全 文 ：第 36卷第 2期　　　　　　　　　　　　　　　 上海师范大学学报(自然科学版) Vol.36, No.2
2 0 0 7年 4月　　　　　　 　　　　　JournalofShanghaiNormalUniversity(NaturalSciences) 2 0 0 7 , Apr.
拟南芥中一个镍离子转运蛋白的亚细胞定位
王奋飞 1, 2 ,王鹏程 2, 3 ,董瑞斌 1 ,杨仲南 2 ,崔永兰 2
(1.南昌大学 环境科学与工程学院 , 南昌 330031;2.上海师范大学 生命与环境科学学院 ,上海 200234;
3.烟台大学 体育学院 ,烟台 264005)
摘　要:离子的跨膜转运是细胞获取养分的重要环节 ,亦是植物在组织和器官水平上进行养
分吸收运移的基础.在植物中镍(Ni)元素主要以 Ni2+的形式存在 ,并通过 Ni2+转运蛋白将其
跨膜转运至相应的组织器官 ,参与氢酶和脲酶的合成.生物信息学分析表明 ,拟南芥中一个
Ni2+转运蛋白 AT2G16800含有叶绿体定位信息.克隆该基因 5′端编码转运肽的 272bp片段 ,
与绿色荧光蛋白(GFP)基因融合后 ,在拟南芥中高效表达 ,对其进行了亚细胞定位的研究.转
基因植株通过共聚焦扫描显微镜的观察 ,发现 GFP荧光信号只存在于叶绿体中 ,该结果表明
AT2G16800为叶绿体蛋白.
关键词:镍离子转运蛋白;转运肽;亚细胞定位;叶绿体
中图分类号:Q344+.13　　文献标识码:A　　文章编号:1000-5137(2007)02-0071-06
　　　　　　　　　　
收稿日期:2007-02-20
基金项目:上海市教委项目(06DZ016)资助.
作者简介:王奋飞(1982-), 男 ,南昌大学环境科学与工程学院硕士研究生;崔永兰(1974-),女 , 上海师范大学生
命与环境科学学院讲师 ,通讯作者.
0　引　言
叶绿体是高等植物以及藻类中的一类重要的细胞器 , 由叶绿体膜 、类囊体和基质 3部分构成 ,其主
要功能是进行光合作用 , 另外还参与氨基酸 、脂肪酸 、植物生长素 、核苷酸 、维生素以及次生代谢产物的
合成[ 1] .拟南芥中约有 4 255个核基因编码的叶绿体蛋白质 ,叶绿体的正常发育需要这些核基因和叶绿
体基因的相互协调.拟南芥基因组序列分析表明 , 14%的核基因产物定位在叶绿体中[ 2] .目前 ,人们利
用蛋白质组学技术从叶绿体中分离得到 1 205个蛋白质 [ 3 ～ 7] ,但是仅有 585个核基因编码的叶绿体蛋
白的亚细胞定位得到进一步的实验验证.
植物生长发育所需的矿物质元素大部分来自于土壤 ,经植物根部吸收后 ,通过不同的转运器转运至
相应的组织器官 ,参与各自的生理过程.Ni2+对植物生长发育的作用已经有许多报道 [ 8 ～ 10] ,表明其在植
物中的主要功能是参与氢酶和脲酶的合成 ,并影响两者的活性[ 11 ～ 13] .拟南芥基因组注释信息(TAIR,
htp://www.arabidopsis.org)表明 , 蛋白质 AT2G16800与 Ni2+的转运有关 , 并且我们通过 TargetP
(htp://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP)软件分析 ,得知该蛋白质 N末端具有转运肽(transitpeptide),
可能将该蛋白定位于叶绿体中.本文通过构建 AT2G16800的转运肽和 GFP的融合蛋白 ,对该蛋白进行
亚细胞定位研究.
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　植物材料
野生型拟南芥 (Arabidopsisthaliana)Col-0,由本实验室种植.培养条件为:22℃, 16h光照 /8h
黑暗.
1.1.2　菌株和质粒
大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α菌株由本实验室提供 ,农杆菌 ASE菌株 、含 GFP的质粒 pEGFP
(Clontech)和植物双元表达载体 pMON530由中国科学院上海植物生理生态研究所黄海研究员提供.
1.1.3　试剂
各种酶和生化试剂分别购自上海生工 、大连宝生物和 Sigma等公司.
