全 文 ：第４３卷　第２期
２０１５年２月
西北农林科技大学学报（自然科学版）
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ　Ａ＆Ｆ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔ．Ｓｃｉ．Ｅｄ．）
Ｖｏｌ．４３ Ｎｏ．２
Ｆｅｂ．２０１５
网络出版时间：２０１５－０１－０５　０８：５９ ＤＯＩ：１０．１３２０７／ｊ．ｃｎｋｉ．ｊｎｗａｆｕ．２０１５．０２．００９
网络出版地址：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／６１．１３９０．Ｓ．２０１５０１０５．０８５９．００９．ｈｔｍｌ
胡杨ＰｅＳＯＳ１对拟南芥盐诱导Ｈ２Ｏ２信号途径的调控
　［收稿日期］　２０１３－１０－２５
　［基金项目］　国家自然科学基金项目（３１２７０６５４，３１１７０５７０）；教育部科学技术研究项目（１１３０１３Ａ）；北京市自然科学基金项目（６１１２０１７）；
中央高校基本科研业务费专项（ＪＣ２０１１－２，ＴＤ－２０１２－０４）；北京市优秀博士学位论文指导教师专项（ＹＢ２００８１００２２０１）；高等学
校学科创新引智计划项目（１１１Ｐｒｏｊｅｃｔ，Ｂ１３００７）
　［作者简介］　王美娟（１９８３－），女，山东济宁人，博士，主要从事树木抗逆生理与分子生物学研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｃｏｌｏｒｈａｉｌ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ
　［通信作者］　陈少良（１９６９－），男，河北霸州人，教授，博士生导师，主要从事林木抗逆生理与分子生物学研究。
Ｅ－ｍａｉｌ：Ｌｓｃｈｅｎ＠ｂｊｆｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
王美娟１，王　洋１，申泽丹１，马旭君１，撒　刚１，邓澍荣１，
刘丹丹２，张玉红１，沈　昕１，陈少良１
（１北京林业大学 生物科学与技术学院，北京１０００８３；２房山区琉璃河镇大陶村委会，北京１０２４０３）
［摘　要］　 【目的】研究胡杨质膜Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白（ＳＯＳ１）通过Ｈ２Ｏ２ 信号途径对盐胁迫的感知和适应作
用。【方法】克隆胡杨质膜ＳＯＳ１基因（ＰｅＳＯＳ１），并将其转化到拟南芥中，比较野生型和转ＰｅＳＯＳ１基因拟南芥在
１００ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ胁迫下的萌发率，根长，干质量，Ｋ＋、Ｎａ＋和Ｃａ２＋含量，活体植株根尖离子流（Ｋ＋、Ｎａ＋和 Ｈ＋）的流
动情况，Ｈ２Ｏ２ 的产生和抗氧化酶活性的变化以及抑制剂对根尖离子流的影响，分析１００ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ胁迫下异源表
达ＰｅＳＯＳ１基因拟南芥与野生型拟南芥耐盐性的差异。【结果】在ＮａＣｌ胁迫下，转ＰｅＳＯＳ１基因拟南芥株系的萌发
率、根长和干质量明显高于野生型拟南芥；转ＰｅＳＯＳ１基因拟南芥Ｋ＋和Ｃａ２＋含量也高于野生型拟南芥，而Ｎａ＋含量
较野生型拟南芥低。１００ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ处理后，转ＰｅＳＯＳ１基因拟南芥中Ｋ＋和Ｎａ＋的平衡（Ｋ＋／Ｎａ＋值）与ＮａＣｌ胁
迫前相比下降幅度较小。转ＰｅＳＯＳ１基因植株在ＮａＣｌ胁迫下能更快地产生 Ｈ２Ｏ２，并使抗氧化酶保持较高的活性。
ＳＯＳ１抑制剂阿米洛利（Ａｍｉｌｏｒｉｄｅ）对 ＮａＣｌ胁迫下野生型和转基因拟南芥根尖离子流的变化有明显影响，用质膜
ＮＡＤＰＨ氧化酶抑制剂ＤＰＩ（抑制 Ｈ２Ｏ２ 的产生）处理后，转ＰｅＳＯＳ１基因拟南芥根尖Ｋ＋内流减弱，Ｎａ＋外流和 Ｈ＋
内流增强，植株维持Ｋ＋和Ｎａ＋平衡的能力减弱。【结论】在拟南芥中异源表达ＰｅＳＯＳ１基因可促进 Ｈ２Ｏ２ 快速产生，
维持了ＳＯＳ１ｍＲＮＡ的稳定性，调控了Ｋ＋和Ｎａ＋平衡，并激活了抗氧化防御系统，因而显著提高了其耐盐性。
［关键词］　胡杨；盐胁迫；转基因拟南芥；质膜Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白（ＳＯＳ１）；Ｈ２Ｏ２ 信号；Ｋ＋／Ｎａ＋平衡；离子流
［中图分类号］　Ｓ７９２．１１９；Ｑ７８５ ［文献标志码］　Ａ ［文章编号］　１６７１－９３８７（２０１５）０２－００７９－１３
Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｈ２Ｏ２ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｉｎ　ｓａｌｔ－ｓｔｒｅｓｓｅｄ
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｂｙ　ＰｅＳＯＳ１
ＷＡＮＧ　Ｍｅｉ－ｊｕａｎ１，ＷＡＮＧ　Ｙａｎｇ１，ＳＨＥＮ　Ｚｅ－ｄａｎ１，ＭＡ　Ｘｕ－ｊｕｎ１，
ＳＡ　Ｇａｎｇ１，ＤＥＮＧ　Ｓｈｕ－ｒｏｎｇ１，ＬＩＵ　Ｄａｎ－ｄａｎ２，
ＺＨＡＮＧ　Ｙｕ－ｈｏｎｇ１，ＳＨＥＮ　Ｘｉｎ１，ＣＨＥＮ　Ｓｈａｏ－ｌｉａｎｇ１
（１　Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００８３，Ｃｈｉｎａ；
２　Ｄａｔａｏ　Ｖｉｌｌａｇｅ　ｏｆ　Ｃｏｌｏｕｒｅｄ　Ｇｌａｚｅ　Ｒｉｖｅｒ　Ｔｏｗｎ，Ｆａｎｇｓｈａｎ　Ｄｉｓｔｒｉｃｔ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０２４０３，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：【Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ】Ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ　ａｉｍｅｄ　ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｒｏｌｅ　ｏｆ　ＰｅＳＯＳ１ｉｎ　ｓａｌｔ　ｓｅｎｓｉｎｇ　ａｎｄ　ａｄａｐｔｉｏｎ
ｔｈｒｏｕｇｈ　Ｈ２Ｏ２ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．【Ｍｅｔｈｏｄ】Ｐｌａｓｍａ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ（ＰＭ）Ｎａ＋／Ｈ＋ａｎｔｉｐｏｒｔｅｒ　ｇｅｎｅ　ＰｅＳＯＳ１ｏｆ　Ｐｏｐｕｌｕｓ
ｅｕｐｈｒａｔｉｃａ　ｗａｓ　ｃｌｏｎｅｄ　ａｎｄ　ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ　ｔｏ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ．Ｔｈｅｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ　ｉｎ　ｓａｌｔ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｂｅｔｗｅｅｎ
ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ　ａｎｄ　ＰｅＳＯＳ１－ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｐｌａｎｔｓ　ｗｅｒｅ　ｉｌｕｓｔｒａｔｅｄ　ｂｙ　ｃｏｍｐａｒｉｎｇ　ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ，ｒｏｏｔ
ｌｅｎｇｔｈ，ｂｉｏｍａｓｓ，ｃｏｎｔｅｎｔｓ　ｏｆ　Ｋ＋，Ｎａ＋ａｎｄ　Ｃａ２＋，ｆｌｕｘｅｓ　ｏｆ　ｒｏｏｔ　Ｋ＋，Ｎａ＋ａｎｄ　Ｈ＋，Ｈ２Ｏ２ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ａｎｔｉｏｘｉ－
ｄａｎｔ　ｅｎｚｙｍｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ａｎｄ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｏｎ　ｉｏｎ　ｆｌｕｘｅｓ　ｏｆ　ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ　ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ　ｕｎｄｅｒ　１００ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ
ｓａｌｔ　ｓｔｒｅｓｓ．【Ｒｅｓｕｌｔ】Ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｔｏ　ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ，ＰｅＳＯＳ１－ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｐｌａｎｔｓ　ｈａｄ　ｈｉｇｈｅｒ　ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ
ｒａｔｅ，ｒｏｏｔ　ｌｅｎｇｔｈ，ａｎｄ　ｂｉｏｍａｓｓ　ｕｎｄｅｒ　ＮａＣｌ　ｓｔｒｅｓｓ．ＰｅＳＯＳ１－ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｐｌａｎｔｓ　ａｌｓｏ　ｈａｄ　ｈｉｇｈｅｒ
