全 文 ：２０１３年５月 四川大学学报（自然科学版） Ｍａｙ．２０１３
第５０卷　第３期 Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｉｃｈｕａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｅｄｉｔｉｏｎ） Ｖｏｌ．５０　Ｎｏ．３
收稿日期：２０１２－０３－２２
基金项目：国家自然科学基金（３０９７１８１６，３１１７１５８６）；中央高校基本科研业务费资助（２０１１ＳＣＵ１１１０７）
作者简介：陈凤莲（１９８５－），女，山东枣庄人，硕士研究生，主要研究方向为基因的分子生物学．
通讯作者：杨毅．Ｅ－ｍａｉｌ：ｙａｎｇｙｉ５２８＠ｖｉｐ．ｓｉｎａ．ｃｏｍ
ｄｏｉ：１０３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．０４９０－６７５６．２０１３．０３．０４１
油菜ＢｎＲＣＨ 基因提高转基因
拟南芥的耐盐性研究
陈凤莲，刘志斌，王健美，李旭锋，杨　毅
（四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室，成都６１００６４）
摘　要：为探索本实验室从甘蓝型油菜中克隆到的ＢｎＲＣＨ 基因在植物耐盐中的作用，比较
了ＮａＣｌ胁迫下转基因与野生型拟南芥在萌发及幼苗生长的差异．结果表明：在１００ｍＭ
ＮａＣｌ处理下，ＢｎＲＣＨ 转基因拟南芥种子萌发率比野生型高３～５倍；盐胁迫后野生型拟南
芥幼苗首先表现出枯萎、白化现象；除去盐胁迫后，转基因拟南芥幼苗恢复生长状况明显优
于野生型．本实验结果表明ＢｎＲＣＨ 基因能够提高转基因拟南芥的耐盐性．
关键词：盐胁迫；ＢｎＲＣＨ；拟南芥；萌发率；幼苗生长
中图分类号：Ｑ７８　　　文献标识码：Ａ　　　文章编号：０４９０－６７５６（２０１３）０３－０６４３－０６
Ｔｈｅ　ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｆ　ｇｅｎｅ　ＢｎＲＣＨｆｒｏｍＢｒａｓｓｉｃａ　ｎａｐｕｓ　ｅｎｈａｎｃｅｓ　ｔｈｅ
ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｔｏ　ｓａｌｔ　ｓｔｒｅｓｓ　ｉｎ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
ＣＨＥＮ　Ｆｅｎｇ－Ｌｉａｎ，ＬＩＵ　Ｚｈｉ－Ｂｉｎ，ＷＡＮＧ　Ｊｉａｎ－Ｍｅｉ，ＬＩ　Ｘｕ－Ｆｅｎｇ，ＹＡＮＧ　Ｙｉ
（Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｂｉｏ－Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ　ａｎｄ　Ｅｃｏ－ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ；
Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｉｃｈｕａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｅｎｇｄｕ　６１００６４，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ　ｏｒｄｅｒ　ｔｏ　ｅｘｐｌｏｒｅ　ｔｈｅ　ｒｏｌｅ　ｏｆ　ＢｎＲＣＨ，ｔｈｅ　ｕｎｋｎｏｗｎ　ｇｅｎｅ　ＢｎＲＣＨ ｗａｓ　ｃｌｏｎｅｄ　ｆｒｏｍＢｒａｓｓｉｃａ
ｎａｐｕｓ　ｉｎ　ｏｕｒ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ．Ａｇａｉｎｓｔ　ｓａｌｔ　ｓｔｒｅｓｓ，ｔｈｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ　ａｎｄ　ＢｎＲＣＨｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｗｅｒｅ　ｓｔｕｄｉｅｄ　ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ＮａＣｌ　ｓｔｒｅｓｓ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ，ｔｈｅ　ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｔｒａｎｓ－