1.1.4　引物合成
包含基因 At2g16800N端编码转运肽片段的 272bp, 5 :ATGACGCCGCCATGGATACG3 :gtccatggTC-
GACGCATCGGTTTGAGA(ccatgg为引入的 NcoI位点).GFP内部引物序列为 5 :GTAAACGGCCA-
CAAGTTCAGCG, 3 :GATGCCGTTCTTCTGCTTGTCG.M13引物为 5 :GAGCGGATAACAATTTCACACA-
CAGG, 3 :CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC.所有引物均由上海生工合成.
1.2　方法
1.2.1　质粒提取 、DNA片段克隆和重组质粒鉴定
参照分子克隆实验指南[ 14] .
1.2.2　DNA片段回收
采用 BioDev公司回收试剂盒回收.
1.2.3　农杆菌介导的拟南芥遗传转化
参照浸花法 [ 15]进行.
1.2.4　转基因 T0代种子筛选
种子用 70%乙醇 +0.01%TritonX-100混合液浸泡 10min,无菌水冲洗 4次 ,用 Topagar(0.1%琼
脂溶液)均匀涂布在卡那霉素抗性(50μg/mL)的 PNS固体培养基上.4℃春化 2d后 ,移入培养室中
培养.
1.2.5　转基因植株的 PCR检测
以筛选出来的 T1代植株的总 DNA为模板 ,采用 GFP引物进行 PCR扩增.
1.2.6　转基因植株的激光扫描共聚焦显微镜的观察
用激光扫描共聚焦显微镜(LSM5 Pascal, Zeiss)观察叶肉细胞中 GFP的表达 , 采用 40倍油镜进行
观察 ,激发光波长为 488nm,带通 BP505 ～ 530nm,长通 LP560nm.
2　结果
2.1　亚细胞定位的表达载体构建
通过 TargetP软件预测 ,发现 Ni2+转运蛋白 AT2G16800N端 78aa处具有转运肽结构.以 Col-0基
因组 DNA为模板 , PCR扩增一段包含转运肽的 DNA序列 ,长度为 272bp,将其命名为 Nic.Nic经 T-A
克隆连接至 pMD18-Tvector载体(Takara,日本),由 M13引物鉴定方向后 ,将正向插入克隆用 KpnI和
NcoI双酶切后连接至用相同酶切过的 pEGFP载体中 ,使 Nic与 GFP形成融合基因.随后鉴定阳性克隆 ,
使用 KpnI和 EcoRI将 Nic-EGFP融合基因连接至双元表达载体 pMON530中 ,构建 pMON530-Nic-
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EGFP表达载体(图 1).同时构建 pMON530-EGFP表达载体作为本研究中的阳性对照 , 方法参照王鹏
程等的载体构建 [ 16] .
图 1　叶绿体亚细胞定位双元载体 pMON530-Nic-EGFP的构建
2.2　转基因植株的筛选
将质粒 pMON530-Nic-EGFP导入农杆菌 ASE,采用农杆菌介导的浸花法转化拟南芥.T1代种子
在含有卡那霉素(50μg/mL)的抗性平板中筛选 ,得到 T1代植株(图 2A).
A.转入 pMON530-Nic-EGFP质粒的植株 　　B.转入 pMON530-EGFP质粒的植株
图 2　转基因植株抗性平板筛选结果
2.3　外源基因整合及表达检测
2.3.1　目的基因的 PCR检测
取移栽后的 T1代植株 20株 ,用 GFP的内部引物进行分子检测 , PCR结果全部为阳性(图 3给出部
分结果).
2.3.2　报告基因 GFP的表达
我们对 PCR检测结果为阳性的植株用激光共聚焦显微镜观察 GFP的表达 ,结果显示在 488nm的
激发光下 ,扣除野生型 Col-0叶绿体自发荧光背景值 ,在 pMON530-Nic-EGFP转基因植株中 , GFP信
号与叶绿体自发荧光共定位在叶绿体中(图 4).该结果表明 ,基因 AT2G16800中的 Nic所编码的肽段具
有转运肽的功能 ,能够将蛋白质定位在叶绿体中.