ｃｏｎｔｅｎｔｓ　ｏｆ　Ｋ＋ａｎｄ　Ｃａ２＋ｂｕｔ　ｌｏｗｅｒ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｆ　Ｎａ＋．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｐｌａｎｔｓ　ｅｘｈｉｂｉｔｅｄ　ｌｏｗｅｒ　ｒａｔｉｏ　ｏｆ　Ｎａ＋／Ｈ＋ａｎ－
ｔｉｐｏｒｔ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｔｏ　ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ．Ｉｎ　ｒｏｏｔｓ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ，Ｈ２Ｏ２ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｍｏｒｅ　ｒａｐｉｄｌｙ　ｔｈａｎ
ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ　ｗｈｅｎ　ｐｌａｎｔｓ　ｗｅｒｅ　ｓｕｂｊｅｃｔｅｄ　ｔｏ　ＮａＣｌ　ｓｔｒｅｓｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ　ｅｎｚｙｍｅｓ　ｗｅｒｅ
ｈｉｇｈｅｒ．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｐｌａｎｔｓ　ｗｅｒｅ　ｕｎａｂｌｅ　ｔｏ　ｒｅｍａｉｎ　Ｋ＋／Ｎａ＋ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ　ｗｈｅｎ　ｓａｌｔ－ｉｎｄｕｃｅｄ　Ｈ２Ｏ２ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ｗａｓ　ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ　ｂｙ　ｄｉｐｈｅｎｙｌｅｎｅ　ｉｏｄｏｎｉｕｍ（ＤＰＩ），ａｎ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｏｆ　ＮＡＤＰＨ　ｏｘｉｄａｓｅ．【Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ】ＰｅＳＯＳ１ｉｎ－
ｃｒｅａｓｅｄ　ｓａｌｔ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｒａｐｉｄ　Ｈ２Ｏ２ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ｗｈｉｃｈ　ｍａｉｎｔａｉｎｅｄ　ｔｈｅ　ｓｔａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ＳＯＳ１ｍＲＮＡ，ｃｏｎ－
ｔｒｏｌｅｄ　Ｋ＋／Ｎａ＋ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ　ａｎｄ　ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ　ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ　ｄｅｆｅｎｓｅ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｐｏｐｕｌｕｓ　ｅｕｐｈｒａｔｉｃａ；ｓａｌｔ　ｓｔｒｅｓｓ；ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ；ＰＭ　Ｎａ＋／Ｈ＋ａｎｔｉｐｏｒｔｅｒ（ＳＯＳ１）；
Ｈ２Ｏ２ｓｉｇｎａｌｉｎｇ；Ｋ＋／Ｎａ＋ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ；ｉｏｎ　ｆｌｕｘ
　　质膜Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白（ＳＯＳ１）基因在植
物抗盐中的重要作用已广为人知。２００７年，Ｗｕ
等［１］用ＲＡＣＥ技术克隆了胡杨ＳＯＳ１蛋白的基因
ＰｅＳＯＳ１（ＧｅｎＢａｎｋ登录号：ＤＱ５１７５３０．１），其ｃＤ－
ＮＡ全长为３　６６５ｂｐ，包含一个长３　４３８ｂｐ的开放
读码框，编码１　１４５个氨基酸，理论分子质量为１２７
ｋｕ，预测此蛋白Ｎ端有１２个跨膜区，其跨膜区与其
他植物和微生物高度相似；Ｃ端有一个位于胞质内
的长亲水性尾巴，其氨基酸序列与拟南芥的质膜
Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白（ＡｔＳＯＳ１）相似度为６４％，
在盐胁迫下其蛋白水平会上调，转化到缺失 Ｎａ＋／
Ｈ＋逆向转运蛋白ＥｃＮｈａＡ 和 ＥｃＮｈａＢ活性的盐敏
感大肠杆菌ＥＰ４３２中后，发现可以抑制大肠杆菌对
盐的敏感性，提高其耐盐性。抗体定位试验结果证
明，ＰｅＳＯＳ１定位在质膜上，其功能是将细胞内的
Ｎａ＋排出胞外以避免胞质内过多 Ｎａ＋的积累；盐胁
迫下，胡杨叶片中ＰｅＳＯＳ１的表达上调，质膜 Ｈ＋－
ＡＴＰａｓｅ也同时上调；上调的质膜 Ｈ＋－ＡＴＰａｓｅ可
为ＰｅＳＯＳ１外排 Ｎａ＋ 提供动力［２］。Ｃｈｕｎｇ等［３］在
拟南芥中发现，在盐胁迫下本身不稳定的ＡｔＳＯＳ１
ｍＲＮＡ稳定性有所增加，主要是由活性氧介导所致；
ＡｔＳＯＳ１活性同时受转录后水平的调控［４］。但目前对
ＳＯＳ１和Ｈ２Ｏ２ 的相互作用机制尚不清楚。
本试验将胡杨的ＰｅＳＯＳ１基因转到拟南芥中，
通过实时荧光定量ＰＣＲ分析不同转基因株系拟南
芥中ＰｅＳＯＳ１表达量的差异；并利用３个ＰｅＳＯＳ１
表达量较高的株系进行耐盐性及ＰｅＳＯＳ１与 Ｈ２Ｏ２
相关性研究，比较野生型拟南芥和转ＰｅＳＯＳ１基因
拟南芥在盐胁迫下的萌发率、根长、离子含量、根尖
离子流、Ｈ２Ｏ２ 的产生及相关抗氧化酶活性等指标，
以期为探明胡杨ＰｅＳＯＳ１响应盐胁迫的作用机制奠
定基础。
１　材料与方法
１．１　材　料
１．１．１　供试植物　胡杨为新疆２年生胡杨实生苗，
４月份将其栽种在１０Ｌ塑料花盆里（１株／盆），培养
基质为土和砂按１∶１体积比混合的基质，置于北京
林业大学的苗圃中进行培养，培养期间视天气情况
定期浇水和除草，且每隔１周每桶苗木浇１ＬＨｏ－
ａｇｌａｎｄ全营养液。
拟南芥为哥伦比亚生态型（Ｃｏｌｕｍｂｉａ　ｅｃｏｔｙｐｅ，
Ｃｏｌ－０），由北京林业大学沈昕实验室留存。培养条件
为：温度２５／２２℃（昼／夜），相对湿度７０％，光照强度
１５０μｍｏｌ／（ｍ
２·ｓ），光照周期为８ｈ黑暗／１６ｈ光照。
１．１．２　菌株、质粒与试剂　大肠杆菌ＴＯＰ１０及感
受态，由北京林业大学沈昕实验室留存或制备；农杆
菌ＧＶ３１０１，购自北京科百奥生物科技有限责任公
司；中间载体ｐＥＮＴＲ／Ｄ－ＴＯＰＯ试剂盒（２　５８０ｂｐ，
筛选标记为卡那霉素），购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司。植物
稳定表达载体ｐＫ７ｍ３４ＧＷ２－８ｍ２１ＧＷ３Ｄ．０（ｐＫ７，
１５　８０１ｂｐ，筛选标记为壮观霉素），由北京林业大学
沈昕实验室留存。
ｒ　Ｔａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｅｘ　Ｔａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙ－
ｍｅｒａｓｅ，Ｔａｋａｒａ（宝生物工程大连有限公司）生产；
Ｓｉｌｗｅｔ－７７，美国ＧＥ公司生产；质粒提取试剂盒和胶
回收试剂盒，购自天根生化科技（北京）有限公司；
Ｇａｔｅｗａｙ　ＬＲ　ＣｌｏｎａｓｅⅡＥｎｚｙｍｅ　Ｍｉｘ、ＲＮＡ提取试
剂Ｔｒｉｚｏｌ　ｒｅａｇｅｎｔ和逆转录试剂盒 ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ? Ⅲ
Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ试剂盒，购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公
司；Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１５，购自Ｐｒｏｍｅｇａ；十二烷基硫酸钠
（ＳＤＳ）、二硫苏糖醇（ＤＴＴ）、ＤＥＰＣ、琼脂糖、氨苄青
０８ 西北农林科技大学学报（自然科学版） 第４３卷
霉素、卡那青霉素和壮观霉素，为Ｓｉｇｍａ公司生产；
胰蛋白胨、酵母提取物，为英国Ｏｘｏｉｄ公司生产；其
他普通国产分析纯试剂为北京化工厂生产。
１．２　方　法
１．２．１　胡杨ＲＮＡ提取与ｃＤＮＡ 一链的合成　按
照Ｔｒｉｚｏｌ说明书提取胡杨幼嫩叶片的总ＲＮＡ［２］，用
ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ?Ⅲ Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ试剂盒反转
录合成ｃＤＮＡ。
１．２．２　ＰｅＳＯＳ１的克隆　根据胡杨质膜ＰｅＳＯＳ１
（ＧｅｎＢａｎｋ登录号：ＤＱ５１７５３０．１）的序列，用Ｐｒｉｍｅｒ
Ｐｒｉｍｉｅｒ　５．０ 软件设计引物 （Ｓ－Ｐ１ｆ：５′－ＡＴＧＧＧ－
ＧＡＧＣＧＣＧＡＴＡＧＡＡＡＣＡＧ－３′，Ｓ－Ｐ１ｒ：５′－ＣＴＡＡ－
ＧＡＡＧＣＡＴＧＡＴＧＧＡＡＣＧＡＣ－３′）进行ＰＣＲ扩增。
ＰＣＲ体系为：２．５μＬ　１０×Ｔａｑ　ｂｕｆｆｅｒ，１７．５μＬ
ｄｄＨ２Ｏ，１μＬ　ｄＮＴＰ　ｍｉｘ （１０ｍｍｏｌ／Ｌ），引物（Ｓ－
Ｐ１ｆ、Ｓ－Ｐ１ｒ）各１μＬ，１μＬ　ＤＮＡ模板，１μＬ　Ｅｘ　Ｔａｑ
ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５Ｕ／μＬ）。反应条件为：９４℃预
变性５ｍｉｎ；９４℃变性３０ｓ，５８℃退火３０ｓ，７２℃延
伸３．５ｍｉｎ，３５个循环；７２℃反应后延伸１０ｍｉｎ。
用ｄｄＨ２Ｏ代替模板为阴性对照 。
