全 文 ：书江西农业学报 2012，24(12) :59 ～ 63
Acta Agriculturae Jiangxi
薄荷属植物分子生物学研究进展
王海棠，于 盱，刘 艳，梁呈元* ，李维林*
收稿日期:2012 －10 －11
基金项目:江苏省自然科学基金项目(BK2009330，BK2010475) ;江苏省农业科技自主创新资金项目［CX(11)1021］。
作者简介:王海棠(1985─) ，女，内蒙古通辽人，博士研究生，主要从事药用植物资源研究。* 通讯作者:梁呈元、李维林。
(江苏省中国科学院植物研究所，江苏 南京 210014)
摘 要:从薄荷属植物挥发油合成途径相关酶基因、柠檬烯合酶基因和分子进化等方面对薄荷属植物的分子生物学研究
进行了综述。
关键词:薄荷;柠檬烯合酶基因;基因克隆; 分子进化
中图分类号:S567． 235 文献标识码:A 文章编号:1001 －8581( 2012) 12 －0059 －05
Research Advance in Molecular Biology of Plants in Mentha Genus
WANG Hai － tang，YU Xu，LIU Yan，LIANG Cheng － yuan* ，LI Wei － lin*
( Institute of Botany，Jiangsu and Chinese Academy of Sciences，Nanjing 210014，China)
Abstract: The author reviewed the research advance in the molecular biology of plants in Menthe genus，including enzymatic
genes related to volatile oil synthesis way，limonene synthase gene，molecular evolution and so on．
Key words: Menthe; Limonene synthase gene; Gene cloning; Molecular evolution
薄荷油在医药、食品、香料和化工等行业中都具有广
泛的应用。单萜是由 2 个异戊二烯结构单元组成的 C10
类萜类化合物及其衍生物。单萜作为薄荷油的主要成
分，其合成途径以及调控机制一直受到研究者的关注。
经过多年的研究，不仅明确了薄荷油合成途径中的各个
反应步骤，而且其相关酶基因的研究也取得了较大的进
展。本文对薄荷属植物挥发油合成途径相关酶基因的发
现和克隆、薄荷油合成途径中关键限速酶柠檬烯合酶基
因的克隆与遗传转化，以及薄荷属植物的分子进化研究
等方面的最新研究进展进行了全面综述，以期对薄荷挥
发油合成途径相关酶基因的更深入研究、改造和应用提
供参考。
1 薄荷属植物挥发油合成途径相关酶基因研究
进展
单萜是薄荷挥发油主要成分。单萜是由 2个异戊二
烯结构单元组成的 C10类萜类化合物及其衍生物。单萜
类化合物在抵抗微生物病原菌、防御昆虫和植食性动物
方面有着重要的作用，在吸引昆虫传粉和植物种群竞争
中也很重要［1］。薄荷挥发油合成途径被视为是植物单
萜合成途径的典型模式［2］。挥发油最主要的成分薄荷
脑的形成需要经过很多步骤的反应，包括一系列不同类
型的生化反应［3 －5］。同时，催化每个反应的酶也都已经
被阐明［4 －11］。
图 1为薄荷单萜合成路径，描述了从萜类生物合成
共同前体 IPP或 DMAPP生成单萜合成唯一前体 GPP开
始，到最终生成薄荷油主要成分薄荷油和薄荷酮的全部
反应步骤［12］。相关的酶有:(1)香叶基焦磷酸合酶(ger-
anyl diphosphate synthase) ，(2)柠檬烯合酶［(－)－ limo-
nene synthase］，(3)细胞色素 P450 －柠檬烯 －3 －羟化酶
［cytochrome P450 (－)－ limonene － 3 － hydroxylase］，
(4)反式 －异薄荷烯醇脱氢酶［(－)－ trans － isopiperi-
tenol dehydrogenase］，(5)异薄荷二烯酮还原酶［(－)－
isopiperitenone reductase］，(6)顺式 －胡薄荷酮异构酶
［(+)－ cis － isopulegone isomerase］，(7)胡薄荷酮还原
酶［(+)－ pulegone reductase］，(8)薄荷酮还原酶［(－)
－menthone reductase］，(9)细胞色素 P450(+)－薄荷呋
喃合酶［cytochrome P450 (+)－ MFS］。主要的产物或
者中间物:异戊烯基焦磷酸(IPP，isopentenyl diphos-
phate)、二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP，dimethylallyl
diphosphate)、香叶基焦磷酸(GPP，geranyl diphosphate)、
柠檬烯(limonene)、(－)－反式 －异薄荷烯醇［(－)－
trans － isopiperitenol］、(－)异薄荷二烯酮［(－)－ isopip-
eritenone］、(+)－顺式 －异胡薄荷酮［(+)－ cis － isop-
ulegone］、胡薄荷酮［(+)－ pulegone］、(+)－薄荷呋喃
［(+)－ menthofuran］、(－)－薄荷酮［(－)－ mentho-
ne］、(－)－薄荷醇［(－)－ menthol］、(+)－新薄荷醇
［(+)－ neomenthol］。
尽管薄荷油合成的各个反应步骤都已经很明确，但
是对于其潜在的调控机理还不是很清楚。萜类合成途径
主要受其基因型调控，此外植物细胞环境和生长时期也
有一定的影响。单萜是在腺体细胞这个特定场所合成
