全 文 ：植物学通报 2006, 23 (3): 249~254
Chinese Bulletin of Botany
收稿日期: 2005-12-20; 接受日期: 2006-03-07
基金项目: 科技部重大基础研究前期研究专项(973预研) (2003CCA01100)
* 通讯作者 Author for correspondence. E-mail: znyang@shnu.edu.cn
.研究报告.
拟南芥中一个未知功能蛋白的叶绿体亚细胞定位研究
王鹏程1 王晨1 米华玲2 周根余1 杨仲南1*
(1上海师范大学生命与环境科学学院 上海 200234)
(2中国科学院上海植物生理生态研究所 上海 200032)
摘要 生物信息学分析表明, 模式植物拟南芥叶绿体中含有大约4 000多种蛋白质, 目前只分离得到1 000
多种, 其他预测的叶绿体蛋白的实验验证对叶绿体功能研究有重要意义。本文对一个预测的叶绿体未知
功能蛋白AT5G48790进行了亚细胞定位研究。我们克隆了该基因5端长178 bp的DNA片段, 与绿色荧光
蛋白(GFP)基因构建重组载体pMON530-cTP-GFP。转基因植株通过激光共聚焦显微镜观察, GFP只在
叶绿体中特异表达。实验结果表明, AT5G48790的确为叶绿体蛋白。本实验方法也可用于其他预测的蛋
白质的实验验证。
关键词 融合蛋白, 亚细胞定位, 转运肽
Study of Subcellular Localization of the Expressed Protein in
Arabidopsis thaliana
Pengcheng Wang1, Chen Wang1, Hualing Mi2, Genyu Zhou1, Zhongnan Yang1*
1(College of Life and Envionment Science, Shanghai Normal University, Shanghai 200234)
2(Shanghai Institute Plant Physiology and Ecology, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, 200032)
Abstract Bioinformatics analysis has revealed about 4 000 proteins in chloroplasts; however, only
about 1 000 proteins have been validated. Thus, we established an experimental system to verify
predicted chloroplast proteins. At5g48790 was predicted to be an Arabidopsis chloroplast protein.
The 178 bp segment of the 5 sequence of this gene was cloned and fused with GFP to construct a
binary vector pMON530-cTP-GFP for genetic transformation. On confocal laser-scanning microscopy,
green fluorescent signals were localized in chloroplasts in transgenic Arabidopsis plants. The results
suggest that At5g48790 encodes a chloroplast protein. This experiment can also be used to investi-
gate other proteins predicted to be located in chloroplasts in Arabidopsis．
Key words fusion protein, subcellular localization, transit peptide
叶绿体是高等植物以及藻类中的一类重要
的细胞器, 由叶绿体膜、类囊体和基质 3部分
构成, 其主要功能是进行光合作用, 另外还参与
氨基酸、脂肪酸的生物合成(Motohashi et al.,
2001)。在拟南芥中, 叶绿体蛋白质绝大部分由
核基因组编码在细胞质中合成, 叶绿体基因组编
码 87个蛋白(Abdallah et al., 2000)。拟南芥基
因组序列分析表明, 14%左右的核基因编码的产
物定位在叶绿体中(Abdallah et al., 2000)。进
一步的生物信息学分析表明, 拟南芥中4 255个
250 23(3)
核基因组编码的蛋白质为叶绿体蛋白(Friso et
al., 2004), 其中25%蛋白质的功能尚不明确。
近年来, 亚细胞蛋白质组学的兴起为阐明
细胞器的组成、蛋白质的功能提供了强有力
的方法。Peltier等(2000)利用质谱和二维电泳,
结合N-端Edman测序分析, 系统地分离出豌豆
的 61个内腔蛋白和类囊体外周蛋白。在模式
植物拟南芥中, Peltier等(2002)又分离出81个内
腔和类囊体周边蛋白, Kieselbach等(2000)利用
蛋白质组学的方法对类囊体蛋白进行分析并确
定了2个蛋白, Ferro等(2003)利用液相色谱技术
