全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第1期
收稿日期:2007-06-04
作者简介:金元昌(1969-),男,山东省日照市人,讲师,在读博士;研究方向:生物工程
下丘脑以正常的频率和幅度分泌促性腺激素释放激素 (gonadotropinreleasinghormone,GnRH)对生殖
功能的启动和维持是必要的,如果 GnRH分泌无脉冲性,或其脉冲频率降低,幅度降低,均可引起低促性腺
激素性功能减退综合征。近年来,在国内外许多地方均有发病的报道,为确保人和动物的生殖机能的健康
发展,对该病进行深入研究具有重要的实践意义。GnRH的化学结构为:(焦)谷-组-色-丝-落-甘-亮-精-脯-
甘-NH2[1]。迄今还未发现人与哺乳类动物 GnRH的结构有什么不同。根据文献[2],由 9个精氨酸作为转运肽
(transporter,TRS)的多肽不但有很强的穿透各种生物膜和组织的能力,还有强大的抗酶解能力[3]。因此,根
据人 GnRH及转运肽基因核苷酸序列,人工合成长达 90bp的 GnRH/TRS序列,亚克隆到 pMD-T载体上,经
鉴定与测序,确定获得 GnRH/TRS[4]。将 GFP(greenfluorescentprotein)的氨基端连接到人 GnRH及其转运肽
(TRS)的羧基端,在真核细胞中瞬间和稳定表达后,可见融合分子的绿色荧光集中于膜表面和内质网区。
GnRH/TRS-GFP分子可用于进一步研究 GnRH/TRS分子在活细胞中的装配和转运过程。
GnRH及其转运肽基因真核表达载体的构建及表达
金元昌
(1湖南科技大学生命科学学院,湘潭 411201;2广西大学生命科学与技术学院,南宁 530004)
摘 要: 目的 构建 GnRH/TRS与绿色荧光蛋白(GFP)的融合基因并表达。方法 利用 DNA重组技术,将
GnRH/TRS片段克隆至真核表达载体pEGFP-C1转化DH5α,重组体质粒pEGFP-C1-GnRH/TRS用LipoGen脂质体
进行转染至Hela细胞,核酸序列测定和Western印迹分析基因表达,激光共聚焦荧光显微镜观察活细胞内荧光布局。结
果 重组子pEGFP-C1-GnRH/TR成功构建。激光共聚焦荧光显微镜观察结果表明,GnRH/TRS-GFP融合基因的瞬间
和稳定表达均获得了相同结果。结论 GnRH/TRS-GFP融合蛋白具有GFP的自发荧光特性,且不影响GnRH/TRS分子
在细胞内的正确表达。
关键词: GnRH 转运肽 绿色荧光蛋白
ConstructionandExpressionofEucaryoticExpressionofGnRH
andTransporterGene
JinYuanchang
(1HunanUniversityofScienceandTechnology,Xiangtan411201;
2ColegeofLifeScienceandBiotechnologyGuangxiUniversity,Nanning530004)
Abstract: ObjectiveToconstructeAfusiongenecomposedofgreenfluorescentprotein(GFP)andGnRH/TRS
DNA thenexpres.MethodsCloneGnRH/TRSintoeucaryoticexpresionvectorpEGFP-C1byrecombinantDNA
technique.thentransformtoDH5α thenpEGFP-C1-GnRH/TR transfectintoHelabyLipoGen.Snucleotidsequenceand
Westernblotanalysiswereusedtoevaluatetheexpresionofthefusedgene.Laser-scanningconfocalmicroscopywas
usedto monitorthedistribution ofgreen fluorescence.ResultsRecombinantplasmid pEGFP-C1-GnRH/TR was
succesfulyconstructedLaser-scanningconfocalmicroscopyclearlyrevealedthatGnRH/TRS-GFPcanbetransientlyand
stablyexpresedinmammaliancels.ConclusionTheGFPtagdoesnotinterferewiththenaturalasemblyandtransport
ofGnRH/TRSmolecule.