１．２．３　载体的构建　ＰｅＳＯＳ１测序无误后，用带接
头的引物，即 ＣＡＣＣ＋Ｓ－Ｐ１ｆ和 Ｓ－Ｐ１ｒ扩增 Ｐｅ－
ＳＯＳ１，取定量ＰＣＲ产物按照ｐＥＮＴＲ／Ｄ－ＴＯＰＯ试
剂盒说明书直接构建中间载体ｐＥＮＴＲ／Ｄ－ＴＯＰＯ－
ＰｅＳＯＳ１；反应产物转化大肠杆菌ＴＯＰ１０后铺板，挑
单菌落提质粒，鉴定成功后按照 Ｇａｔｅｗａｙ　ＬＲ　Ｃｌｏ－
ｎａｓｅⅡ Ｅｎｚｙｍｅ　Ｍｉｘ说明书重组ｐＥＮＴＲ／Ｄ－ＴＯ－
ＰＯ－ＰｅＳＯＳ１与ｐＫ７，构建植物表达载体ｐＫ７－Ｐｅ－
ＳＯＳ１。利用Ｐｒｉｍｅｒ　Ｐｒｉｍｉｅｒ　５．０软件，设计鉴定检
测所用引物Ｓ－Ｐ２ｆ：５′－ＡＧＧＡＴＧＡＧＧＡＡＣＴＴＧＧＡ－
ＣＣＴＧ－３′，Ｓ－Ｐ２ｒ：５′－ＣＣＴＧＡＧＧＡＡＡＴＧＴＡＡＣＡＣ－
ＧＧＡＣ－３′，其ＰＣＲ产物长度约６００ｂｐ。ＰＣＲ反应
体系（２５μＬ）为：ｄｄＨ２Ｏ　１８μＬ，１０×Ｂｕｆｆｅｒ　２．５μＬ，
ｄＮＴＰ　１μＬ，Ｓ－Ｐ２ｆ１μＬ，Ｓ－Ｐ２ｒ１μＬ，ＤＮＡ　１μＬ，ｒ
Ｔａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　０．５μＬ。ＰＣＲ反应程序：９４
℃预变性５ｍｉｎ；９４℃变性３０ｓ，５８℃退火３０ｓ，７２
℃延伸３０ｓ，循环３０次；７２℃反应后延伸１０ｍｉｎ，
然后于１０℃保存。
１．２．４　拟南芥的转化　将ｐＫ７－ＰｅＳＯＳ１和空载体
ｐＫ７质粒（阴性对照）转化农杆菌ＧＶ３１０１后，用蘸
花侵染方法转化拟南芥［５］。用卡那霉素筛选拟南芥
转ＰｅＳＯＳ１阳性植株，再根据孟德尔分离定律筛选
纯合子，用其种子开展后续试验。ＰＣＲ鉴定时，阳
性对照为用质粒ｐＫ７作模板进行ＰＣＲ扩增；阴性
对照为用ｄｄＨ２Ｏ作模板进行扩增。
１．２．５　不同拟南芥株系ＰｅＳＯＳ１表达量的实时荧
光定量ＰＣＲ （Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ　ＰＣＲ）分析　取在人工营
养土中生长４周并用０和１００ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ处理３
ｄ的野生型（ＷＴ）、转空载体（ＶＣ）和转ＰｅＳＯＳ１基
因拟南芥，提取ＲＮＡ（ＲＮＡ提取方法同１．２．１），反
转录合成ｃＤＮＡ（方法同１．２．１），用荧光定量ＰＣＲ
仪（美国 Ｂｉｏ－Ｒａｄ　ＭＪ　Ｏｐｔｉｃｏｎ　２）进行 Ｒｅａｌ　ｔｉｍｅ
ＰＣＲ，检测盐处理对不同株系ＰｅＳＯＳ１基因表达量
的影响。ＰＣＲ反应体系（２５μＬ）为：２．５μＬ　１０×
ｂｕｆｆｅｒ，１７ μＬ　ｄｄＨ２Ｏ，１ μＬ　ｄＮＴＰ　ｍｉｘ （１０
ｍｍｏｌ／Ｌ），引物（Ｓ－Ｐ３ｆ（５′－ＧＴＧＡＡＣＡＧＡＡＣＧＧＴ－
ＧＴＡＧＧＧ－３′）、Ｓ－Ｐ３ｒ （５′－ＣＧＡＧＴＣＴＣＡＴＴＴＧＴ－
ＧＣＣＴＧＴ－３′）或内参基因Ａｃｔｉｎ的 Ａｃｔｉｎ－ｆ（５′－ＡＴ－
ＴＡＣＣＣＧＡＴＧＧＧＣＡＡＧＴＣＡ－３′）、Ａｃｔｉｎ－ｒ（５′－ＴＧ－
ＣＴＣＡＴＡＣＧＧＴＣＡＧＣＧＡＴＡＣ－３′））各１μＬ，ＤＮＡ
Ｅｖａｇｒｅｅｎ　ＧｒｅｅｎⅠ ＭＩＸ　１μＬ，１μＬ　ｃＤＮＡ 模板，
０．５μＬ　ｒ　Ｔａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（１０Ｕ／μＬ）。反应
条件为：９４℃预变性４ｍｉｎ；９４℃变性２０ｓ，５５℃退
火２０ｓ，７２℃延伸２０ｓ，４０个循环；７２℃反应后延
伸１０ｍｉｎ。以Ａｃｔｉｎ为内参基因，采用２－ΔΔＣｔ方法计
算ＰｅＳＯＳ１基因的相对表达量。
１．２．６　转基因拟南芥的耐盐性分析　１）盐胁迫对
转ＰｅＳＯＳ１基因拟南芥萌发率的影响。取野生型和
转ＰｅＳＯＳ１基因株系拟南芥的Ｔ３ 代纯合子种子，先
用质量分数２％次氯酸钠和体积分数７５％乙醇无菌
消毒处理，再用无菌水洗３次，然后播种在盐浓度分
别为０，１００和１５０ｍｍｏｌ／Ｌ的１／２ＭＳ培养基上，每
天观察并记录其萌发率，至第５天结束。
２）盐胁迫对转ＰｅＳＯＳ１基因拟南芥根长的影
响。拟南芥种子萌发３ｄ后（种子无菌处理方法同
上），在无菌条件下转移到含０和１００ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ
的１／２ＭＳ培养基上，为了保证试验处理条件的一
致性，需要将种子播在同一培养皿的同一水平线上，
且培养皿要垂直放，每１～２ｄ观察１次，拍照并测
量其根长，至第１２天结束。
１．２．７　盐胁迫下转基因拟南芥生理指标的变化　
１）盐胁迫对拟南芥干质量及Ｋ＋、Ｎａ＋、Ｃａ２＋含量的
影响。野生型与转ＰｅＳＯＳ１基因拟南芥种子萌发５
ｄ后，转移至含０，５０和１００ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ的直径９
ｃｍ花盆中，花盆中营养土和蛭石的体积比为１∶１
（用ＰＮＳ营养液泡过夜后使用），每盆４～６株，每个
株系种６盆，覆膜后避光培养２ｄ后见光，光照３ｄ
后揭膜，培养３周后取地上部分称取鲜质量，杀青后
１８第２期 王美娟，等：胡杨ＰｅＳＯＳ１对拟南芥盐诱导 Ｈ２Ｏ２ 信号途径的调控
烘干，称干质量，样品粉碎后消煮，用原子吸收分光
光度计测定 Ｋ＋、Ｎａ＋、Ｃａ２＋含量，材料培养与处理
等参见 Ｗａｎｇ等［６］的方法。
２）盐胁迫对拟南芥根尖离子流的影响。野生型
与转ＰｅＳＯＳ１基因拟南芥种子萌发后，均转移至含
０和１００ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ的１／２ＭＳ培养基上生长１
或７ｄ，以０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ处理作为对照（ＣＫ），测
定Ｋ＋、Ｎａ＋、Ｈ＋流的变化，具体步骤见 Ｗａｎｇ等［６］
和Ｓｕｎ等［７］的方法。因在０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ处理培
养基上生长１与７ｄ时根尖离子流的变化趋势一
致，因此对照仅列１ｄ时的结果。
３）ＳＯＳ１抑制剂阿米洛利（Ａｍｉｌｏｒｉｄｅ）对盐胁迫
下拟南芥根尖离子流的影响。野生型与转ＰｅＳＯＳ１
基因拟南芥种子萌发７ｄ后，转移至含０和１００
ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ的１／２ＭＳ培养基上生长７ｄ左右，
测定 Ｋ＋、Ｎａ＋、Ｈ＋ 流 的 变 化。在 含 ０ 和 １００
ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ的１／２ＭＳ液体培养基中，加入１００
μｍｏｌ／Ｌ　Ａｍｉｌｏｒｉｄｅ处理ＮａＣｌ胁迫前后拟南芥２ｈ，
再用含１００μｍｏｌ／Ｌ　Ａｍｉｌｏｒｉｄｅ的测试液泡３０ｍｉｎ，
然后测定其Ｋ＋、Ｎａ＋、Ｈ＋流的变化。
１．２．８　盐胁迫下转基因拟南芥根中 Ｈ２Ｏ２ 的产生
及抗氧化酶活性的变化　１）产生 Ｈ２Ｏ２ 的测定。在
１／２ＭＳ培养基上播种无菌处理的拟南芥种子，培养
拟南芥无菌组培苗，生长１周时，分别移到含有０
（ＣＫ）和１００ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ的１／２ＭＳ固体培养基
上（配制培养基时加入相应浓度的 ＮａＣｌ）分别培养
１０ｍｉｎ，２４ｈ和７ｄ，利用含５０μｍｏｌ／Ｌ　Ｈ２Ｏ２ 的探
针Ｈ２ＤＣＦＤＡ避光孵育处理５ｍｉｎ，用１／２ＭＳ液体
培养基洗去探针，荧光显微镜（Ｌｅｉｃａ　ＤＭＩ４０００Ｂ）下
检测其荧光强度并采集图像，用图像处理软件Ｉｍ－
ａｇｅ　Ｐｒｏ－Ｐｌｕｓ，在根尖上取６～８个点进行检测，计算
得到平均荧光强度，以其表示 Ｈ２Ｏ２ 水平。每个处
理取５个样本作重复，以降低个体差异带来的误差。
２）抗氧化酶活性的测定。将野生型和转Ｐｅ－
ＳＯＳ１基因拟南芥种子直接播种在用液体１／２ＭＳ
培养基浸泡过夜的培养土中，用保鲜膜覆盖保湿，２
ｄ后照光，３ｄ后揭膜，每周浇１次１／２ＭＳ液体培养
基和２次水，生长４周后，用１００ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ处
理３ｄ后采样，将样品立即置于液氮中保存。
超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）活性测定采用氮蓝四唑
（Ｎｉｔｒｏ　Ｂｌｕｅ　Ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ，ＮＢＴ）比色法，参
考Ｇｉａｎｎｏｐｏｌｉｔｉｓ等［８］和 Ｗａｎｇ等［９］的方法进行。谷
胱甘肽还原酶（ＧＲ）活性根据 ＮＡＤＰＨ的氧化反应
来测定，具体参考Ｇｉａｎｎｏｐｏｌｉｔｉｓ等［８］和Ｓｃｈａｅｄｌｅ［１０］
的方法进行。过氧化氢酶（ＣＡＴ）和抗坏血酸氧化
酶（ＡＰＸ）活性测定参考 Ｗａｎｇ等［６，８］的方法进行。
１．２．９　Ｈ２Ｏ２ 对盐诱导拟南芥根尖离子流的调控
　用ＤＰＩ（ＮＡＤＰＨ氧化酶的抑制剂）处理拟南芥，
测定根尖 Ｋ＋、Ｈ＋、Ｎａ＋流的变化情况，研究 Ｈ２Ｏ２
对盐诱导根尖离子流的调控作用。
取生长１周的拟南芥组培苗，其中野生型和转
ＰｅＳＯＳ１基因拟南芥均设４个处理：第Ⅰ组为阴性
对照，在测试液（含０．１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
ＭｇＣｌ２、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＣａＣｌ２、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＫＣｌ和２５
ｇ／Ｌ蔗糖，用 ＨＣｌ和ＫＯＨ调节ｐＨ至５．５）中适应
０．５ｈ后，直接测定Ｋ＋、Ｎａ＋、Ｈ＋流；第Ⅱ组为阳性
对照，在含１００μｍｏｌ／Ｌ　ＤＰＩ的１／２ＭＳ液体培养基
中处理２ｈ后，再在测试液中适应０．５ｈ，测定Ｋ＋、