分离出112个叶绿体膜蛋白, Schubert等(2002)
则从类囊体腔中分离出 36个蛋白, Friso等
(2004)利用多种方法从类囊体膜蛋白质组中分
离出154个蛋白质, Froehlich等(2003)利用改良
的二维电泳分离出了叶绿体膜蛋白 392 个,
Kleffmann等(2004)采用串联质谱技术(MS/MS)
从拟南芥中分离出690个叶绿体蛋白。这些实
验数据的积累, 为叶绿体蛋白质的亚细胞定
位、功能注释和大规模的蛋白质分选提供了
可能, 同时为优化叶绿体蛋白质的预测软件提
供了基础。
绝大多数叶绿体蛋白的 N端具有转运肽
(chloroplast transit peptide, CTP)序列特征, 通过
对细胞质中合成的蛋白质前体的N端进行序列
分析, 可以预测出构成叶绿体蛋白质组的蛋白
质。目前广泛应用的预测软件主要有
SignalP、TargetP、LumenP、ChloroP和
PSPORT等。叶绿体蛋白质的亚细胞定位实验
已有报道, Mitsuda等(2001)以cDNA与sGFP构
建融合蛋白用于研究AVP2基因在叶绿体中的
定位, Motohashi等(2001)以APG2基因N端转
运肽序列与sGFP构建融合蛋白研究其亚细胞
定位。我们利用包含转运肽的基因组DNA序
列建立了一套用于研究蛋白质在叶绿体中亚细
胞定位的实验方法, 并成功得到了未知功能蛋白
AT5G48790定位在叶绿体中的信息。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 野生型拟南芥(Arabidopsis
thaliana) Col-0, 由本实验室种植(培养室条件: 22
℃, 16小时光照 /8小时黑暗, 光通量密度 110
mmol.m-2.s-1, 湿度约为 30%)。
1.1.2 菌株和质粒 大肠杆菌(Escherichia
coli)DH5a菌株由本实验室提供, 农杆菌ASE菌
株、含GFP基因的质粒 pEGFP和植物双元表
达载体pMON530由中国科学院上海植物生理
生态研究所黄海研究员提供。
1.1.3 试剂 各种酶和生化试剂分别购自上海
生工、大连宝生物和 Sigma等公司。
1.1.4 引物合成 包含基因At5g48790 N端转
运肽片段的引物5端: ATG TCA CCG TCC TTC
TCC; 3端 GTC CAT GGT ATT GTT GTT ATA
CCC TC (下划线表示引入NcoⅠ位点); GFP内
部引物序列为5端: GTT GAA TTA GAT GGT
GAT AAT; 3端 ATA ACC TTC GGG CAT GGC
ACT C。
1.2 方法
1.2.1 质粒提取、DNA片段克隆和重组质
粒鉴定 参照分子克隆实验指南(Sambrook and
Russell, 2002)。
1.2.2 DNA片段回收 采用BioDev公司回收
试剂盒, 并按其说明书进行操作。
1.2.3 农杆菌介导拟南芥的转化 参照浸花
法(Clough and Bent, 1998)进行。
1.2.4 转基因T0代种子筛选 种子用70%乙
醇+0.01%Triton X-100混合液浸泡10分钟, 无
菌水冲洗4次, 用Top agar(0.1%琼脂水溶液)均
匀涂布在卡那霉素抗性(50 mg.mL-1)的PNS固
体培养基上, 4℃春化2天后, 在培养室中培养。
1.2.5 转基因植株的PCR检测 以筛选出来
的T1代植株的总DNA为模板, 采用GFP引物
进行 PCR扩增。
2512006 王鹏程 等: 拟南芥中一个未知功能蛋白的叶绿体亚细胞定位研究
1.2.6 转基因植株的激光扫描共聚焦显微
镜的观察 用激光扫描共聚焦显微镜(LSM510
META, Zeiss)观察叶肉细胞中GFP的表达, 观察
时物镜放大倍数为40倍, 激发光波长为488 nm,
带通BP 505~530 nm, 长通LP 560 nm。
2 结果
2.1 叶绿体亚细胞定位双元表达载体的构
建
利用KpnⅠ和EcoRⅠ限制性内切酶消化质
粒pEGFP, 获得包含GFP基因的750 bp片段, 将
其插入到相同内切酶消化的质粒pMON530中,
构建成用于叶绿体定位的双元载体pMON530-
GFP(图 1)。
2.2 At5g48790亚细胞定位表达载体的构
建
通过 TargetP(http://www.cbs.dtu.dk/ser-
vices/TargetP)预测, 发现未知蛋白 AT5G-
48790N-端48aa具有转运肽结构。以Col-0基
因组DNA为模板, PCR扩增一段包含转运肽的
DNA序列, 长度为 178 bp, 将其命名为 cTP。
cTP与pMD18-T vector 连接, 构建T-A克隆并
经M13引物鉴定方向, 将正向插入克隆命名为
cTP-T。cTP-T质粒经过KpnⅠ和EcoRⅠ双酶
切与用相同酶切过的载体pMON530-GFP连接
构建表达载体pMON530-cTP-GFP(图2)。
2.3 转基因植株的获得
将质粒pMON530-GFP与pMON530-cTP-
GFP分别导入农杆菌ASE, 采用农杆菌介导法
转化拟南芥。T0代种子萌发经卡那霉素抗性
筛选后, 分别得到T1代植株113棵(图3A)和42
棵(图 3B), 转化效率分别为 0.5%和 0.3%。经
移栽后, 转基因植株表型正常。
2.4 外源基因整合及表达检测结果
2.4.1 目的基因PCR检测 我们对筛选出来