的，而且只有盾状细胞才能分泌［13］。为了得到薄荷油合
成途径相关基因的信息，Lange 等［14］通过对薄荷油腺分
泌细胞 cDNA文库测序，获得了 1316个随机测序的克隆
或 EST。对这些序列进行了初步的功能分析和分类，结
果显示，编码生物合成代谢途径相关酶的 EST 序列达到
全部序列的 48%。这为后续的薄荷油生物合成相关酶
基因的克隆及功能研究等工作提供了重要的序列信息。
目前已经获得的薄荷萜类生物合成相关基因见
表 1［15 －40］。
图 1 薄荷单萜合成路径
2 柠檬烯合酶研究进展
柠檬烯是最简单的环形单萜，广泛存在于植物挥发
油中，如薄荷属、柑橘属、松科、伞形科等植物［29］。在薄
荷中，柠檬烯是薄荷挥发油合成的前提，在薄荷酮化学型
薄荷或香芹酮化学型薄荷的合成中，柠檬烯合酶催化
GPP环化为柠檬烯［3］，该反应决定薄荷油合成途径的整
体反应速率［30］。柠檬烯合酶是最典型的被子植物单萜
环化酶，该酶大小为 65 kDa，pI值大约为 5，最佳反应 pH
值为 7左右。柠檬烯合酶需要与二价金属离子(如 Mg2 +
或 Mn2 +)才能与底物结合并催化反应。此酶可以识别香
叶基并作为它的底物，还对半胱氨酸残基、甲硫氨酸残
基、组氨基酸残基等较为敏感。
基因的遗传转化及在体外表达是很理想的研究基
因功能的手段。为了更深入地了解柠檬烯合酶的调控机
理，Colby等［11］根据从留兰香挥发油腺体获得的柠檬烯
合酶氨基酸序列，设计核苷酸引物，并利用该引物从留兰
香叶片 cDNA文库中锚定了 4个柠檬烯合酶基因相关克
隆。这是首次获得柠檬烯合酶基因的序列，并将所获得
的 3 个全长片段转化 E． coli，成功获得了可以被柠檬烯
合酶多克隆抗体识别的多肽，同时该多肽催化 GPP 后可
以生成与植物体内柠檬烯合酶催化反应相同的产物。
Krasnyanski等［31］利用农杆菌介导法和原生质体直接转
化方法将构建好的 4S － LS 过量表达载体分别转化椒样
薄荷，对转基因薄荷挥发油组分进行分析时发现，薄荷
酮、薄荷呋喃、胡薄荷酮等成分含量较野生型有所增加，
而薄荷醇含量有所降低，而柠檬烯含量只有微小的变化。
06 江 西 农 业 学 报 24 卷
Diemer等［32］将留兰香来源的 4S － LS基因转化分别转化
M． piperita和M． arvensis，并对其转基因植株的挥发油成
分进行了测定，在转基因 M． piperita植株中，总单萜含量
较对照有所增加;但在转基因 M． arvensis 植株中却得到
了相反的结果，这可能是由于转化的基因序列与其受体
内的序列同源性不够一致，导致该片段抑制了原来体内
基因的表达。
表 1 已经获得的薄荷萜类生物合成相关基因
基因 功能 登录号 植物 参考文献
DXP synthase 转酮醇酶 AF019383 M． piperita Lange［16］
DXR 还原异构酶 AF116825 M． piperita Lange等［17］
Isopentenylphosphate kinase 激酶 AF179283 M． piperita Lange等［18］
GPP synthase 异戊烯转移酶 AF182827、AF182828 M． piperita Burke等［19］
4 － S Limonene synthase 单萜合酶 L13459 M． spicata Colby等［11］
No data M． piperita Lange等［14］
175323 M． longifolia Crock等［20］
Linalool synthase 单萜合酶 AY083653 M． citrata Crowell等［40］
β － Farnesene synthase 倍半萜烯合酶 AF024615 M． piperita Crock等［20］
Muroladiene synthase 倍半萜烯合酶 AJ786641 M． piperita Prosser等［21］
Limonene －3 － hydroxylase 羟化酶 AF124816 M． piperita Lupien等［22］
AY622319 M． spicata L．‘Crispa’ Lücker等［23］
AY281027 M． gracilis Bertea等［24］
Limonene －6 － hydroxylase 羟化酶 AF124815 M． spicata Lupien等［22］
AY281025 M． gracilis Bertea等［24］
Menthofuran synthase 胡薄荷酮羟化酶 AW255974 M． piperita Bertea等［25］
Pulegone reductase 还原酶 AY300163 M． piperita Ringer等［26］
Isopiperitenone reductase 还原酶 AY300162
Menthone reductases 还原酶 AY288137、AY288138 M． piperita Davis等［28］
Isopiperitenol(－)－ carveol
dehydrogenase
脱氢酶 AY641428 M． piperita Ringer等［27］
3 薄荷属分子进化研究进展
对于薄荷属的起源与进化，已经运用形态学、植物
解剖学、植物孢粉学、植物化学进行了研究，随着分子生
物学的发展，特别是 PCR 技术的应用，分子进化已经成
为研究薄荷属植物进化的重要手段。Khanuja等［33］利用
RAPD对印度主要薄荷品种进行了遗传关系分析，并根
据聚类结果，推测 Mentha gracilis Sole cv． cardiaca 可能
是M． arvensis L．和M． spicata L．的杂交后代。另外一项
RAPD研究证实，与椒样薄荷(M． piperita)相比，留兰香
(M． spicata L．)与 M． gracilis之间的亲缘关系更近。同