Keywords: Gonadotropinreleasinghormone Transporter Greenfluorescentprotein
2008年第1期
1 材料与方法
1.1 菌种与质粒
宿主菌 DH5α、Hela细胞、pEGFP-C1载体、pYC1载体[4]为本室保存。
1.2 主要试剂
限制性内切酶 Bg/I、EcoRI、T4DNAligase购自宝生物工程公司;DNA回收试剂盒、质粒提取试剂盒购
自上海华舜公司;脂质体 LipoGen购自 InvivoGen公司;G418购自 Gibco公司。
1.3 pEGFP-C1-GnRH/TRS表达载体的构建
用 Bg/I、EcoRI分别双酶切 pEGFP-C1与 pYC1质粒[6],琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物并回收目的基因
片断,将载体片段、目的基因片段按摩尔比 1:3混合,用 T4DNA连接酶于 4°C连接过夜.取适量连接产物
用低温 CaCl2法转化 DH5α,同时用空载体质粒转化作为阳性对照。提取质粒,Bg/I/EcoRI双酶切初步鉴定
证实后,琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性产物,由上海联众基因科技研究院进行 DNA测序,即得所需重组体质粒
pEGFP-C1-GnRH/TRS。
1.4 pEGFP-C1-GnRH/TRS转染 Hela细胞
Hela细胞培养至对数生长期时转入 6孔板,每孔 5×105个细胞,重组体质粒 pEGFP-C1-GnRH/TRS用
LipoGen脂质体进行转染,对照组转染 pEGFP-C1空质粒,48h后于荧光显微镜下观察结果.用 400mg·L-1的
G418筛选阳性细胞克隆,获得稳定表达的单克隆细胞,记为 Hela/GFP/GnRH/TRS,并用未转染细胞 Hela
做阴性对照。
1.5 Western印迹分析
培养细胞用冰冷的 PBS洗 2次后,加入裂解缓冲液,内含 50mmol·L-1Tris-HCI(pH7.4),150mmol·L-1
NaCl,1%CHAPS(Pierce),100μg/μl-1PMSF,1μg/μlaprotinin,1μg/μl-1leupeptin(Calbiochem)。冰浴 30min后,
将裂解物以 12000×g离心 5min,收集上清。在 12%SDS-PAGE(singlecelgelelectrophoresis)上进行分离后,
电转移至硝酸纤维薄膜上。5%BSA封闭 30min后,将薄膜与兔抗 GFP多抗(Clonetech)室温孵育 1h。用
50mmol/LTris-Cl/1%Tween-20洗膜 3次后,与生物素标记的抗兔 IgG抗体(华美)室温孵育 1h。洗膜后,再
加入亲和素和生物素化辣根过氧化物酶(Vector)进行室温孵育 1h。最后用 ECL试剂盒(SantaCruz)检测结
果,并曝光于 X光片上。
2 结果
2.1 pEGFP-C1-GnRH/TRS质粒构建结果
重组体质粒经 Bg/I/EcoRI双酶切,获得约 90bp
(目的基因)和 4700bp(载体)的两条线性片段(图 1),
测序结果与原设计序列同源性达 100%。
2.2 共聚焦荧光显微镜检测
pEGFP-C1-GnRH/TRS质粒转染细胞结果转染后
24h激光共聚焦荧光显微镜下即可观察到经 pEGFP-
C1-GnRH/TRS转染的部分细胞发出较强的绿色荧
光,散在或成对出现,阳性细胞约为 40%。连续观察
发光细胞逐渐增多,约 72h达最高,有灶性发光细胞
出现(图 2)。
2.3 转染Hela细胞的Western印迹分析结果(图3)
3 讨论
GFP来源于水母 Aequoreavictoria,由 238个氨基
图 1 pEGFP-C1-GnRH/TRS、pEGFP-C1与 pYC1
质粒酶切产物的凝胶电泳图
图 2 转染 Hela细胞的荧光分析
1.DNA Markerλ-EcoT14 2.Bg/I/EcoRI-CutpEGFP-C1-GnRH/TRS
(4700bp,90bp)3.Bg/I-CutpEGFP-C1(4790bp) 4.Bg/I/EcoRI
-CutpYC1(2600bp,90bp) 5.DNAMarkerDL2000
a.Hela/GFP/GnRH/TRS b.Hela
(下转第155页)
金元昌:GnRH及其转运肽基因真核表达载体的构建及表达 123
2008年第1期
酸组成,分子质量 27ku。与其他发光性报告分子不同,GFP不需
要其他蛋白质、底物或共同因子的参与,紫外线激发即可产生明
亮、稳定的绿色荧光,但只有完整的 GFP才能激发出绿色荧光[5]。
GFP无种系依赖性,且对宿主细胞无毒性,目前已作为一种新型
的报告分子广泛应用于生命科学的众多领域,尤其在基因表达和
定位等方面更具优越性[6]。所用 pEGFP-C1载体中 EGFP为一种突
变型 GFP,其基因编码区含有 190多个沉默碱基突变,具有更适
合于在人类细胞中表达的开放读框,而且其 mRNA翻译效率提
高,GFP表达增强,所产生的荧光比野生型 GFP增强 35倍,因而
更适用于检测各类细胞中 GFP融合蛋白的表达情况。将构建好的融合 GFP表达载体通过 LipoGen脂质体
介导转染 Hela细胞(人子宫颈癌细胞系),24h后即可观察到转染的部分细胞发出较强的绿色荧光,散在或
成对出现,阳性细胞约为 40%,72h左右达最高,有灶性发光细胞出现。在 Hela细胞中成功地表达了融合
荧光蛋白,证实构建的 GFP与 GnRH/TRS融合基因可以在真核细胞中有效地表达,为低促性腺激素性功能
减退综合征治疗提供了理论基础。
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图 3 Western印迹分析转染后的 Hela细胞
1.Hela/GnRH/TRS2.Hela/GnRH/TRS-GFPP
3.Hela/GF 4.Protein molecularweightstandards
(66、45、36、29、24ku)
(上接第123页)
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