全 文 ：第４４卷　第１０期
２０１６年１０月
西北农林科技大学学报（自然科学版）
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ　Ａ＆Ｆ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔ．Ｓｃｉ．Ｅｄ．）
Ｖｏｌ．４４ Ｎｏ．１０
Ｏｃｔ．２０１６
网络出版时间：２０１６－０９－０７　０９：０３ ＤＯＩ：１０．１３２０７／ｊ．ｃｎｋｉ．ｊｎｗａｆｕ．２０１６．１０．０２４
网络出版地址：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／６１．１３９０．Ｓ．２０１６０９０７．０９０３．０４８．ｈｔｍｌ
拟南芥叶绿体发育必需蛋白ＰＡＣ的原核
表达及多克隆抗体制备
　［收稿日期］　２０１５－０４－０３
　［基金项目］　国家自然科学基金项目（３１３００９８８）；教育部博士点基金新教师项目（２０１２０２０４１２００３６）；国家级大学生创新训练计划项
目（２０１４０７１２０７１）
　［作者简介］　王　玥（１９９３－），男，河北邯郸人，在读本科生，主要从事植物叶绿体发育基因功能研究。
Ｅ－ｍａｉｌ：Ｗａｎｇｓｓ１９９３＠１２６．ｃｏｍ
　［通信作者］　齐亚飞（１９８４－），男，河南淮阳人，副教授，硕士生导师，主要从事叶绿体发育研究。Ｅ－ｍａｉｌ：Ｙａｆｅｉ．Ｑｉ＠ｇｍａｉｌ．ｃｏｍ
王　玥，梁　爽，梁慧珂，郁　飞，齐亚飞
（西北农林科技大学 生命科学学院／旱区作物逆境生物学国家重点实验室，陕西 杨凌７１２１００）
［摘　要］　 【目的】将拟南芥叶绿体发育必需蛋白ＰＡＣ进行大肠杆菌原核表达和纯化，并免疫家兔，获得针对
ＰＡＣ蛋白的多克隆特异性抗体，为进一步研究ＰＡＣ蛋白在叶绿体发育中的功能提供保证。【方法】将编码拟南芥
ＰＡＣ蛋白的ｃＤＮＡ克隆至原核表达载体ｐＥＴ－２８ａ中，转化ＢＬ２１（ＤＥ３）表达菌，经ＩＰＴＧ诱导后，对诱导产生的 ＰＡＣ
蛋白进行镍柱亲和纯化和ＳＤＳ－ＰＡＧＥ割胶纯化，并将纯化的ＰＡＣ蛋白通过皮下注射免疫家兔，利用分离得到的抗血
清，针对拟南芥野生型、ＰＡＣ敲除突变系ｐａｃ－１和ＰＡＣ过表达系ＰＡＣＯＥ的总蛋白进行免疫印迹检测。【结果】成功构
建了拟南芥基因ＰＡＣ的原核表达载体ｐＥＴ－２８ａ－ＰＡＣ，在３７℃、１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＩＰＴＧ诱导４ｈ的大肠杆菌细胞中，可检测
到分子质量为３８．９ｋｕ的重组蛋白，其大部分以可溶形式存在。用纯化诱导后的重组蛋白免疫家兔获得ＰＡＣ抗血
清，该抗血清能够有效地检测出１ｎｇ原核表达的ＰＡＣ重组蛋白，并在植物样品中检测出１条分子质量约为３５ｋｕ的
条带。【结论】成功制备了ＰＡＣ蛋白的多克隆抗体，可用于植物中ＰＡＣ蛋白含量的检测。
［关键词］　叶绿体；ＰＡＣ蛋白；原核表达；抗体制备
［中图分类号］　Ｑ７８ ［文献标志码］　Ａ ［文章编号］　１６７１－９３８７（２０１６）１０－０１７１－０５
Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｆｏｒ
ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ＰＡＣ　ｏｆ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ
ＷＡＮＧ　Ｙｕｅ，ＬＩＡＮＧ　Ｓｈｕａｎｇ，ＬＩＡＮＧ　Ｈｕｉｋｅ，ＹＵ　Ｆｅｉ，ＱＩ　Ｙａｆｅｉ
（Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｓｔａｔｅ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｃｒｏｐ　Ｓｔｒｅｓｓ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｆｏｒ　Ａｒｉｄ　Ａｒｅａｓ，
Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ　Ａ＆Ｆ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａｎｇｌｉｎｇ，Ｓｈａａｎｘｉ　７１２１００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：【Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ】Ｔｈｅ　ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ＰＡＣ　ｏｆ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ　ｗａｓ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ａｎｄ　ｅｘ－
ｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ｂｅｆｏｒｅ　ｂｅｉｎｇ　ｉｎｊｅｃｔｅｄ　ｉｎｔｏ　ｒａｂｂｉｔｓ　ａｓ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｔｏ　ｇｅｎｅｒａｔｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ．
【Ｍｅｔｈｏｄ】ＰＡＣ　ｃＤＮＡ　ｗａｓ　ｃｌｏｎｅｄ　ｉｎｔｏ　ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｐＥＴ－２８ａ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｖｅｃｔｏｒ
ｗａｓ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｉｎｔｏ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）．Ａｆｔｅｒ　ＩＰＴＧ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ，ｉｎｄｕｃｅｄ　ＰＡＣ　ｗａｓ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ｖｉａ　Ｎｉｃｋｅｌ　ａｆｆｉｎ－
ｉｔｙ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ｆｏｌｏｗｅｄ　ｂｙ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ　ｅｌｕｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ　ｇｅｌ　ｓｌｉｃｅｓ．Ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ＰＡＣ　ｐｒｏｔｅｉｎ
ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｉｍｍｕｎｉｚｅ　ｒａｂｂｉｔｓ，ａｎｄ　ａｎｔｉ－ＰＡＣ　ａｎｔｉｓｅｒｕｍ　ｗａｓ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ａｎｄ　ｔｅｓｔｅｄ　ａｇａｉｎｓｔ　ｔｏｔａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｆｒｏｍ
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　ｔｈｅ　ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ，ｔｈｅ　ＰＡＣ　ｋｎｏｃｋｏｕｔ　ｌｉｎｅ　ａｎｄ　ＰＡＣ　ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｌｉｎｅｓ　ｗｉｔｈ　Ｗｅｓｔｅｒｎ
ｂｌｏｔ．【Ｒｅｓｕｌｔ】Ｔｈｅ　ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｐＥＴ－２８ａ－ＰＡＣ　ｗａｓ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｙ　ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ
ｉｎ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）ｉｎｄｕｃｅｄ　ｗｉｔｈ　１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＩＰＴＧ．Ａ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗｉｔｈ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｗｅｉｇｈｔ　ｏｆ　３８．９
ｋｕ　ｗａｓ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ．Ｔｈｅ　ａｎｔｉ－ＰＡＣ　ａｎｔｉｓｅｒｕｍ　ｗａｓ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｔｏ　ｄｅｔｅｃｔ　１ｎｇ　ｏｆ　ＰＡＣ　ａｎｔｉｇｅｎ．Ａ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｂａｎｄ　ｗｉｔｈ
ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｗｅｉｇｈｔ　ｏｆ～３５ｋｕ　ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ｔｏ　ＰＡＣ　ｉｎ　ｔｏｔａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｗａｓ　ａｌｓｏ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ．【Ｃｏｎ－
ｃｌｕｓｉｏｎ】Ｔｈｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ａｎｔｉｓｅｒｕｍ　ａｇａｉｎｓｔ　ＰＡＣ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗａｓ　ｐｒｅｐａｒｅｄ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｙ，ｗｈｉｃｈ　ｃａｎ　ｂｅ　ｕｓｅｄ　ｆｏｒ　ｄｅ－
ｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＰＡＣ　ｉｎ　ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ；ＰＡＣ　ｐｒｏｔｅｉｎ；ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ
　　在高等植物中，叶绿体是进行光合作用的细胞
器，同时还是合成氨基酸、脂类和植物激素等重要代
谢物的场所［１］。叶绿体由前质体转化而来，整个发
育过程受遗传、环境等因子的紧密调控［２］。当参与
叶绿体发育的必需基因功能完全丧失时，植物通常
会表 现 出 白 化 致 死 的 表 型［３］。ＰＡＬＥ　ＣＲＥＳＳ
（ＰＡＣ）是参与叶绿体早期发育过程的必需基因。
目前报道的拟南芥ＰＡＣ缺失突变体ｐａｃ－１和ｐａｃ－２
均白化致死［４－６］，导致关于ＰＡＣ的功能研究积累很
少。ＰＡＣ缺失导致叶绿体发育受阻，但并不影响核
基因ＲｂｃＳ和ＬｈｃＢ 的表达。虽然ＰＡＣ缺失突变体
叶绿体的ｍＲＮＡ成熟和积累异常［７］，但是该异常也
可能是叶绿体发育受阻而产生的次级效应。蛋白质
结构分析表明，ＰＡＣ是一个富含α－螺旋的酸性蛋
白，没有可辨识的功能域，但酸性蛋白富含负电荷的
结构域，通常参与蛋白间相互作用的调控［８］。本研
究对ＰＡＣ蛋白进行原核表达和纯化，制备特异性的
多克隆抗体，并对制备的多克隆抗体进行免疫印迹
检测，以期为后续从蛋白水平上研究ＰＡＣ的生物学
功能提供条件。
１　材料与方法
１．１　材　料
１．１．１　植株、细菌和载体　野生型拟南芥植株
（Ｃｏｌ－０）、ｐａｃ－１（ＳＡＬＫ＿０１２３２０）和ＣａＭＶ　３５Ｓ启动
子调控的ＰＡＣ过表达材料（ＰＡＣＯＥ），由西北农林科
技大学生命科学学院梁爽博士提供；大肠杆菌