的T1代植株各取20株采用GFP内部引物进行
分子检测。在转基因 pMON530-cTP-GFP中,
PCR检测结果全部呈阳性(图4给出部分结果);
在转基因pMON530-GFP植株中, PCR检测19株
为阳性, 转基因假阳性比率较低。
2.4.2 报告基因GFP表达 我们对PCR检测
出的阳性植株用激光共聚焦显微镜观察GFP的
表达实验, 结果显示在488 nm的激发光下, 扣除
野生型 Col-0 叶绿素自发绿色荧光背景(图
6A~C), 在pMON530-GFP转基因植株中, 观察到
绿色荧光在细胞质中呈弥散性分布(图6D~F);
在pMON530-cTP-GFP转基因植株中, GFP信号
图 1 叶绿体亚细胞定位双元载体 pMON530-GFP
的构建
Fig. 1 Construction of the binary vector pMON530-
GFP
图 2 双元表达载体 pMON530-cTP-GFP的构建
Fig. 2 Construction of the binary vector pMON530-
cTP-GFP
M.λDNA/PstⅠ Marker; Line1-2. pMON530-cTP-
GFP/KpnⅠ+EcoRⅠ
252 23(3)
与叶绿素自发荧光共定位在叶绿体中 (图
6G~I)。这些结果表明, GFP蛋白不含有信号肽
序列就不会进入细胞器中, 基因At5g48790中的
cTP具有转运肽的功能, 能将蛋白质定位在叶绿
体中。
3 讨论
蛋白质在细胞器中的定位对于明确其功能
和参与的代谢途径有着非常重要的作用。虽
然预测拟南芥中有4 000多种叶绿体蛋白, 但是
得到实验验证的只有 1 000多个。一方面, 仅
核酮糖 -1, 5-二磷酸羧化酶(ribulose-1, 5-
biphosphate carboxylase, RuBPase)系统就占叶
绿体可溶性蛋白质的50%~80%; 另一方面, 一些
叶绿体蛋白质丰度特别低, 膜蛋白的分离也很困
难, 因此很难用蛋白质组学方法进行验证。我
们采用的实验方法是蛋白质组学等方法的有力
补充, 载体构建过程简单, 所采用的报道基因采
用GFP突变系 EGFP(Phe-64 to Leu; Ser-65 to
Thr), 荧光强度、发光效率更高, 是一种方便、
经济的实验方法。
大规模进行蛋白质的亚细胞定位时, 可以
在5引物引入KpnI位点, 转基因时也可以采用
基因枪轰击烟草瞬间表达方法快速的获得亚细
胞定位的信息。我们的实验是基于TargetP软
件预测出基因具有N-端转运肽序列, 未预测出
转运肽信息的蛋白质采用本实验方法时需要通
过RT-PCR克隆 cDNA与构建GFP融合蛋白。
为进一步确定某蛋白质的亚细胞定位还需要分
离亚细胞结构并制备蛋白质的抗体进行免疫印
迹实验。此外, 对于具有导肽等信号肽的线粒
体及其他亚细胞组成蛋白的定位也适用。
通过该实验 , 确定未知功能蛋白
AT5G48790定位于叶绿体中, 为阐明该蛋白质
生物学功能以及参与的生命活动过程奠定了基
图 3 转基因 T1代植株卡那霉素抗性筛选结果
A. 转入 pMON530-cTP-GFP质粒; B. 转入 pMON530-GFP质粒
Fig. 3 Screening for transgenic plants (T1) on the KANR selection medium. Arabidopsis seedlings transformed
with pMON530-cTP-GFP(A) and pMON530-GFP(B)
图 4 pMON530-cTP-GFP转基因植株 PCR鉴定
Fig. 4 PCR analysis of the pMON530-cTP-GFP
transgenic plants
M. DL2000 Marker; Line 0. Wild type; Line 1. Plas-
mid of pEGFP; Line 2-10. Transgenic plants
A B
2532006 王鹏程 等: 拟南芥中一个未知功能蛋白的叶绿体亚细胞定位研究
图 5 转基因拟南芥细胞中荧光的观察
A~C. 野生型Col-0荧光观察; D~F. 转基因 pMON530-GFP植株荧光观察; G~I. 转基因 pMON530-cTP-
GFP植株荧光观察; 其中, A、D和G为GFP绿色荧光, B、E和H为叶绿素自发荧光, C、F和 I分别
为叠加后的结果
Fig. 5 The fluorence detection in the transgenic Arabidopsis cells
A-C. Wild type Col-0 fluorescent detection; D-F. Transgenic plants pMON530 -GFP fluorescent detection; G,
I. Transgenic plants pMON530-cTP-GFP fluorescent detection; A, D, G. Green fluorescence; B, E, H. Chloro-
phyll autofluorescence; C, F, I. Overlapping
础, 其他分子生物学技术的应用包括RNA干涉
对该基因的研究有可能深入揭示其编码的蛋白
质在叶绿体及光合作用过程中的作用。
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(责任编辑: 于昕)