ｇｅｎｉｃ　ｐｌａｎｔｓ　ｗａｓ　ｔｈｒｅｅ　ｔｏ　ｆｉｖｅ　ｔｏｌｄｓ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ　ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ　ｕｎｄｅｒ　１００ｍＭ　ＮａＣｌ．Ａｆｔｅｒ　ｓａｌｔ　ｓｔｒｅｓｓ，ｔｈｅ
ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ　ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ　ｆｉｒｓｔｌｙ　ｔｕｒｎｅｄ　ｙｅｌｏｗ　ａｎｄ　ｗｉｔｈｅｒｅｄ　ｗｈｉｌｅ　ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ　ｗｅｒｅ　ｓｌｉｇｈｔｌｙ　ｉｎ－
ｊｕｒｅｄ．Ｗｈｅｎ　ｓａｌｔ　ｓｔｒｅｓｓ　ｗａｓ　ｒｅｍｏｖｅｄ，ｔｈｅ　ｒｅｃｏｖｅｒｙ　ａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ　ｗａｓ　ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ　ｉｍ－
ｐｒｏｖｅｄ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ．Ｔｈｅｓｅ　ｓｔｕｄｉｅｓ　ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ　ｔｈａｔ　ＢｎＲＣＨ ｍａｙ　ｐａｌｙ　ａｎ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｒｏｌｅ　ｉｎ
ｅｎｈａｎｃｉｎｇ　ｔｈｅ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｏｆ　ｓａｌｔ　ｓｔｒｅｓｓ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｓａｌｔ　ｓｔｒｅｓｓ，ＢｎＲＣＨ，ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ，ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｒａｔｅ，ｓｅｅｄｌｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ
１　引　言
植物在生长发育过程中，会受到各种逆境因
子的胁迫，如高温、干旱、盐碱和病害等．其中盐
胁迫是目前影响植物生长和农作物产量的最主要
非生物逆境因子之一．据统计，全世界约有超过
２０％的农业灌溉土地受到盐渍化危害［１］，中国有
约２．７×１０７　Ｉｎｎ２的土地盐渍化，其中７×１０６　ｈｍ２
为农田．盐渍化土地面积的不断扩大及耕地面积
的减少已经给农业生产造成了重大的损失，因此，
利用转基因手段获得抗盐的转基因植物，提高农
作物产量、培育耐盐作物新品种已经成为当今植物
生物技术领域研究的热点之一［２］．
在过去的实验研究中，本实验室为探索
　 四川大学学报（自然科学版） 　 第５０卷
ＡＴＰ６在甘蓝型油菜细胞质雄性不育过程中的作
用机理，利用酵母双杂交技术，以 ＡＴＰ６作为诱
饵，筛选甘蓝型油菜ｃＤＮＡ文库得到了与 ＡＴＰ６
相互作用的蛋白质．从中选出部分阳性克隆测序
后，在ＮＣＢＩ经过比对分析，得到一批与ＡＴＰ６有
潜在相互作用的蛋白序列，并且发现其中一个蛋
白的氨基酸序列中含有一个锌指拉链的结构功能
域（ＲＩＮＧｖ）．编码该蛋白质的基因与拟南芥中未
知基因ＡＴ３Ｇ４７５５０的核苷酸的序列相似性高达
８６％，本实验室将该基因暂时命名为ＢｎＲＣＨ［３］．
体外研究表明该基因具有泛素－蛋白连接酶活
性［４］，前人研究发现ＲＩＮＧｖ结构与植物的抗逆性
密切相关［５］．为研究该基因与植物抗逆性的关系，
本实验室从甘蓝型油菜ｃＤＮＡ 文库克隆了Ｂｎ－
ＲＣＨ 基 因 的 全 长 序 列，构 建 植 物 表 达 载 体
ｐＣＡＭＢＩＡ２３０１Ｇ－ＢｎＲＣＨ，转 化 根 癌 农 杆 菌