时发现，美国不同地区栽培的薄荷品种之间遗传多样性
很小［34］。Gobert等［35］利用 AFLP对 62 份不同种不同种
植地区的薄荷材料进行了分类研究，聚类分析结果明显
分成 2个大的聚类群，其中一个群体包括 M． suaveolens、
M． spicata I、M． spicata II 和M． longifolia;另一个群体包
括 M． arvensis、M． aquatica 和 M． piperita。研究结果大
体上可以对 5 个种的薄荷植物进行分类(留兰香包括 2
个组，其他 4个种各自成为一个组) ，但是个别几个材料
在不同聚类分析中的位置变化较大，对其遗传关系还有
待考证。Shasany 等［36］利用 AFLP 标记对 7 个薄荷种之
间的亲缘关系进行了研究，UPGMA方法聚类结果中 M．
longifolia与 M． gentilis之间的相似性为 84%，是所观察
的 7个种之间相似性最高的。Zabta等［37］利用 RAPD标
记对 15份 Mentha royleana 和 15 份 Mentha spicata 进行
了聚类分析，得出了分别包括 2 个种的所有植物材料的
2个独立分支，暗示着种之间的遗传多态性很高。但是
这类分子标记的重复性不够稳定，而且对 PCR扩增条件
敏感，不同的实验环境很难得到完全相同的多态位点。
随着其他物种中系统发育研究的深入，更好的分子进化
标记基因信息的开发也给薄荷属植物系统进化研究带来
了新的研究思路。Attiya 等［38］成功扩增出叶绿体基因
rps11和 rps14，使用 12 种限制性内切酶进行酶切，对
PAGE凝胶电泳获得的带型进行多态分析。通过这样的
方法，他们发现 M． spicata 与其他 6 种薄荷属植物有很
多的差异。但是，将薄荷群体与烟草进行比较的时候发
现，薄荷属植物可以很好地聚类到一起，证明了这些薄荷
属植物起源于一个共同祖先。Chen 等［39］结合一些形态
特征和叶绿体非编码 DNA序列对薄荷 6 个种和 2 个杂
合体的遗传关系进行了分析，成功地将 2 个不同化学型
的薄荷类群加以区分。
4 展望
鉴于薄荷油在食品、化妆品、烟草、香料及化工等行
业中的应用价值，特别是在薄荷油合成途径中各个反应
步骤及相关酶被阐明以来，人们对薄荷油合成途径的调
控研究转向了分子生物学领域研究。尽管薄荷油合成途
径中的各个反应步骤都已经很明确，但是对于其潜在的
调控机理还不是很清楚，因此，人们对薄荷油合成途径中
相关酶基因进行了研究，其中以柠檬烯合酶的研究最为
1612 期 王海棠等:薄荷属植物分子生物学研究进展
典型。目前已经取得了重要的研究进展，如已经克隆到
多个薄荷油合成途径相关酶基因序列，通过遗传转化获
得了柠檬烯合酶的转基因植物材料，并且发现总单萜含
量较对照增加了薄荷新材料。
尽管目前已经将柠檬烯合酶基因进行遗传转化，并
获得新的薄荷材料，初步达到了人们预期的通过薄荷油
合成途径相关酶研究改造薄荷油含量的目的。但是，由
于薄荷属植物复杂的遗传背景，这样的转化体系并不能
稳定地应用于薄荷属，因此，迫切需要更多的基因背景知
识研究，只有在了解了整体的遗传背景之后，才能够正确
地认识基因的功能和代谢调节机制。此外，更多的薄荷
油合成相关酶基因研究还停留在初步的克隆和合成阶
段，其在薄荷油合成途径中具体的功能及调控机制还不
得而知。相信随着对薄荷挥发油合成途径相关酶基因更
深入的研究，全面认识它们的功能及代谢调节机制，不仅
能够更好地应用于薄荷的转基因改造，也将为其他植物
次生代谢途径研究提供很好的参考。
参考文献:
［1］Pichersky E，Gershenzon J． The formation and function of plant
volatiles:perfumes for pollinator attraction and defense［J］． Curr
Opin Plant Biol，2002，5:237 －243．
［2］ Jonathan Gershenzon，Marie E McConkey，Rodney B Croteau．
Regulation of Monoterpene accumulation in leaves of peppermint
［J］． Plant Physiology，2000，122:205 －213．
［3］Kjonaas R，Croteau R． Demonstration that limonene is the first
cyclic intermediate in the biosynthesis of oxygenated p － men-
thane monoterpenes in Mentha piperita and other Mentha species
［J］． Arch Biochem Biophys，1983，220:79 －89．
［4］Kjonaas R B，Venkatachalam K V，Croteau R． Metabolism of
monoterpenes:oxidation of isopiperitenol to isopiperitenone，and
subsequent isomerization to piperitenone by soluble enzyme prep-
arations from peppermint (Mentha piperita) leaves［J］． Arch
Biochem Biophys，1985，238:49 －60．
［5］Croteau R，Venkatachalam K V． Metabolism of monoter － penes:
demonstration that (1)－ cis － isopulegone，not piperitenone，is
