得它们的发育芯片
表达数据，其中取拟南芥的 35个，水稻的 27个不同
的组织器官的不同生长发育阶段(这些时期主要包括
整株植株,愈伤组织,悬浮细胞,干种子,发芽的种子,
胚芽,胚艮,胚芽鞘,幼苗,短茎,叶,干,整个节间,节
间薄壁组织,根,根尖,茎顶端分生组织,顶叶,小穗,
内外稃,柱头,子房,发育中的花药,成熟花药,胚囊,
拟南芥和水稻非特异脂质转运蛋白的分子进化、表达模式以及在花药发育中的功能分析
Evolutionary and Expression Profile Analysis of the nsLTP Genes Superfamily in Arabidopsis thaliana and Rice (Oryza sativa) 1519
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
胚胎,胚乳)，对于同一基因的多个探针数据去平均
值。把所得数据使用 Genesis软件进行微阵列分析，
对所得基因进行聚类分析。
3.6 拟南芥和水稻花药中的 nsLTPs 基因表达信息分
析和功能预测
拟南芥 nsLTPs的表达分析数据取自 BAR (http://
bar.utoronto.ca/welcome.htm)水稻 nsLTPs 的表达分
析数据取自 ROAD (www.ricearray.org)，在数据库中
找 35到 nsLTPs家族基因在花药中不同时期的表达
数据(拟南芥中包括，早期(stage9)、中期(stage10/11
和 stage12)和晚期(stage15))的花药，单独雌蕊，单独
雄蕊和衰老的叶片的芯片表达数据；水稻中主要包括
皮下孢子细胞的细胞形成阶段(Anther_at_An1)、花粉
母细胞在减数分裂前的 S/G2阶段(Anther_at_Mei1)、
花粉母细胞的减数分裂的细线期(Anther_at_M1)、花
粉母细胞的减数分裂的偶线期到粗线期阶段(An-
ther_at_M2)、花粉母细胞减数分裂的双线期到四分
体时期(Anther_at_M3)、单核配子体阶段(Anther_at_P1)、
二核配子体阶段(Anther_at_P2)和三核配子体阶段
(Anther_at_P3)。其中 An1与 Mei1对应水稻的花期
stage 6、stage 7、M1、M2对应 stage 8，M3对应 stage 9，
P1、P2和 P3对应 stage 10、stage 11和 stage 12(请和图
片对应)。使用 Genesis处理得到的表达数据，然后聚
类分析。
作者贡献
许杰为项目构思者及负责人，指导实验设计；黄
岳为主要数据收集、主要数据分析，以及完成论文的
整体写作；张大兵参与指导实验设计和稿件修改；朱
璐和罗人和参与部分数据的验证分析和论文修改。
全体作者都阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究由国家自然基金项目(31000593, 31370026
和 J1210047)资助。
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Journal of Mosquito Research (JMR)
Journal of Mosquito Research (ISSN 1927-646X) is an open access, peer reviewed
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拟南芥和水稻非特异脂质转运蛋白的分子进化、表达模式以及在花药发育中的功能分析
Evolutionary and Expression Profile Analysis of the nsLTP Genes Superfamily in Arabidopsis thaliana and Rice (Oryza sativa) 1521