（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＥＨＡ１０５菌株，并通过花序浸染
的方法得到转基因拟南芥．因此本实验以转基因
拟南芥为材料，主要研究ＢｎＲＣＨ 基因在植物耐
盐中的作用．
盐胁迫严重影响植物生长发育、造成植物和农
作物减产［６］，其最普遍和最显著的效应是抑制生
长．本研究以ＢｎＲＣＨ 转基因拟南芥为材料，提取
其总ＤＮＡ并用ＰＣＲ法对转基因拟南芥进行鉴
定，确保ＢｎＲＣＨ 基因已经成功转入拟南芥中．然
后以ＮａＣｌ作为盐胁迫因子，探讨ＢｎＲＣＨ 基因的
表达对拟南芥在盐胁迫条件下生长的影响［７］．研
究结果发现：在盐胁迫条件下，ＢｎＲＣＨ 转基因拟
南芥萌发存活率明显高于野生型拟南芥；转基因
拟南芥幼苗在盐胁迫下生长与野生型拟南芥差异
不明显，但在恢复正常条件生长一段时间后，转
基因拟南芥长势明显优于野生型拟南芥．研究结
果表明ＢｎＲＣＨ 基因能够提高转基因植物的抗盐
功能，因此ＢｎＲＣＨ 基因将可能在培育耐盐作物
新品种、提高农作物产量、开发利用盐渍化土地等
方面具有重要研究意义．
２　材料与方法
２．１　实验材料
２．１．１　植物材料　野生型（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ
Ｌ．）ＲＬＤ及ＢｎＲＣＨ 转基因株系（１０－１、１－７、１０１－６）
的拟南芥种子由本实验室保存．
２．１．２　载体及引物　载体ｐＣＡＭＢＩＡ２３０１Ｇ、已
构建植物表达载体ｐＣＡＭＢＩＡ２３０１Ｇ－ＢｎＲＣＨ，由
本实验室保存．
３５Ｓ 引 物：５’－ＴＣＣＣＣＣＣＧＧＧＧＣＡＡＧＡＣ－
ＣＣＴＴＣＣＴＣ－３’，ＢｎＲＣＨ 基因特异性下游引物：
ｄｏｗｎ： ５’－ＣＧＣＧＡＧＣＴＣＴＣＡＧＡＣＴＧＧＴＧＴＴ－
ＧＧＧＴＴＧＧＡＴＡＴＴ－３’．
２．２　实验方法
２．２．１　种子灭菌及培养　拟南芥种子用ｄｄＨ２Ｏ
浸泡，依次用７５％乙醇和０．１％的升汞溶液表面
消毒１ｍｉｎ和８ｍｉｎ，无菌水洗涤５～６遍，４℃春
化２～３ｄ，分别播种于 ＭＳ固体培养基和含有不
同ＮａＣｌ浓度的固体培养基中，置于温室中（温度
２２℃，１６ｈ／８ｈ光暗周期，相对湿度７０％）培养．
２．２．２　转基因植株的ＰＣＲ鉴定　以生长两周左
右的拟南芥幼苗为实验材料，ＣＴＡＢ法提取健壮
植株幼苗的总ＤＮＡ进行ＰＣＲ检测．ＰＣＲ检测反
应扩增体系为：２μＬ　１０×ｂｕｆｆｅｒ，１．２μＬ　２５ｍＭ
ＭｇＣｌ２，２μＬ　２．５ｍＭ　ｄＮＴＰ，１μＬ　２０ｍＭ　３５Ｓ引
物（Ｆ），１μＬ　２０ ｍＭ　ＢｎＴＲ１－Ｄｏｗｎ引物（Ｒ），
１μＬ　ＤＮＡ 模板，０．２μＬ　ＴａｑＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，
１１．６μＬ　ｄｄＨ２Ｏ，总体积２０μＬ．扩增条件为：
９５℃预变性５ｍｉｎ；９４℃变性３０ｓ，５２℃退火
４５ｓ，７２℃延伸１ｍｉｎ，３３个循环；最后７２℃延
伸１０ｍｉｎ．采用１％琼脂糖凝胶检测ＰＣＲ产物．
２．２．３　盐胁迫对种子萌发存活率的影响　野生型
ＲＬＤ和ＢｎＲＣＨ 转基因株系（１０－１、１－７、１０１－６）的
拟南芥种子数量各５０粒以上，分别播种于普通
ＭＳ培养基（０ｍＭ　ＮａＣｌ）及含有１００ｍＭ　ＮａＣｌ、
１５０ｍＭ　ＮａＣｌ浓度的 ＭＳ固体培养基中培养，琼
脂粉浓度为１．０％．在盐胁迫条件下，并不是所有
萌发的种子都可以继续存活，其中部分种子萌发
后逐渐萎缩，不能进一步生长出真叶甚至死亡．
本实验中我们将种子萌发后能够生长出真叶的幼
苗作为能够存活的依据［８，９］，观察盐胁迫条件下野
生型与转基因拟南芥种子萌发存活率的差异，并
分别统计能生长出子叶的种子的数量．每个处理
重复３次．
２．２．４　盐胁迫对拟南芥幼苗生长的影响　 普通
ＭＳ培养基中生长２周左右的拟南芥幼苗，挑选数
量相同、生长良好且长势基本一致的拟南芥幼苗各
５０株以上，分别移植于含有１００ｍＭ、１５０ｍＭ、
２００ｍＭ、２００ｍＭ 、３００ｍＭ　ＮａＣｌ的培养基中培养
一定时间，观察不同浓度的ＮａＣｌ胁迫对拟南芥幼
苗生长的影响［１０］；然后将受到５种盐胁迫的所有
幼苗对应移植到含有０．８％琼脂粉的普通固体培
４４６
第３期 　　 陈凤莲，等：油菜ＢｎＲＣＨ 基因提高转基因拟南芥的耐盐性研究 　
养基中恢复培养数天，观察并记录不同转基因拟