the key intermediate in the conversion of (2)－ isopiperitenone to
(1)－ pulegone in peppermint (Mentha piperita) ［J］． Arch Bio-
chem Biophys，1986，249:306 －315．
［6］ Kjonaas R，Martinkus － Taylor C，Croteau R． Metabolism of
monoterpenes:conversion of l － menthone to l － menthol and d －
neomenthol by stereospecific dehydrogenases from peppermint
(Mentha piperita)leaves［J］． Plant Physiol，1982，69:1013
－1017．
［7］Karp F，Mihaliak C A，Harris J L，et al． Monoterpene biosynthe-
sis:specificity of the hydroxylation of (2)－ limonene by enzyme
preparations from peppermint (Mentha piperita) ，spearmint
(Mentha spicata)and perilla (Perilla frutescens) leaves［J］．
Arch Biochem Biophys，1990，276:219 －226．
［8］Croteau R，Karp F，Wagschal K C，et al． Biochemical character-
ization of a spearmint mutant that resembles peppermint in monot-
erpene content［J］． Plant Physiol，1991，96:744 －752．
［9］Alonso W R，Rajaonarivony J I M，Gershenzon J，et al． Purifica-
tion of 4S － limonene synthase，a monoterpene cyclase from the
glandular trichomes of peppermint (Mentha piperita)and spear-
mint (Mentha spicata) ［J］． J Biol Chem，1992，267:7582
－7587．
［10］Rajaonarivony J I M，Gershenzon J，Croteau R． Characterization
and mechanism of (4S)－ limonene synthase，a monoterpene cy-
clase from the glandular trichomes of peppermint (Mentha pip-
erita) ［J］． Arch Biochem Biophys，1991，296:49 －57．
［11］Colby S M，AlonsoW R，Katahira E J，et al． 4S － Limonene
synthase from the oil glands of spearmint (Mentha spicata) ［J］．
J Biol Chem，1993，268:23016 －23024．
［12］Soheil S Mahmoud，Rodney B Croteau． Metabolic engineering of
essential oil yield an composition in mint by altering expression
of deoxyxylulose phosphate reductoisomerase and menthofuran
synthase［J］． PNAS，2001，98 (15) :8915 －8920．
［13］ Jonathan Gershenzon，Massimo Maffei，Rodney Croteau． Bio-
chemical and histochemical localization of monoterpene biosyn-
thesis in the glandular trichomes of spearmint (Mentha spicata)
［J］． Plant Physiology，1989，89(4) :1351 －1357．
［14］Lange B M，Wildung M R，Stauber E J，et al． Probing essential
oil biosynthesis by functional evaluation of expressed sequence
tags from mint glandular trichomes［J］． Proc Natl Acad Sci
USA，2000，97:2934 －2939．
［15］ Pua E C， Davey M R． Transgenic Crops Ⅳ［M］．
Springer，2007．
［16］ Lange B M，Wildung M R，McCaskill D，et al． A family of
transketolases that directs isoprenoid biosynthesis via a meval-
onate － independent pathway［J］． Proc Natl Acad Sci USA，
1998，95:2000 －2004．
［17］Lange B M，Croteau R． Isoprenoid biosynthesis via a mevalonate