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M.DL2000Marker;;1-10泳道:转基因植株;11泳道:阳性对照;12泳道:阴性对照
图 3　pMON530-Nic-EGFP转基因植株的PCR鉴定
A～ C野生型 Col-0中的 GFP荧光 , D～ F阳性对照 35S::GFP的 GFP荧光 , G～ IAT2G16800的 GFP荧光.
其中 A、D、G为叶绿体自发荧光 , B、E、H为 GFP荧光 , C、F、I为两个通道叠加后效果.标尺 , 10um
图 4　转基因拟南芥中叶片细胞的 GFP观察
3　讨　论
植物中含量丰富的金属元素如 Fe, Zn, Cu, Mn等的转运蛋白已有相当多的报道[ 17 ～ 20] ,它们大多
是 ZIP家族成员 ,该家族是生物界普遍存在的金属转运蛋白家族.ZIP蛋白共同的特征是具有 8个跨膜
结构域 ,在膜内侧跨膜结构域 3和 4之间存在一个高度保守的组氨酰基序列 ,该序列对于蛋白的离子结
合有重要意义[ 22] .国内外的众多研究证明 , Ni2+是脲酶的金属辅基 ,位于脲酶的活性位点 ,可以催化脲
水解成 CO2和 NH4+[ 11, 13] ,广泛分布于高等植物 、藻类 、真菌和细菌中.目前为至 ,已经从细菌中克隆得
与 Ni2+转运有关的基因有 HoxN, NixA, HupN,和 UreH等 [ 16, 17] ,但还未曾从高等植物中克隆到与 Ni2+
有关的基因.
通过对拟南芥基因组数据进行分析 , 发现拟南芥中存在两个 Ni2+转运蛋白 AT2G16800和
AT4G35080,它们同属于高亲合 Ni2+转运蛋白家族 ,具有 Ni2+转运活性.这两个蛋白具有非常高的同源
性(69%),在水稻中也存在两个同源性非常高的转运蛋白 -OS06G0116400和 OS03G0165700,同源性
分别为 73%和 65%,并且这 4个蛋白在 C端都具有高亲合 Ni2 +转运蛋白的高度保守序列(NicO).另
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外 ,在原核生物中也存在同一类的转运蛋白 ,同样具有 NicO结构.该数据说明 Ni2+转运蛋白在生物进
化过程中高度保守 ,并且具有非常重要的生理功能.
蛋白质在细胞中的定位对于明确其功能和参与的代谢途径起着极其重要的作用.本研究主要利用
生物信息技术 ,预测出 AT2G16800 N端具有转运肽结构 ,并利用转运肽和 GFP构建融合蛋白的方法进
行蛋白亚细胞定位 ,结果表明该蛋白定位于叶绿体中;并且通过蛋白结构分析 ,预测此 Ni2 +转运蛋白为
叶绿体膜蛋白 ,为进一步研究 Ni离子在光合作用中的功能奠定了基础.
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Subcelularlocalizationofanickeliontransportprotein
inArabidopsisthaliana
WANGFen-fei1, 2 , WANGPeng-cheng2, 3 , DONGRui-bin1 , YANGZhong-nan2 , CUIYong-lan2
(1.CollegeofEnvironmentalScienceandEngineering, NanchangUniversity, Nanchang330031, China;
2.ColegeofLifeandEnvironmentalScience, ShanghaiNormalUniversity, Shanghai200234, China;
3.CollegeofPhysicalEducation, YantaiUniversity, Yantai264005, China)
Abstract:Thetransmembranetransportationofnutritionionisanimportantprocessthatthecellsobtainnutrition.Itisalsothe
basisfornutritiontotransportattheleveloftissueandorganinplant.AT2G16800, aNickeliontransportproteininArabidopsis
thaliana, waspredictedtobeachloroplastproteinbysoftwareofbioinformatics.Inthiswork, thesubcelularlocalizationofthis
proteinwasconfirmedexperimentally.The272bpfragmentofthe5sequenceofthisgenewasclonedandfusedwithGFPtocon-
structabinaryvectorpMON530-Nic-EGFPforgenetictransformation.Onconfocallaser-scanningmicroscopy, greenfluores-
centsignalswerelocalizedinchloroplastsintransgenicArabidopsisplants.TheresultssuggestthatAT2G16800 encodedachlo-
roplastprotein.
Keywords:nickeliontransportprotein;transitpeptide;subcellularlocalization;chloroplast
(责任编辑:吴　澄)
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