ＴＯＰ１０和ＢＬ２１（ＤＥ３）、原核表达载体ｐＥＴ－２８ａ，由
西北农林科技大学生命科学学院植物分子遗传实验
室保存。
１．１．２　主要工具酶与试剂　Ｔ４ＤＮＡ连接酶、限制
性内切酶和Ｔａｑ　ＤＮＡ 聚合酶等购自 ＴａＫａＲａ公
司，质粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒均购自
天根生化科技公司，Ｈｉｓ标签蛋白纯化柱填料 Ｎｉ
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　６Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ 购自 ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ
Ｓｃｉｅｎｃｅ公司，蛋白免疫印迹化学发光试剂盒购自
Ｂｉｏ－Ｒａｄ公司。
１．２　方　法
１．２．１　原核表达载体的构建　根据 ＴＡＩＲ（Ｔｈｅ
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅ）数据库发布的
拟南芥ＰＡＣ基因序列（ＡＴ２Ｇ４８１２０）以及ｐＥＴ－２８ａ
多克隆位点，设计１对特异性引物：
上游引物Ｐ１：５′－ＣＡＴＧＧＡＴＣＣＧＣＴＡＣＧＡＡ－
ＧＡＡＧＣＴＧＡＣＴＡＣＡ－３′；
下游引物Ｐ２：５′－ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＴＡＣＴＴＡＴＣＡ－
ＴＣＡＴＣＡＴＣＴＴＴＡＴＡＡＴＣＣＣＡＣＴＴＣＡＡＧＴＴＧ－
ＡＧＧＧＣＴＡＡＡＴ－３′。
上游引物下划线部分为ＢａｍＨⅠ酶切位点。以
本实验室保存的ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ－ＡＴ２Ｇ４８１２０质粒为模
板，利用 Ｐ１和 Ｐ２引物进行 ＰＡＣｃＤＮＡ 片段的
ＰＣＲ扩增。ＰＣＲ产物和ｐＥＴ－２８ａ载体经ＢａｍＨ Ⅰ
限制性内切酶酶切，并经琼脂糖凝胶回收试剂盒回
收。回收后的ｐＥＴ－２８ａ载体和ＰＡＣｃＤＮＡ 用 Ｔ４
ＤＮＡ连接酶于４℃下连接过夜，连接产物经热激法
转化大肠杆菌克隆菌株 ＴＯＰ１０。经卡那霉素及菌
落ＰＣＲ筛选阳性克隆，提取质粒进行酶切验证。将
阳性克隆送至华大基因公司测序，对测序正确的原
核表达重组载体ｐＥＴ２８ａ－ＰＡＣ，将用于表达重组蛋
白 Ｈｉｓｘ６－ＰＡＣ。
１．２．２　ｐＥＴ２８ａ－ＰＡＣ 的诱导表达及重组蛋白
Ｈｉｓｘ６－ＰＡＣ的纯化　将ｐＥＴ２８ａ－ＰＡＣ转化大肠杆菌
表达菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）。挑取阳性单克隆，接种到含
有５０μｇ／ｍＬ卡那霉素的ＬＢ液体培养基中，３７℃、
２００ｒ／ｍｉｎ培养至菌液 ＯＤ６００达到０．５～１．０时，加
入终浓度１ｍｍｏｌ／Ｌ的ＩＰＴＧ于３７℃诱导表达４
ｈ。分别取１ｍＬ诱导前菌液和诱导后菌液，利用
１２％ＳＤＳ－聚丙烯酰氨凝胶（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）电泳检测
Ｈｉｓｘ６－ＰＡＣ的表达。
收集１Ｌ上述ＩＰＴＧ诱导后的菌液，加入３０
ｍＬ 裂 解 缓 冲 液 （５０ ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＨ２ＰＯ４、３００
ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ咪唑，ｐＨ　８．０），经超声
波细胞破碎仪（宁波新芝，功率２００Ｗ）于冰水浴内
裂解。大肠杆菌裂解液经１２　０００ｒ／ｍｉｎ离心后，收
集上清液。将上清液与１ｍＬ　Ｎｉ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　６Ｆａｓｔ
Ｆｌｏｗ填料孵育３０ｍｉｎ，转入简易重力柱装置中。填
料经裂解缓冲液洗１０个柱体积，使用４ｍＬ洗脱缓
冲液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ、
１００ｍｍｏｌ／Ｌ咪唑，ｐＨ　８．０）洗脱收集 Ｈｉｓｘ６－ＰＡＣ。