－ independent pathway in plants:cloning and heterologous ex-
pression of 1 － deoxy － d － xylulose － 5 － phosphate reductoi-
somerase from peppermint［J］． Arch Biochem Biophys，1999，
365:170 －174．
［18］Lange B M，Croteau R． Isopentenyl diphosphate biosynthesis via
a mevalonate independent pathway:isopentenyl － monophos-
phate kinase catalyzes the terminal enzymatic step［J］． Proc Natl
Acad Sci USA，1999，96:13714 －13719．
［19］Burke C C，Wildung M R，Croteau R． Geranyl diphosphate syn-
thase:cloning，expression，and characterization of this prenyl-
transferase as a heterodimer［J］． Proc Natl Acad Sci USA，
1999，96:13062 －13067．
［20］Crock J，Wildung M，Croteau R． Isolation and bacterial expres-
sion of a sesquiterpene synthase cDNA clone from peppermint
(Mentha piperita L．)that produces the aphid alarm pheromone
(E)－ β － farnesene［J］． Proc Natl Acad Sci USA，1997，94:
12833 －12838．
［21］Prosser I M，Adams R J，Beale M H，et al． Cloning and func-
tional characterisationof a cis － muuroladiene synthase fromblack
26 江 西 农 业 学 报 24 卷
peppermint (Mentha piperita)and direct evidence for a chemo-
type unable to synthesise franesene［J］． Phytochemistry，2006，
67(15) :1564 －1571．
［22］Lupien S，Karp F，Wildung M，Croteau R． Regio － specic cy-
tochrome P450 limonene hydroxylases from mint Mentha)spe-
cies:cDNA isolation，characterization，and functional expres-
sion of (－)－ 4S － limonene － 3 － hydroxylase and (－)－ 4S
－ limonene － 6 － hydroxylase［J］． Arch Biochem Biophys，
1999，368:181 －192．
［23］Lücker J，Schwab W，Van Hautum B，et al． Increased and al-
tered fragrance of tobacco plants after metabolic engineering u-
sing three monoterpene synthases from lemon［J］． Plant Physiol，
2004，134:510 －519．
［24］Bertea C，Schalk M，Mau C，et al． Molecular evaluation of a
spearmint mutant altered in the expression of limonene hydroxy-
lases that direct essential oil monoterpene biosynthesis［J］． Phy-
tochemistry，2003，64:1203 －1211．
［25］Bertea C，Schalk M，Karp F，et al． Demonstration that mentho-
furan synthase of mint (Mentha)is a cytochrome P450 monooxy-
genase:cloning，functional expression，and characterization of
the responsible gene［J］． Arch Biochem Biophys，2001，390:
279 －286．
［26］Ringer K L，Mc Conckey M E，Davis E M，et al． Monoterpene
doublebond reductases of the (－)－ menthol biosynthetic path-
way:isolation and characterization of cDNAs encoding (－)－
isopiperitenone reductase and(+)－ pulegone reductase of pep-
permint［J］． Arch Biochem Biophys，2003，418:80 －92．
［27］Ringer K L，Davis E M，Croteau R． Monoterpene metabolism，