Ｎａ＋、Ｈ＋流；第Ⅲ组：在含１００ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ的１／２
ＭＳ液体培养基中处理２ｈ后，再在测试液中适应
０．５ｈ，然后测定Ｋ＋、Ｎａ＋、Ｈ＋流；第Ⅳ组：在含１００
ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ和１００μｍｏｌ／Ｌ　ＤＰＩ的１／２ＭＳ液体
培养基中处理２ｈ后，在测试液中适应０．５ｈ，测定
Ｋ＋、Ｎａ＋、Ｈ＋流。以上４个处理分别简称为ＣＫ、
ＤＰＩ、ＮａＣｌ和ＮａＣｌ＋ＤＰＩ。
２　结果与分析
２．１　胡杨ＲＮＡ提取与ｃＤＮＡ一链的合成
由图１可见，提取的胡杨 ＲＮＡ 条带清晰，且
２８Ｓ条带的亮度约为１８Ｓ的２倍，基本无蛋白、盐离
子和 ＤＮＡ 等杂质污染，ＯＤ２６０／ＯＤ２８０约为２．０，
ＯＤ２６０／ＯＤ２３０约为２．０，说明ＲＮＡ质量和完整度好，
纯度高。ｃＤＮＡ一链经电泳检测发现，条带呈弥散
状，分子质量在１～２ｋｂ（图２），说明ｃＤＮＡ质量很
好，完全能满足下一步试验需要。
图１　胡杨的ＲＮＡ电泳结果
Ｆｉｇ．１　Ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｐｏｐｕｌｕｓ　ｅｕｐｈｒａｔｉｃａ　ＲＮＡ
２．２　胡杨ＰｅＳＯＳ１的克隆
ＰｅＳＯＳ１的ＰＣＲ扩增结果见图３。图３显示，
克隆条带单一清晰，无非特异性条带，大小为
３　０００～４　０００ｂｐ，符合预期长度。经测序鉴定发现，
拼接序列与 Ｗｕ等［１］克隆的ＰｅＳＯＳ１（ＧｅｎＢａｎｋ登
录号：ＤＱ５１７５３０．１）的大小及序列完全一致。
２８ 西北农林科技大学学报（自然科学版） 第４３卷
图２　胡杨ｃＤＮＡ一链的电泳结果
１．ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ　ＤＬ２０００；２．ｃＤＮＡ一链产物；
３．ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ　ＤＬ１００００
Ｆｉｇ．２　Ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｐｏｐｕｌｕｓ　ｅｕｐｈｒａｔｉｃａ　ｃＤＮＡ
１．ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ　ＤＬ２０００；２．ｃＤＮＡ；３．ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ　ＤＬ１００００
图３　胡杨ＰｅＳＯＳ１的ＰＣＲ扩增结果
１～３．ＰｅＳＯＳ１的扩增产物；４．ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ　ＤＬ１００００；５．阴性对照
Ｆｉｇ．３　ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｏｐｕｌｕｓ
ｅｕｐｈｒａｔｉｃａ　ＰｅＳＯＳ１ｇｅｎｅ
１－３．ＰＣＲ　ｐｒｏｄｕｃｔ　ｏｆ　ＰｅＳＯＳ１；４．ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ
ＤＬ１００００；５．Ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ
２．３　转ＰｅＳＯＳ１载体的构建
图４－Ａ显示，构建的中间载体ｐＥＮＴＲ／Ｄ－ＴＯ－
ＰＯ－ＰｅＳＯＳ１的大小为３　０００ｂｐ。对构建的中间载
体ｐＥＮＴＲ／Ｄ－ＴＯＰＯ－ＰｅＳＯＳ１进行ＰＣＲ鉴定，结果
（图４－Ｂ）显示，该载体构建成功。
　　由图５可知，表达载体ｐＫ７－ＰｅＳＯＳ１的ＰＣＲ产
物大小为３　０００ｂｐ左右，符合预期的 ＰＣＲ 产物
（ＰｅＳＯＳ１的全长）大小。
图４　构建的中间载体ｐＥＮＴＲ／Ｄ－ＴＯＰＯ－ＰｅＳＯＳ１（Ａ）及其ＰＣＲ鉴定结果（Ｂ）
Ａ：１．ｐＥＮＴＲ／Ｄ－ＴＯＰＯ；２．ｐＥＮＴＲ／Ｄ－ＴＯＰＯ－ＰｅＳＯＳ１；３．ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ　ＤＬ１００００；
Ｂ：１．ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ　ＤＬ２０００；２～４．ｐＥＮＴＲ／Ｄ－ＴＯＰＯ－ＰｅＳＯＳ１质粒；５．阴性对照
Ｆｉｇ．４　Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ（Ａ）ａｎｄ　ＰＣＲ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｂ）ｏｆ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ　ｖｅｃｔｏｒ　ｐＥＮＴＲ／Ｄ－ＴＯＰＯ－ＰｅＳＯＳ１
Ａ：１．ｐＥＮＴＲ／Ｄ－ＴＯＰＯ；２．ｐＥＮＴＲ／Ｄ－ＴＯＰＯ－ＰｅＳＯＳ１；３．ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ　ＤＬ１００００；
Ｂ：１．ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ　ＤＬ２０００；２－４．Ｐｌａｓｍｉｄ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｏｆ　ｐＥＮＴＲ／Ｄ－ＴＯＰＯ－ＰｅＳＯＳ１；５．Ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ
图５　表达载体ｐＫ７－ＰｅＳＯＳ１的ＰＣＲ鉴定结果
１～４．ｐＫ７－ＰｅＳＯＳ１质粒；５．ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ　ＤＬ１５０００
Ｆｉｇ．５　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐＫ７－ＰｅＳＯＳ１ｂｙ
ＰＣＲ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ
１－４．Ｐｌａｓｍｉｄ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｏｆ　ｐＫ７－ＰｅＳＯＳ１；
５．ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ　ＤＬ１５０００
２．４　拟南芥的转化
转化拟南芥后，顺利获得了７个阳性株系，标记
为Ｓ１～Ｓ７，从中选取ＰｅＳＯＳ１表达量高的３个株系
（Ｓ１、Ｓ２和Ｓ５）进行纯合子筛选及耐盐性试验。转
ＰｅＳＯＳ１拟南芥阳性植株的基因组ＤＮＡ见图６。
图６　转ＰｅＳＯＳ１拟南芥阳性植株的基因组ＤＮＡ
１．ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ　ＤＬ１５０００；２～６．不同转基因株系
Ｆｉｇ．６　Ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｏｆ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ＤＮＡ　ｏｆ
ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｌｉｎｅｓ
１．ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ　ＤＬ１５０００；２－６．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｌｉｎｅｓ
３８第２期 王美娟，等：胡杨ＰｅＳＯＳ１对拟南芥盐诱导 Ｈ２Ｏ２ 信号途径的调控
　　由图６可知，拟南芥Ｔ１ 代阳性株系的ＤＮＡ提
取结果完好，条带单一，既没有降解，也没有 ＲＮＡ
的污染，完全可以用作模板进行定性鉴定。图７显
示，从拟南芥 Ｔ１ 代阳性株系中全部成功鉴定出了
目的条带，且条带大小与用质粒ｐＫ７作模板的阳性
对照一致，野生型拟南芥和阴性对照中均没有此条
带，说明卡那霉素筛选结果可靠，转基因株系鉴定成
功。
图７　转ＰｅＳＯＳ１拟南芥阳性植株的ＰＣＲ鉴定结果
１．野生型；２～８．转基因株系Ｓ１～Ｓ７；９～１１．阳性对照；
１２．ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ　ＤＬ２０００；１３．阴性对照
Ｆｉｇ．７　ＰＣＲ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｌｉｎｅｓ
１．Ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ；２－８．Ｓ１－Ｓ７；９－１１．Ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ；
１２．ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ　ＤＬ２０００；１３．Ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ
２．５　不同株系拟南芥ＰｅＳＯＳ１表达量的实时荧光
定量ＰＣＲ分析
野生型和转ＰｅＳＯＳ１基因拟南芥的 ＲＮＡ 及
ＰＣＲ扩增结果见图８。
图８　野生型和转ＰｅＳＯＳ１基因拟南芥的
ＲＮＡ（Ａ）及ＰＣＲ扩增结果（Ｂ）
ＷＴ．野生型；Ｓ１～Ｓ７．转基因植株；ＶＣ．转空载体ｐＫ７植株
Ｆｉｇ．８　Ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｏｆ　ＲＮＡ（Ａ）ａｎｄ　ＰＣＲ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｏｆ
ＰｅＳＯＳ１（Ｂ）ｆｒｏｍ　ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ　ａｎｄ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｌｉｎｅｓ
ＷＴ．Ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ；Ｓ１－Ｓ７．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｌｉｎｅｓ；
ＶＣ．Ｖｅｃｔｏｒ　ｃｏｎｔｒｏｌ（ｐＫ７ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｌｉｎｅ）
　　由图８－Ａ可知，野生型和转ＰｅＳＯＳ１基因拟南
芥的ＲＮＡ提取较为成功，没有降解及基因组ＤＮＡ
的污染，条带２８Ｓ的亮度约为１８Ｓ的２倍，说明
ＲＮＡ质量较高，其 ＯＤ２８０／ＯＤ２６０、ＯＤ２８０／ＯＤ２３０值均
为１．８～２．０，说明样品ＲＮＡ的质量完全满足后续
试验要求。图８－Ｂ显示，转ＰｅＳＯＳ１基因拟南芥扩
增条带单一，亮度良好，没有非特异性条带及引物二
聚体的污染。目的模板扩增片段清晰可见，阴性对
照（ＶＣ）没有目的条带的痕迹，可以满足实时荧光定
量ＰＣＲ的要求。
通过检测不同株系拟南芥ＰｅＳＯＳ１的表达量
（图９）发现，在野生型拟南芥和转空载体ｐＫ７植株
中均未检测到ＰｅＳＯＳ１基因，而转基因拟南芥中均
检测到ＰｅＳＯＳ１。当用０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ处理后，转
基因拟南芥中 ＰｅＳＯＳ１表达量均不高，而用１００
ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ处理后转基因株系ＰｅＳＯＳ１表达量
显著提高。
图９　ＮａＣｌ胁迫下野生型和转基因拟南芥中
ＰｅＳＯＳ１的相对表达量
ＷＴ．野生型；ＶＣ．转空载体ｐＫ７植株；Ｓ１、Ｓ２和Ｓ５为
转基因株系；图柱上标不同小写字母者表示不同浓度
ＮａＣｌ处理间差异显著（Ｐ＜０．０５）。图１４和１８同
Ｆｉｇ．９　Ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｍＲＮＡ　ａｂｕｎｄａｎｃｅ　ｏｆ　ＰｅＳＯＳ１ｉｎ　ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ
ａｎｄ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｌｉｎｅｓ
ＷＴ．Ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ；ＶＣ．Ｖｅｃｔｏｒ－ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｃｏｎｔｒｏｌ；Ｓ１，Ｓ２，ａｎｄ
Ｓ５．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｌｉｎｅｓ；Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｌｏｗｅｒｃａｓｅ　ｌｅｔｔｅｒｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅ
ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ　ｂｅｔｗｅｅｎ　０ａｎｄ　１００ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ
ａｔ　Ｐ＜０．０５．Ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ｆｏｒ　ｆｉｇ．１４ａｎｄ　ｆｉｇ．１８
２．６　转基因拟南芥的耐盐性
ＮａＣｌ胁迫对野生型和转ＰｅＳＯＳ１基因拟南芥
萌发率的影响见图 １０。图 １０ 表明，在无盐 （０
ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ）培养基上，野生型（ＷＴ）和转Ｐｅ－
ＳＯＳ１基因拟南芥（Ｓ１、Ｓ２、Ｓ５）的萌发率较高，均在
９５％左右；当用１００ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ处理后，转Ｐｅ－
ＳＯＳ１基因拟南芥的萌发率基本没有明显变化，为
７０％～９０％，而野生型拟南芥萌发率却降到了３０％
左右；在用１５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ处理后，野生型拟南
４８ 西北农林科技大学学报（自然科学版） 第４３卷
芥的萌发率降到了约１０％，而转ＰｅＳＯＳ１基因拟南
芥株系中的萌发率显著高于野生型拟南芥。说明转
ＰｅＳＯＳ１基因后植株的耐盐性显著提高。
观察发现，处理７ｄ后，在无盐（０ ｍｍｏｌ／Ｌ
ＮａＣｌ）培养基上，野生型和转ＰｅＳＯＳ１基因拟南芥
株系的根长没有差异（图１１），同时植株在叶片和根
形态上也没有差异；利用１００ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ处理
后，转基因株系的根长生长优于野生型（图１１），且
转基因株系叶片较大、绿色较深，根比较粗壮，说明
盐胁迫并没有明显抑制转ＰｅＳＯＳ１基因株系根长的
生长，却抑制了野生型拟南芥根长的生长。
监测长期（６～１２ｄ）盐胁迫下野生型和转Ｐｅ－
ＳＯＳ１基因拟南芥的根长生长，结果见图１２。由图
１２可知，在无盐（０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ）培养基上，野生型
与转ＰｅＳＯＳ１基因株系拟南芥的根长在胁迫６～１０
ｄ时差异不显著，但在１２ｄ时差异显著。用１００
ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ处理后，其抑制了拟南芥的根长生
长，且对野生型拟南芥的抑制作用更为明显，转Ｐｅ－
ＳＯＳ１基因株系拟南芥的根长生长显著优于野生型，
说明转ＰｅＳＯＳ１基因拟南芥生长受盐胁迫的影响较
小。
图１０　ＮａＣｌ胁迫对野生型和转ＰｅＳＯＳ１基因
拟南芥萌发率的影响
图柱上标不同小写字母者表示不同株系拟南芥
差异显著（Ｐ＜０．０５），下图同（图１４和１８除外）
Ｆｉｇ．１０　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ＮａＣｌ　ｓｔｒｅｓｓ　ｏｎ　ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ　ａｎｄ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｌｉｎｅｓ　ｓｅｅｄ　ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｒａｔｅ
Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｌｏｗｅｒｃａｓｅ　ｌｅｔｔｅｒｓ　ｓｈｏｗ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ　ｂｅｔｗｅｅｎ
ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ　ａｎｄ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｌｉｎｅｓ　ａｔ　Ｐ＜０．０５．Ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ｂｅｌｏｗ
ｅｘｃｅｐｔ　ｆｏｒ　ｆｉｇ．１４ａｎｄ　ｆｉｇ．１８
图１１　ＮａＣｌ胁迫７ｄ时野生型和转ＰｅＳＯＳ１基因拟南芥根长的比较
Ａ．０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ；Ｂ．１００ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ
Ｆｉｇ．１１　Ｒｏｏｔ　ｌｅｎｇｔｈｓ　ｏｆ　ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ　ａｎｄ　ＰｅＳＯＳ１－ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｕｎｄｅｒ　ｓａｌｔ　ｓｔｒｅｓｓ　ｏｆ　７ｄａｙｓ
图１２　长期ＮａＣｌ胁迫对野生型和转ＰｅＳＯＳ１基因拟南芥根长的影响
Ｆｉｇ．１２　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｌｏｎｇ　ｔｅｒｍ　ｓａｌｔ　ｓｔｒｅｓｓ　ｏｎ　ｒｏｏｔ　ｌｅｎｇｔｈ　ｏｆ　ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ　ａｎｄ　ＰｅＳＯＳ１－ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
５８第２期 王美娟，等：胡杨ＰｅＳＯＳ１对拟南芥盐诱导 Ｈ２Ｏ２ 信号途径的调控
２．７　盐胁迫下转基因拟南芥生理指标的变化
２．７．１　盐胁迫对干质量及 Ｋ＋、Ｎａ＋、Ｃａ２＋含量的
影响　图１３显示，当ＮａＣｌ浓度为０ｍｍｏｌ／Ｌ时，转
ＰｅＳＯＳ１基因拟南芥与野生型拟南芥的干质量差异
不显著。用５０～１００ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ处理后，野生型
拟南芥的干质量显著下降，且随着 ＮａＣｌ浓度的增
加，下降幅度更明显；转ＰｅＳＯＳ１基因拟南芥干质量
亦有所下降，但下降幅度低于野生型拟南芥，说明转
ＰｅＳＯＳ１基因拟南芥的生物量受盐胁迫的影响明显
小于野生型拟南芥。
图１３　ＮａＣｌ胁迫对野生型和转ＰｅＳＯＳ１基因
拟南芥植株干质量的影响
Ｆｉｇ．１３　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ＮａＣｌ　ｓｔｒｅｓｓ　ｏｎ　ｄｒｙ　ｗｅｉｇｈｔｓ　ｏｆ　ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ
ａｎｄ　ＰｅＳＯＳ１－ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
　　图１４显示，ＮａＣｌ处理前野生型与转ＰｅＳＯＳ１
基因拟南芥的 Ｋ＋含量没有显著差异，１００ｍｍｏｌ／Ｌ
ＮａＣｌ处理后野生型植株的Ｋ＋含量下降了约５０％，
而转ＰｅＳＯＳ１基因株系 Ｋ＋含量虽然也有所下降，
但下降幅度较小，为ＮａＣｌ处理前的８０％～９０％，说
明转ＰｅＳＯＳ１基因拟南芥在盐胁迫下能更好地抑制
Ｋ＋的流失。１００ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ处理后，野生型拟南
芥比转基因株系积累了更多的Ｎａ＋，约为处理前的
２倍；转ＰｅＳＯＳ１基因株系Ｎａ＋含量也有所增加，但
其增加幅度较小，约为 ＮａＣｌ处理前的１０％。ＮａＣｌ
处理前后转ＰｅＳＯＳ１基因拟南芥Ｃａ２＋含量变化趋
势与Ｋ＋相似，即ＮａＣｌ处理前，野生型与转ＰｅＳＯＳ１
基因拟南芥 Ｃａ２＋ 含量无显著差异；１００ｍｍｏｌ／Ｌ
ＮａＣｌ处理后，野生型拟南芥Ｃａ２＋含量显著下降，而
转ＰｅＳＯＳ１基因拟南芥Ｃａ２＋含量基本上维持了原
有的水平，与ＮａＣｌ处理前差异不显著。说明转Ｐｅ－
ＳＯＳ１基因拟南芥在盐胁迫下营养元素的流失减少。
１００ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ处理后，野生型拟南芥的 Ｋ＋／
Ｎａ＋明显下降，其Ｋ＋／Ｎａ＋失去平衡，对植株的生长
造成较大影响，而转ＰｅＳＯＳ１基因拟南芥能有效减
少Ｋ＋和Ｃａ２＋的流失，因此受盐胁迫的伤害较轻。
可知１００ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ处理后转ＰｅＳＯＳ１基因拟南
芥对Ｋ＋／Ｎａ＋平衡的维持能力比野生型拟南芥强。
图１４　ＮａＣｌ胁迫对野生型和转ＰｅＳＯＳ１基因拟南芥Ｋ＋、Ｎａ＋、Ｃａ２＋含量和Ｋ＋／Ｎａ＋的影响
Ｆｉｇ．１４　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ＮａＣｌ　ｓｔｒｅｓｓ　ｏｎ　Ｎａ＋，Ｋ＋，ａｎｄ　Ｃａ２＋ｃｏｎｔｅｎｔｓ　ｉｎ　ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ　ａｎｄ　ＰｅＳＯＳ１－ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
６８ 西北农林科技大学学报（自然科学版） 第４３卷
２．７．２　盐胁迫对根尖离子流的影响　图１５显示，
在非盐胁迫下（用０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ处理１ｄ，ＣＫ，下
同），野生型和转ＰｅＳＯＳ１基因拟南芥Ｋ＋流没有显
著差异；１００ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ处理后野生型和转Ｐｅ－
ＳＯＳ１基因株系Ｋ＋内流均有所减少，短期（１ｄ）盐处
理后转ＰｅＳＯＳ１基因拟南芥的Ｋ＋内流显著大于野
生型；在长期（７ｄ）盐胁迫下，野生型拟南芥还出现
了Ｋ＋外流的情况，而转ＰｅＳＯＳ１基因拟南芥没有
出现Ｋ＋外流的情况，说明转ＰｅＳＯＳ１基因拟南芥
在盐胁迫下仍能保持对 Ｋ＋的吸收，而野生型拟南
芥在长期盐胁迫下则出现了Ｋ＋外流。
图１５　ＮａＣｌ胁迫对野生型和转ＰｅＳＯＳ１基因拟南芥根尖离子流的影响
Ｆｉｇ．１５　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ＮａＣｌ　ｓｔｒｅｓｓ　ｏｎ　ｓｔｅａｄｙ－ｓｔａｔｅ　Ｋ＋，Ｎａ＋，ａｎｄ　Ｈ＋ｆｌｕｘｅｓ　ｉｎ　ｒｏｏｔ　ｔｉｐｓ　ｏｆ　ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ　ａｎｄ　ＰｅＳＯＳ１－
ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
　　由图１５还可见，在非盐胁迫下，转ＰｅＳＯＳ１基
因拟南芥 Ｎａ＋ 外流高于野生型，但差异不显著。
１００ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ处理１ｄ后，不同株系拟南芥
Ｎａ＋外流均增加，但是转ＰｅＳＯＳ１基因拟南芥 Ｎａ＋
的外流显著高于野生型；处理７ｄ后，不同株系拟南
芥Ｎａ＋外流进一步增加，但转ＰｅＳＯＳ１基因拟南芥
的Ｎａ＋外流仍显著高于野生型拟南芥。
由图１５可以看出，在非盐胁迫下，转ＰｅＳＯＳ１
基因拟南芥 Ｈ＋外流与野生型差异不显著，但用１００
ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ处理后，无论是短期（１ｄ）还是长期（７
ｄ）盐胁迫，均能导致拟南芥出现 Ｈ＋内流，且野生型
拟南芥的 Ｈ＋ 内流显著小于转基因株系，说明转
ＰｅＳＯＳ１基因拟南芥能及时对盐处理作出响应，激
活ＳＯＳ１蛋白，外排Ｎａ＋的同时将 Ｈ＋转运到胞内，
使得 Ｈ＋呈内流的趋势。
２．７．３　抑制剂Ａｍｉｌｏｒｉｄｅ对ＮａＣｌ胁迫下根尖离子
流的影响　图１６显示，抑制剂 Ａｍｉｌｏｒｉｄｅ处理与
否，对照组（ＣＫ）中不同株系拟南芥的 Ｋ＋内流差异
不显著；但在１００ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ胁迫组中，添加
Ａｍｉｌｏｒｉｄｅ后，其明显抑制了转ＰｅＳＯＳ１基因株系的
Ｋ＋内流，转ＰｅＳＯＳ１基因株系Ｋ＋内流与野生型拟
南芥没有显著差异。这说明盐胁迫下转ＰｅＳＯＳ１基
因拟南芥与野生型拟南芥的Ｋ＋流与ＳＯＳ１活性的
关系密切。
图１６表明，添加Ａｍｉｌｏｒｉｄｅ与否，对照组（ＣＫ）
中转ＰｅＳＯＳ１基因拟南芥的 Ｎａ＋外流与野生型拟
南芥无显著差异。用 ＮａＣｌ处理后，转ＰｅＳＯＳ１基
因拟南芥的Ｎａ＋外流高于野生型拟南芥，且差异显
著；用ＮａＣｌ＋Ａｍｉｌｏｒｉｄｅ处理后，转ＰｅＳＯＳ１基因拟
南芥和野生型拟南芥Ｎａ＋外流均大幅减小，且转基
因拟南芥与野生型没有显著差异。说明抑制剂
Ａｍｉｌｏｒｉｄｅ处理后消除了ＰｅＳＯＳ１对 Ｎａ＋外流的促
７８第２期 王美娟，等：胡杨ＰｅＳＯＳ１对拟南芥盐诱导 Ｈ２Ｏ２ 信号途径的调控
进作用。
图１６　抑制剂阿米洛利（Ａｍｉｌｏｒｉｄｅ）对ＮａＣｌ胁迫前后野生型和转ＰｅＳＯＳ１基因拟南芥根尖离子流的影响
Ｆｉｇ．１６　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　Ａｍｉｌｏｒｉｄｅ　ｏｎ　ＮａＣｌ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ｆｌｕｘｅｓ　ｏｆ　Ｋ＋，Ｎａ＋，ａｎｄ　Ｈ＋ｉｎ
ｒｏｏｔ　ｔｉｐｓ　ｏｆ　ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ　ａｎｄ　ＰｅＳＯＳ１－ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
　　由图１６还可知，添加 Ａｍｉｌｏｒｉｄｅ与否，对照组
中不同株系拟南芥 Ｈ＋外流差异不显著。ＮａＣｌ处
理后，使 Ｈ＋流向发生变化，由外流转变为内流，这
与Ｎａ＋的外流相对应，表明为 Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运。
ＮａＣｌ＋Ａｍｉｌｏｒｉｄｅ处理后，不同株系的 Ｈ＋内流均大
幅度降低，且野生型和转ＰｅＳＯＳ１基因株系间的差
异消失，说明ＳＯＳ１被抑制后，Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运受
到明显影响。
２．８　盐胁迫下转基因拟南芥根中 Ｈ２Ｏ２ 的产生和
抗氧化酶活性的变化
图１７显示，拟南芥根细胞产生的 Ｈ２Ｏ２ 随着
ＮａＣｌ胁迫时间的延长而增加，但变化趋势有所不
同。野生型拟南芥的 Ｈ２Ｏ２ 随着盐胁迫时间的延长
而逐渐增加，至第７天 Ｈ２Ｏ２ 水平达到最高；而转
ＰｅＳＯＳ１基因拟南芥根细胞中 Ｈ２Ｏ２ 水平在２４ｈ内
呈增加的趋势，之后到第７天并未继续增加，与
ＮａＣｌ处理２４ｈ的水平基本一致。说明转ＰｅＳＯＳ１
基因拟南芥能及时抑制 Ｈ２Ｏ２ 的过量产生，避免过
多的活性氧带来的氧化胁迫，而野生型拟南芥并不
能抑制盐诱导的 Ｈ２Ｏ２ 过量产生。
图１７　盐胁迫下野生型和转ＰｅＳＯＳ１基因
拟南芥根中 Ｈ２Ｏ２ 的动态变化
Ｆｉｇ．１７　Ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｈ２Ｏ２ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｒｏｏｔｓ　ｏｆ　ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ
ａｎｄ　ＰｅＳＯＳ１－ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｌｉｎｅｓ
ｕｎｄｅｒ　ＮａＣｌ　ｓｔｒｅｓｓ
　　图１８表明，在转ＰｅＳＯＳ１基因拟南芥和野生型
拟南芥中，抗氧化物酶ＳＯＤ和ＧＲ活性在 ＮａＣｌ胁
迫前后的变化趋势基本相同，即ＮａＣｌ处理前转Ｐｅ－
ＳＯＳ１基因拟南芥与野生型拟南芥ＳＯＤ和ＧＲ活性
无显著差异，ＮａＣｌ胁迫后ＳＯＤ和ＧＲ活性均增加，
但是转ＰｅＳＯＳ１基因拟南芥ＳＯＤ和ＧＲ活性增加
８８ 西北农林科技大学学报（自然科学版） 第４３卷
的幅度显著大于野生型拟南芥。野生型拟南芥的
ＣＡＴ和ＡＰＸ活性受ＮａＣｌ胁迫的影响小，而转Ｐｅ－
ＳＯＳ１基因拟南芥在 ＮａＣｌ胁迫后ＣＡＴ和 ＡＰＸ活
性均显著提高，且ＡＰＸ活性平均提高幅度（１００％）
高于ＣＡＴ（３０％）。
图１８　盐胁迫对野生型和转ＰｅＳＯＳ１基因拟南芥抗氧化物酶活性的影响