２７１ 西北农林科技大学学报（自然科学版） 第４４卷
将收集的 Ｈｉｓｘ６－ＰＡＣ经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳，进一步割
胶纯化［９］。将纯化的蛋白利用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及ＢＳＡ
质量浓度梯度（１．０，０．５，０．２５，０．１２５ｍｇ／ｍＬ）检测
Ｈｉｓｘ６－ＰＡＣ的纯度和浓度。
１．２．３　抗血清的制备及验证　取纯化后的 Ｈｉｓｘ６－
ＰＡＣ蛋白免疫家兔。首免剂量２００μｇ／只，加入等
体积弗氏完全佐剂剧烈混匀后，于背部多点皮下注
射［１０］。此后每隔２周进行１次加强免疫，加强免疫
剂量１００μｇ／只。２次加强免疫之后，心脏采血并收
集血清。利用蛋白免疫印迹检测抗血清能否识别
Ｈｉｓｘ６－ＰＡＣ。
将纯化的 Ｈｉｓｘ６－ＰＡＣ抗原进行梯度稀释，分别
取１００，１０和１ｎｇ进行１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳。蛋
白样品经半干法转移到硝酸纤维素膜（０．４５μｍ）
上。硝酸纤维素膜经封闭液（质量分数５％脱脂牛
奶／ＴＢＳＴ）室温封闭１ｈ后，加入经封闭液稀释的抗
血清（１∶５　０００）于室温下孵育１ｈ；用 ＴＢＳＴ（２０
ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ、体
积分数０．１％ Ｔｗｅｅｎ　２０）洗涤３次；用 ＨＲＰ标记羊
抗兔ＩｇＧ（１∶１０　０００稀释）室温孵育１ｈ后再经
ＴＢＳＴ洗涤３次；用ＥＣＬ进行显色处理［１１］。
１．２．４　拟南芥总蛋白提取及抗血清检测　将野生
型拟南芥、ｐａｃ－１杂合自交种子（ＳＡＬＫ＿０１２３２０）和
ＰＡＣＯＥ种子经次氯酸钠消毒后，种植在装有１／２ＭＳ
培养基的三角瓶中［１２］，在光照培养箱中２４ｈ光照培
养，光照强度１００μｍｏｌ／（ｍ
２·ｓ），温度２２℃。取３
周龄的植物叶片材料，经液氮研磨后，每 ｍｇ鲜质量
加入１０μＬ蛋白提取缓冲液（１２５ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ
（ｐＨ６．８）、质量分数４％ＳＤＳ、体积分数２０％甘油和
１００ｍｍｏｌ／Ｌ巯基乙醇），５５℃提取１ｈ。提取的蛋
白样品经１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分离后，进行蛋白免疫印
迹检测。
２　结果与分析
２．１　重组质粒ｐＥＴ２８ａ－ＰＡＣ的构建和鉴定
以ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ－ＡＴ２Ｇ４８１２０质粒为模板，进行
ＰＣＲ扩增。扩增条带经ＢａｍＨⅠ单酶切后构建至
ｐＥＴ－２８ａ的多克隆位点。由图１可以看到，阳性质
粒经ＢａｍＨⅠ单酶切验证获得５．３ｋｂ的质粒骨架
和０．９ｋｂ的单插入；再经ＸｂａⅠ单酶切验证为正向
插入（若是反向插入，则ＰＡＣｃＤＮＡ和ｐＥＴ－２８ａ质
粒各有一个ＸｂａⅠ，距离为０．９ｋｂ）。测序结果
表明，酶切验证获得的阳性质粒ＰＡＣ 序列完全正
确。
图１　重组质粒ｐＥＴ２８ａ－ＰＡＣ的酶切验证
Ｍ．ＤＮＡ　ｌａｄｄｅｒ；１．ｐＥＴ２８ａ－ＰＡＣ的ＢａｍＨⅠ酶切；
２．ｐＥＴ２８ａ－ＰＡＣ的ＸｂａⅠ酶切
Ｆｉｇ．１　Ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｐＥＴ２８ａ－ＰＡＣ
Ｍ．ＤＮＡ　ｌａｄｄｅｒ；１．ｐＥＴ２８ａ－ＰＡＣ　ｄｉｇｅｓｔｅｄ　ｂｙ　ＢａｍＨⅠ；
２．ｐＥＴ２８ａ－ＰＡＣ　ｄｉｇｅｓｔｅｄ　ｂｙ　ＸｂａⅠ
２．２　重组质粒ｐＥＴ２８ａ－ＰＡＣ的原核表达和纯化
将ｐＥＴ２８ａ－ＰＡＣ转入大肠杆菌表达菌株ＢＬ２１
（ＤＥ３）中，利用１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＩＰＴＧ于３７℃诱导表达４
ｈ。取诱导前后的大肠杆菌进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳检