cloning，expression，and characterization of (－)－ isopiperi-
tenol / (－)－ carveol dehydrogenase of peppermint and spear-
mint［J］． Plant Physiol，2005，137:863 －872．
［28］Davis E M，Ringer K L，McConkey M E，et al． Monoterpene
metabolism cloning，expression，and characterization of mentho-
ne reductases from peppermint［J］． Plant Physiol，2005，137:
873 －881．
［29］Guenther E． The essential oils (VolⅢ ～Ⅳ) ［M］． R E Krieg-
er，Huntington，New York，1972．
［30］Gershenzon J，Croteau R． Regulation of monoterpene biosynthe-
sis in higher plants［M］/ /Towers G H N，Stafford H A． Bio-
chemistry of the mevalonic acid pathway to terpenoids． Plenum
Press，New York，1991:99 －159．
［31］Krasnyanski S，May R A，Loskutov A，et al． Transformation of
the limonene synthase gene into peppermint (Mentha piperita
L．)and preliminary studies on the essential oil profiles of single
transgenic plants［J］． Theor Appl Genet，1999，99:676 －682．
［32］Florence Diemer，Jean － Claude Caissard，Sandrine Moja，et al．
Altered monoterpene composition in transgenic mint following the
introduction of 4S － limonene synthase［J］． Plant Physiol Bio-
chem，2001，39:603 －614．
［33］Khanuja S P S，Shasany A K，Alka Srivastava，et al． Assess-
ment of genetic relationships in Mentha species［J］． Euphytica，
2000，111:121 －125．
［34］Fenwick A L，Ward S M． Use of random amplied poly － mor-
phic DNA markers for cultivar identification in mint［J］． Hort-
Science，2001，36:761 －764．
［35］Gobert V，Moja S，Colson M，et al． Hybridization in the section
mentha (Lamiaceae)inferred from AFLP makers［J］． American
Journal of Botany，2002，89(12) :2017 －2023．
［36］Shasany A K，Shukla A K，Gupta S，et al． AFLP analysis for
genetic relationships among Mentha species［J］． Plant Genetic
Resources Newsletter，2005，144:14 －19．
［37］Zabta Khan Shinwari，Sidra Sultan，Tariq Mahmood． Molecular
and morphological characterization of selected Mentha species
［J］． Pak J Bot，2011，43(3) :1433 －1436．
［38］Attiya Jabeen，Bin Guo，Bilal Haider Abbasi，et al． Phyloge-
netics of selected Mentha species on the basis of rps8，rps11 and
rps14 chloroplast genes［J］． Journal of Medicinal Plants Re-
search，2012，6(1) :30 －36．
［39］Chen X H，Zhang F Y，Yao L． Chloroplast DNA molecular
characterization and leaf volatiles analysis of mint (Mentha，
Lamiaceae)populations in China［J］． Industrial Crops and
Products，2012，37:270 －274．
［40］Anastasia L Crowell，David C Williams，Edward M Davis，et
al． Molecular cloning and characterization of a new linalool syn-
thase［J］． Archives of Biochemistry and Biophysics，2002，405
(1) :112 －121．
(责任编辑:曾小军)
3612 期 王海棠等:薄荷属植物分子生物学研究进展