Ｆｉｇ．１８　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ＮａＣｌ　ｏｎ　ｔｏｔａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｏｆ　ＳＯＤ，ＧＲ，ＣＡＴ　ａｎｄ　ＡＰＸ　ｉｎ　ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ　ａｎｄ　ＰｅＳＯＳ１－ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
２．９　Ｈ２Ｏ２ 对盐诱导转基因拟南芥根尖离子流的
调控
图１９显示，与ＣＫ相比，ＮａＣｌ处理后拟南芥根
尖的Ｋ＋内流减弱，Ｎａ＋外流和 Ｈ＋内流增强，表明
Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运能力提高。与野生型拟南芥相
比，转ＰｅＳＯＳ１基因拟南芥 Ｋ＋内流减弱的幅度较
小，Ｎａ＋外流和 Ｈ＋内流的增强幅度均较大，Ｎａ＋／
Ｈ＋逆向转运能力较高，且野生型与转ＰｅＳＯＳ１基因
型拟南芥差异显著。与ＣＫ相比，加入 ＮＡＤＰＨ氧
化酶抑制剂ＤＰＩ后，不同株系拟南芥根尖的离子流
未受影响，但却进一步降低了 ＮａＣｌ处理拟南芥根
尖的Ｋ＋和 Ｈ＋的内流。与ＣＫ相比，ＮａＣｌ和 ＤＰＩ
共同处理后野生型和转ＰｅＳＯＳ１基因拟南芥 Ｎａ＋
外流均有所增加，但是野生型拟南芥增幅较少，说明
ＤＰＩ对ＮａＣｌ处理后野生型拟南芥的影响比转Ｐｅ－
ＳＯＳ１基因拟南芥大，可能是由于野生型拟南芥在
ＮａＣｌ处理后产生了较多 Ｈ２Ｏ２ 所致；说明添加ＤＰＩ
抑制了 Ｈ２Ｏ２ 的产生后，影响了离子的平衡，降低了
转ＰｅＳＯＳ１基因拟南芥 Ｎａ＋外流与野生型拟南芥
的差异，即减小了转ＰｅＳＯＳ１基因造成的差异。与
ＮａＣｌ处理相比，ＮａＣｌ和 ＤＰＩ共同处理后，转Ｐｅ－
ＳＯＳ１基因拟南芥和野生型拟南芥 Ｈ＋内流均减小，
而野生型拟南芥减少幅度较转ＰｅＳＯＳ１基因拟南芥
小。可知ＮａＣｌ与ＤＰＩ共同处理后，转ＰｅＳＯＳ１基
因拟南芥与野生型拟南芥根尖离子流之间的差异比
ＮａＣｌ单独处理造成的差异有所降低。以上结果表
明，Ｈ２Ｏ２ 调节了ＳＯＳ１的活性，参与盐诱导离子流
的调控。
３　讨　论
ＳＯＳ１在提高植物抗盐性中有着非常重要的作
用。质膜ＳＯＳ１外排Ｎａ＋的作用降低了植物因盐处
理导致的体内Ｎａ＋积累，因此减少了Ｎａ＋积累带来
的离子渗透和氧化胁迫作用［１１－１２］，进而保证了Ｋ＋、
Ｃａ２＋等重要离子所占的比例，维持了 Ｋ＋／Ｎａ＋ 平
衡［１２－１４］，这为植物细胞内的正常代谢等生命活动提
供了必要条件。ＳＯＳ１在作为离子转运体的同时还
兼顾了信号信使的重要使命［１５－１８］。盐胁迫产生的
Ｈ２Ｏ２ 也起着信号信使的作用［２，１９］。ＮａＣｌ处理植物
后，ＳＯＳ１和 Ｈ２Ｏ２ 信号系统共同作用，调控着植物
９８第２期 王美娟，等：胡杨ＰｅＳＯＳ１对拟南芥盐诱导 Ｈ２Ｏ２ 信号途径的调控
体对ＮａＣｌ胁迫的适应性［８，２０］。对胡杨根组织分离
原生质体的研究发现，耐盐性的胡杨在盐处理后维
持了Ｋ＋／Ｎａ＋平衡，且在此过程中，ＳＯＳ１保持着对
Ｎａ＋的外排活性［２０］。与对盐敏感的杨树相比，胡杨
的叶片组织在盐处理或正常生长状态下均可保持较
高的ＳＯＳ１转录水平［２］。本研究克隆并表达了Ｐｅ－
ＳＯＳ１，发现ＰｅＳＯＳ１可显著增强转基因拟南芥植株
的耐盐性和Ｋ＋／Ｎａ＋平衡。
图１９　ＤＰＩ对野生型和转ＰｅＳＯＳ１基因拟南芥根尖离子流的影响
Ｆｉｇ．１９　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ＤＰＩ　ｏｎ　ＮａＣｌ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ｆｌｕｘｅｓ　ｏｆ　Ｋ＋，Ｎａ＋，ａｎｄ　Ｈ＋ｉｎ　ｒｏｏｔ　ｔｉｐｓ　ｏｆ　ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ　ａｎｄ
ＰｅＳＯＳ１－ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
　　前人在多种植物中均发现，盐和 Ｈ２Ｏ２ 均对
ＳＯＳ１ｍＲＮＡ的稳定性起着重要作用［３，２１］。本研究
发现，短期（１０ｍｉｎ～２４ｈ）ＮａＣｌ胁迫下转ＰｅＳＯＳ１
基因的拟南芥根细胞中 Ｈ２Ｏ２ 水平显著高于野生型
拟南芥，而且 Ｈ２Ｏ２ 在多种类型细胞中均对刺激生
长起到重要作用［６，２１－２４］，这可能是转ＰｅＳＯＳ１基因
拟南芥在盐胁迫下根系快速生长的原因。
Ａｍｉｌｏｒｉｄｅ和ＤＰＩ分别是ＳＯＳ１和质膜 ＮＡＤ－
ＰＨ氧化酶的抑制剂，在转基因植株中 Ｎａ＋外流和
Ｋ＋内流受 Ａｍｉｌｏｒｉｄｅ和ＤＰＩ的影响。说明拟南芥
可能通过Ｈ２Ｏ２ 来调控ＳＯＳ１，以达到维持胞内Ｋ＋／
Ｎａ＋平衡的作用［２５］。很多研究已经证明，Ｈ２Ｏ２ 对
ＳＯＳ１的活性有调节作用［３，２５］。Ｓｕｎ等［２６］研究表明，
在胡杨细胞中，ＮａＣｌ诱导产生的 Ｈ＋内流有助于产
生过量的 Ｈ２Ｏ２［２６］。因此可以推测，由于 Ｈ＋内流
的加强，导致质外体瞬时碱化，可激活质膜ＮＡＤＰＨ
氧化酶并导致转基因拟南芥根细胞中 Ｈ２Ｏ２ 的积
累［２７］。这可能是因为ＮａＣｌ处理后ＰｅＳＯＳ１表达上
调，使植物在外排Ｎａ＋的同时将大量 Ｈ＋转入胞内，
这有助于激活质膜 ＮＡＤＰＨ 氧化酶，从而调节
Ｈ２Ｏ２ 的产生。
　　在本研究中，转ＰｅＳＯＳ１基因拟南芥在 ＮａＣｌ
处理下快速产生 Ｈ２Ｏ２，且胁迫早期（１０ｍｉｎ～２４ｈ）
Ｈ２Ｏ２ 的爆发可引起抗氧化防御［２０，２８］。本研究发
现，转ＰｅＳＯＳ１基因拟南芥在有或无 ＮａＣｌ处理的
条件下均可保持较高的抗氧化酶活性，这使得
Ｈ２Ｏ２ 水平得到了控制。研究表明，盐胁迫下胡杨
能调控活性氧平衡主要通过２条途径：一是控制胞
内离子平衡来减少长期盐胁迫下诱导的活性氧产
生，二是迅速上调氧化防御机制来阻止活性氧的损
伤［２０，２９］。胡杨在盐胁迫前后其ＰｅＳＯＳ１均有较高
的表达量［２］。本试验结果表明，ＮａＣｌ胁迫后，转
０９ 西北农林科技大学学报（自然科学版） 第４３卷
ＰｅＳＯＳ１基因拟南芥中 Ｈ２Ｏ２ 迅速产生，从而有助
于通过调控 Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运系统的活性以维持
Ｋ＋／Ｎａ＋平衡；此外，Ｈ２Ｏ２ 还能上调氧化防御机制
从而防止长期 ＮａＣｌ胁迫下的氧化损伤发生。另
外，盐诱导 Ｈ２Ｏ２ 提高胞内Ｃａ２＋浓度，胞内Ｃａ２＋信
号通过ＳＯＳ信号通路激活ＳＯＳ１［３０］。在拟南芥中，
Ｈ２Ｏ２ 对维持ＳＯＳ１ｍＲＮＡ 的稳定性还有重要作
用［３］。因此可以推断，在拟南芥和胡杨中ＳＯＳ１的
高量表达促进了盐胁迫下 Ｈ２Ｏ２ 的产生，Ｈ２Ｏ２ 信号
网络进一步调控胞内的离子平衡。
综上所述，在拟南芥中异源表达ＰｅＳＯＳ１后，转
基因植株的耐盐性提高，其机制为通过上调 Ｎａ＋／
Ｈ＋逆向转运蛋白活性及外排Ｎａ＋维持了Ｋ＋／Ｎａ＋
平衡；同时转ＰｅＳＯＳ１基因拟南芥通过促进 Ｈ２Ｏ２
的产生，又进一步维持了ＳＯＳ１ｍＲＮＡ的稳定性，
使之在长期盐胁迫中保持活性，从而对植物的生长
起着重要的作用。
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ｔｈｅ　ｅｘｔｒｅｍｅ　ｈａｌｏｐｈｙｔｅ　Ｓａｌｉｃｏｒｎｉａ　ｂｒａｃｈｉａｔａ　ｅｎｈａｎｃｅｓ　Ｎａ＋
ｌｏａｄｉｎｇ　ｉｎ　ｘｙｌｅｍ　ａｎｄ　ｃｏｎｆｅｒｓ　ｓａｌｔ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｉｎ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｔｏ－
ｂａｃｃｏ［Ｊ］．ＢＭＣ　Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｌ，２０１２，１２（１）：１８８．
［１２］　Ｇａｒｃｉａｄｅｂｌａｓ　Ｂ，Ｈａｒｏ　Ｒ，Ｂｅｎｉｔｏ　Ｂ．Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　ｔｗｏ　ＳＯＳ１ｔｒａｎｓ－
ｐｏｒｔｅｒｓ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｓｅａｇｒａｓｓ　Ｃｙｍｏｄｏｃｅａ　ｎｏｄｏｓａ．ＳＯＳ１ｔｒａｎｓｐｏｒｔ－
ｅｒｓ　ｆｒｏｍＣｙｍｏｄｏｃｅａ　ａｎｄ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｍｅｄｉａｔｅ　ｐｏｔａｓｓｉｕｍ　ｕｐ－
ｔａｋｅ　ｉｎ　ｂａｃｔｅｒｉａ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ，２００７，６３（４）：４７９－４９０．
［１３］　Ｒｕｓ　Ａ，Ｌｅｅ　Ｂ　Ｈ，Ｍｕｎｏｚ－Ｍａｙｏｒ　Ａ，ｅｔ　ａｌ．ＡｔＨＫＴ１ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ
Ｎａ＋ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ　ａｎｄ　Ｋ＋ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ　ｉｎ　ｐｌａｎｔａ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉ－
ｏｌ，２００４，１３６（１）：２５００－２５１１．
［１４］　Ｐａｒｄｏ　Ｊ　Ｍ，Ｃｕｂｅｒｏ　Ｂ，Ｌｅｉｄｉ　Ｅ　Ｏ，ｅｔ　ａｌ．Ａｌｋａｌｉ　ｃａｔｉｏｎ　ｅｘｃｈａｎｇ－
ｅｒｓ：Ｒｏｌｅｓ　ｉｎ　ｃｅｌｕｌａｒ　ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ　ａｎｄ　ｓｔｒｅｓｓ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ［Ｊ］．Ｊ