测，由图２可见，在分子质量为３３和４５ｋｕ处各出
现１条诱导型蛋白条带。利用Ｎｉ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　６Ｆａｓｔ
Ｆｌｏｗ对该蛋白进行纯化富集，为了进一步验证被富
集的诱导条带为 Ｈｉｓｘ６－ＰＡＣ，采用 Ｈｉｓｘ６－标签抗体
进行蛋白免疫印记验证，结果（图２）表明，该富集蛋
白含有 Ｈｉｓｘ６标签。
图２　重组质粒ｐＥＴ２８ａ－ＰＡＣ的诱导表达
Ｍ．Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｍａｒｋｅｒ；１．诱导前的ＢＬ２１（ＤＥ３）／
ｐＥＴ２８ａ－ＰＡＣ菌液；２．ＩＰＴＧ诱导后的ＢＬ２１（ＤＥ３）／
ｐＥＴ２８ａ－ＰＡＣ菌液；３．上柱蛋白穿出液；
４．１００ｍｍｏｌ／Ｌ咪唑蛋白洗脱液
Ｆｉｇ．２　Ｉｎｄｕｃｅｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｐＥＴ２８ａ－ＰＡＣ
Ｍ．Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｍａｒｋｅｒ；１．ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａｂｅｆｏｒｅ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ；
２．ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａｉｎｄｕｃｅｄ　ｗｉｔｈ　ＩＰＴＧ；
３．Ｆｌｏｗ－ｔｈｒｏｕｇｈ　ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ　ａｆｔｅｒ　ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　Ｎｉ　２＋ｒｅｓｉｎ；
４．Ｅｌｕｔｅｄ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｗｉｔｈ　１００ｍｍｏｌ／Ｌ　ｉｍｉｄａｚｏｌｅ
３７１第１０期 王　玥，等：拟南芥叶绿体发育必需蛋白ＰＡＣ的原核表达及多克隆抗体制备
　　鉴于 Ｈｉｓｘ６－ＰＡＣ属于可溶性表达，在纯化过程
中会引入大肠杆菌杂质蛋白，因此采用割胶和电洗
脱的方法纯化２次，并采用 ＢＳＡ 质量浓度梯度
（１．０，０．５，０．２５，０．１２５ｍｇ／ｍＬ）对纯化产物进行相
对定量，测得纯化的 Ｈｉｓｘ６－ＰＡＣ重组蛋白质量浓度
约为０．３ｍｇ／ｍＬ（图３）。
图３　重组蛋白 Ｈｉｓｘ６－ＰＡＣ的纯化及定量
１～４．分别为１．０，０．５，０．２５，０．１２５ｍｇ／ｍＬ　ＢＳＡ；
５．割胶纯化后的 Ｈｉｓｘ６－ＰＡＣ
Ｆｉｇ．３　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ
ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｉｓｘ６－ＰＡＣ
１－４．１．０，０．５，０．２５，０．１２５ｍｇ／ｍＬ　ＢＳＡ；
５．Ｇｅｌ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｈｉｓｘ６－ＰＡＣ
２．３　Ｈｉｓｘ６－ＰＡＣ抗血清的制备与检测
将纯化得到的Ｈｉｓｘ６－ＰＡＣ重组蛋白进行家兔免
疫试验，对收集的免疫后血清进行蛋白质免疫印迹
检测。结果（图４）表明，在对 Ｈｉｓｘ６－ＰＡＣ抗血清进
行１∶５　０００倍稀释后，能够清晰检测到低至１ｎｇ的
Ｈｉｓｘ６－ＰＡＣ重组蛋白。
图４　Ｈｉｓｘ６－ＰＡＣ抗血清的蛋白免疫印迹检测
１～３．１００，１０，１ｎｇ的 Ｈｉｓｘ６－ＰＡＣ抗原
Ｆｉｇ．４　Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ａｎｔｉｓｅｒａ　ｔｏ　Ｈｉｓｘ６－ＰＡＣ
１－３．１００，１０，１ｎｇ　ｏｆ　Ｈｉｓｘ６－ＰＡＣ　ａｎｔｉｇｅｎ
２．４　ｐａｃ－１突变体的白化表型
已报道的ｐａｃ－１突变体均会白化致死［４－６］。在
１／２ＭＳ培养基上种植野生型拟南芥（ＷＴ）和ｐａｃ－１
杂合自交种子，由图５结果可见，与野生型拟南芥相
比，３周龄的ｐａｃ－１纯合突变体呈现出白化表型，并
发育出可辨识的嫩黄色真叶组织。表明在ｐａｃ－１突
变体中，ＰＡＣ缺失导致叶绿体不能够正常发育，叶
绿素合成能力减弱，与已有的报道结论“ＰＡＣ基因
敲除致死”［６－７］相一致。
图５　野生型拟南芥和ｐａｃ－１突变体的表型
ＷＴ．野生型；ｐａｃ－１．ｐａｃ－１突变体
Ｆｉｇ．５　Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ　ｏｆ　ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ　ａｎｄ　ｐａｃ－１ｍｕｔａｎｔ
ＷＴ．Ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ；ｐａｃ－１．ｐａｃ－１ｍｕｔａｎｔ
２．５　植物ＰＡＣ蛋白的表达量
按每ｍｇ鲜质量幼嫩植物加入１０μＬ提取液提
取野生型拟南芥、ｐａｃ－１纯合突变体和ＰＡＣＯＥ的总
蛋白，对３种植物样品中ＰＡＣ蛋白含量进行蛋白免
疫印记检测，使用１ｎｇ的 Ｈｉｓｘ６－ＰＡＣ重组蛋白抗原
作为阳性对照。图６显示，在ｐａｃ－１样品中，与叶绿
体发育相关的捕光天线色素蛋白（ＬＨＣＢ）的表达量
明显下降，这与ｐａｃ－１突变体白化表型一致。由图６
还可知，在野生型植物叶片中检测到１条分子质量
约为３５ｋｕ的蛋白条带，该蛋白条带在ｐａｃ－１样品
中缺失，但在过表达样品ＰＡＣＯＥ中表达量显著提
高。这些数据表明，在野生型拟南芥中检测到的３５
ｋｕ的蛋白条带为野生型的ＰＡＣ。
图６　Ｈｉｓｘ６－ＰＡＣ抗血清在植物样品中的特异性检测
１．１ｎｇ　Ｈｉｓｘ６－ＰＡＣ抗原；２～４．分别为野生型、
ｐａｃ－１突变体、ＰＡＣＯＥ叶片总蛋白
Ｆｉｇ．６　Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＰＡＣ　ｉｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｐｌａｎｔ　ｌｉｎｅｓ
１．１ｎｇ　Ｈｉｓｘ６－ＰＡＣ　ａｎｔｉｇｅｎ；２－４．Ｔｏｔａｌ　ｌｅａｆ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｆｒｏｍ
ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ，ｐａｃ－１ｍｕｔａｎｔ　ａｎｄ　ＰＡＣＯＥ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ
３　讨　论
自Ｐａｃ－１突变体１９９４年被首次发现以来［４］，由
于其纯合致死的表型，并没有关于其功能研究的深
入报道。为了深入研究ＰＡＣ蛋白在叶绿体发育过
４７１ 西北农林科技大学学报（自然科学版） 第４４卷
程中的作用，本研究制备了其多克隆抗体。由于
Ｈｉｓｘ６－ＰＡＣ的可溶性表达，在纯化 Ｈｉｓｘ６－ＰＡＣ重组
蛋白时，可能会因蛋白间的相互作用造成大肠杆菌
杂质蛋白的污染［１３］，从而对后续免疫试验产生不利
影响，因此采取了进一步割胶纯化。２次割胶纯化
后的Ｈｉｓｘ６－ＰＡＣ在纯度和浓度上都能够满足后续免
疫试验的需要。
研究表明，具有３１３个氨基酸残基的ＰＡＣ蛋白
的前２２个氨基酸残基为叶绿体定位信号肽，切去信
号肽的成熟野生型ＰＡＣ蛋白的分子质量约为３５
ｋｕ［１４］。本研究制备的ＰＡＣ抗血清在植物样品中检
测到了相应分子质量大小的蛋白信号。但是，拟南
芥叶绿体蛋白组可能包含有３　０００余种蛋白质［１５］，
而ｐａｃ－１突变体属于叶绿体发育突变体，其叶绿体
发育受阻可能导致很多叶绿体功能蛋白不能够正常
积累，如本试验中ｐａｃ－１突变体的ＬＨＣＢ积累严重
下降。因此，仅用野生型植株和ｐａｃ－１突变体不足
以证实该３５ｋｕ信号就属于ＰＡＣ蛋白。在本试验
中，加入了ＣａＭＶ　３５Ｓ启动子调控的ＰＡＣ过表达
材料ＰＡＣＯＥ来进一步证实，结果表明制备的ＰＡＣ
抗血清有效。
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５７１第１０期 王　玥，等：拟南芥叶绿体发育必需蛋白ＰＡＣ的原核表达及多克隆抗体制备