Ｅｘｐ　Ｂｏｔ，２００６，５７（５）：１１８１－１１９９．
［１５］　Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ａｔｉｅｎｚａ　Ｊ，Ｊｉａｎｇ　Ｘ，Ｇａｒｃｉａｄｅｂｌａｓ　Ｂ，ｅｔ　ａｌ．Ｃｏｎｓｅｒｖａ－
ｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓａｌｔ　ｏｖｅｒｌｙ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｐａｔｈｗａｙ　ｉｎ　ｒｉｃｅ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ
Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００７，１４３（２）：１００１－１０１２．
［１６］　Ｈｕａｎｇ　Ｇ　Ｔ，Ｍａ　Ｓ　Ｌ，Ｂａｉ　Ｌ　Ｐ，ｅｔ　ａｌ．Ｓｉｇｎａｌ　ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ　ｄｕｒｉｎｇ
ｃｏｌｄ，ｓａｌｔ，ａｎｄ　ｄｒｏｕｇｈｔ　ｓｔｒｅｓｓｅｓ　ｉｎ　ｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　Ｒｅｐ，
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［１７］　Ｑｕｉｎｔｅｒｏ　Ｆ　Ｊ，Ｏｈｔａ　Ｍ，Ｓｈｉ　Ｈ，ｅｔ　ａｌ．Ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ　ｉｎ　ｙｅａｓｔ　ｏｆ
ｔｈｅ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ＳＯＳ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｐａｔｈｗａｙ　ｆｏｒ　Ｎａ＋ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ
［Ｊ］．Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ　Ｓ　Ａ，２００２，９９（１３）：９０６１－９０６６．
［１８］　Ｔａｎｇ　Ｒ　Ｊ，Ｌｉｕ　Ｈ，Ｂａｏ　Ｙ，ｅｔ　ａｌ．Ｔｈｅ　ｗｏｏｄｙ　ｐｌａｎｔ　ｐｏｐｌａｒ　ｈａｓ　ａ
ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｙ　ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ　ｓａｌｔ　ｏｖｅｒｌｙ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｐａｔｈｗａｙ　ｉｎ　ｒｅ－
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３６７－３８０．
［１９］　Ｚｈａｎｇ　Ｆ，Ｗａｎｇ　Ｙ，Ｙａｎｇ　Ｙ，ｅｔ　ａｌ．Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ｈｙｄｒｏｇｅｎ
ｐｅｒｏｘｉｄｅ　ａｎｄ　ｎｉｔｒｉｃ　ｏｘｉｄｅ　ｉｎ　ｓａｌｔ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｃａｌｕｓｅｓ　ｆｒｏｍ
Ｐｏｐｕｌｕｓ　ｅｕｐｈｒａｔｉｃａ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌ　Ｅｎｖｉｒｏｎ，２００７，３０（７）：７７５－
７８５．
［２０］　Ｓｕｎ　Ｊ，Ｗａｎｇ　Ｍ　Ｊ，Ｄｉｎｇ　Ｍ　Ｑ，ｅｔ　ａｌ．Ｈ２Ｏ２ａｎｄ　ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ　Ｃａ２＋
ｓｉｇｎａｌｓ　ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ＰＭ　Ｈ－ｃｏｕｐｌｅｄ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔ　ｓｙｓｔｅｍ　ｍｅ－
ｄｉａｔｅ　Ｋ＋／Ｎａ＋ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ　ｉｎ　ＮａＣｌ－ｓｔｒｅｓｓｅｄ　Ｐｏｐｕｌｕｓ　ｅｕｐｈ－
ｒａｔｉｃａ　ｃｅｌｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌ　Ｅｎｖｉｒｏｎ，２０１０，３３（６）：９４３－９５８．
［２１］　Ｊｈｕｍｋａ　Ｚ，Ｐｅｒｖａｉｚ　Ｓ，Ｃｌｅｍｅｎｔ　Ｍ　Ｖ．Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ　ｒｅｇｕｌａｔｅｓ　ｔｈｅ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＮＨＥ－１ｂｙ　ｒｅｐｒｅｓｓｉｎｇ　ｉｔｓ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ａｃｔｉｖｉｔｙ：Ｃｒｉｔ－
ｉｃａｌ　ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ｉｎｔｒａｃｅｌｕｌａｒ　Ｈ２Ｏ２ａｎｄ　ｃａｓｐａｓｅｓ　３ａｎｄ　６ｉｎ
ｔｈｅ　ａｂｓｅｎｃｅ　ｏｆ　ｃｅｌ　ｄｅａｔｈ［Ｊ］．Ｉｎｔ　Ｊ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｃｅｌ　Ｂｉｏｌ，２００９，４１
（４）：９４５－９５６．
［２２］　Ｂａｓｓｉｌ　Ｅ，Ｔａｊｉｍａ　Ｈ，Ｌｉａｎｇ　Ｙ　Ｃ，ｅｔ　ａｌ．Ｔｈｅ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　Ｎａ＋／
Ｈ＋ａｎｔｉｐｏｒｔｅｒｓ　ＮＨＸ１ａｎｄ　ＮＨＸ２ｃｏｎｔｒｏｌ　ｖａｃｕｏｌａｒ　ｐＨ　ａｎｄ
Ｋ＋ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ　ｔｏ　ｒｅｇｕｌａｔｅ　ｇｒｏｗｔｈ，ｆｌｏｗｅｒ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ａｎｄ
ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌ，２０１１，２３（９）：３４８２－３４９７．
［２３］　Ｐｏｔｏｃｋｙ　Ｍ，Ｊｏｎｅｓ　Ｍ　Ａ，Ｂｅｚｖｏｄａ　Ｒ，ｅｔ　ａｌ．Ｒｅａｃｔｉｖｅ　ｏｘｙｇｅｎ　ｓｐｅ－
ｃｉｅｓ　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ＮＡＤＰＨ　ｏｘｉｄａｓｅ　ａｒｅ　ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ｐｏｌｅｎ　ｔｕｂｅ
ｇｒｏｗｔｈ［Ｊ］．Ｎｅｗ　Ｐｈｙｔｏｌ，２００７，１７４（４）：７４２－７５１．
（下转第９８页）
１９第２期 王美娟，等：胡杨ＰｅＳＯＳ１对拟南芥盐诱导 Ｈ２Ｏ２ 信号途径的调控
Ｘｕ　Ｐ　Ｘ．Ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｎ　ｓｏｆｔ　ｃｕｔｔｉｎｇ　ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ａｎｄ
ｒｏｏｔｉｎｇ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　Ｔａｘｏｄｉｕｍ　ｍｕｃｒｏｎａｔｕｍ×Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ
ｆｏｒｔｕｎｅｉ［Ｄ］．Ｎａｎｊｉｎｇ：Ｎａｎｊｉｎｇ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２００９．（ｉｎ
Ｃｈｉｎｅｓｅ）
［１８］　张晓平，方炎明．杂种鹅掌楸插穗不定根发生与发育的解剖学
观察 ［Ｊ］．植物资源与环境学报，２００３，１２（１）：１０－１５．
Ｚｈａｎｇ　Ｘ　Ｐ，Ｆａｎｇ　Ｙ　Ｍ．Ａｎａｔｏｍｉｃａｌ　ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｏｒｉｇｉｎ
ａｎｄ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ　ｒｏｏｔｓ　ｉｎ　ｈｙｂｒｉｄ　ｔｕｌｉｐｔｒｅｅｓ
ｄｕｒｉｎｇ　ｃｕｔｔｉｎｇ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎ－
ｍｅｎｔ，２００３，１２（１）：１０－１５．（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ）
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ｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｔｏ　ｓａｌｉｎｉｔｙ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｒｅｌｅｖａｎｃｅ　ｔｏ　ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ
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８９ 西北农林科技大学学报（自然科学版） 第４３卷