南芥株系的恢复生长能力的差异［１１］．本实验重复
３次．
３　结果与分析
３．１　转基因植株的ＰＣＲ鉴定
以拟 南 芥 幼 苗 总 ＤＮＡ 为 模 板，ｐＣＡＭ－
ＢＩＡ２３０１Ｇ载体作阴性对照，ｐＣＡＭＢＩＡ２３０１Ｇ－
ＢｎＲＣＨＦ载体作阳性对照，用３５Ｓ引物和Ｂｎ－
ＲＣＨ 基因特异性下游引物（ＢｎＲＣＨ－Ｄｏｗｎ）进行
ＰＣＲ扩增反应检测转基因植株中．所得ＰＣＲ产物
进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图１所示，阳性对照
中目的基因片段大小为８６０ｂｐ左右，野生型拟南
芥ＲＬＤ中未检测到目的片段，而在ＢｎＲＣＨ 转基
因植株１０－１、１０１－６和１－７中均检测出与阳性对照
大小相同的条带．此结果说明转基因拟南芥中含
有ＢｎＲＣＨ 基因片段，野生型拟南芥中不含Ｂｎ－
ＲＣＨ 基因片段．
图１　转基因植株ＰＣＲ鉴定
Ｍ：分子量标准１：野生型ＲＬＤ；２，３，４：分别是ＢｎＲＣＨ 转
基因株系１０－１，１０１－６，１－７；５：阴性对照（ＡＢ１Ａ２３０１Ｇ）；６：
阳性对照（ＡＢ１Ａ２３０１Ｇ－ＢｎＴＲ１）
Ｆｉｇ．１　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｐｌａｎｔｓ　ｂｙ　ＰＣＲ
Ｍ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｗｅｉｇｈｔ　Ｍａｒｋｅｒ，１：Ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ　ｐｌａｎｔ　ＲＬＤ，２，３，
４：ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｐｌａｎｔ　１０－１，１０１－６，１－７，５：ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ
（ＡＢ１Ａ２３０１Ｇ），６：ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ（ＡＢ１Ａ２３０１Ｇ－ＢｎＴＲ１）
３．２　转基因拟南芥在盐胁迫下的萌发存活率
在研究不同浓度的 ＮａＣｌ胁迫对拟南芥种子
萌发的影响时，分别对种子萌发存活率和萌发后
幼苗的生长状况进行了分析．研究结果发现：在
普通 ＭＳ培养基中（Ｃｏｎｔｒｏｌ），所有拟南芥种子都
能全部萌发，且野生型ＲＬＤ和ＢｎＲＣＨ 转基因拟
南芥种子萌发存活率及萌发后幼苗的生长情况基
本没有差异（如图２－Ａ和图２－Ｄ中Ｃｏｎｔｒｏｌ）；而在
含有１００ｍＭ　ＮａＣｌ的 ＭＳ培养基中，ＲＬＤ与Ｂｎ－
ＲＣＨ 转基因拟南芥种子也可全部萌发，但Ｂｎ－
ＲＣＨ 转基因株系萌发后的长势明显优于野生型
ＲＬＤ（如图２－Ｂ），且能生长出两片子叶的幼苗数量
比野生型高出３～５倍（如图２－Ｄ）；而在含有１５０
ｍＭ　ＮａＣｌ的培养基中，ＲＬＤ与ＢｎＲＣＨ 转基因拟
南芥种子均能萌发，但均不能生长出子叶且最终
死亡（图２－Ｂ）．
此结果表明，在较低浓度的 ＮａＣｌ胁迫条件
下，ＢｎＲＣＨ 转基因拟南芥（１０－１、１－７、１０１－６）种子
具有良好的耐盐能力．
３．３　转基因拟南芥幼苗对盐胁迫的反应
普通 ＭＳ培养基中生长２周左右的拟南芥幼
苗，挑选数量相同、生长良好且长势基本一致的幼
苗各５０株以上，分别移植于含有１００ｍＭ、１５０
ｍＭ、２００ｍＭ、２５０ｍＭ、３００ｍＭ　ＮａＣｌ的 ＭＳ固体
培养基中培养２４ｄ后，分析转基因拟南芥幼苗对
不同浓度盐胁迫的反应差异（本文仅展示部分重要
结果）．研究发现：拟南芥幼苗在３００ｍＭ　ＮａＣｌ胁
迫条件下生长７ｄ后就全部死亡，而１００ｍＭ
ＮａＣｌ对拟南芥幼苗生长的影响非常小，所有拟南
芥幼苗仍可继续正常生长；而１５０ｍＭ～２５０ｍＭ
的ＮａＣｌ胁迫虽然不会导致拟南芥幼苗死亡，但均
严重影响其正常生长，幼苗子叶均出现不同程度
的发黄甚至变成褐色，且野生型 ＲＬＤ的子叶比
ＢｎＲＣＨ 转基因株系的子叶更明显的出现黄色及
白色（如图３－Ａ和图３－Ｂ）．
为了进一步研究 ＮａＣｌ胁迫对转基因拟南芥
幼苗生长的影响，将上述受到盐胁迫的所有幼苗
对应移植到含有０．８％琼脂粉的普通固体培养基
中恢复培养１２ｄ．结果发现：受１５０ｍＭ　ＮａＣｌ胁
迫的所有幼苗在去除盐胁迫后均能够恢复生长，
且转基因拟南芥幼苗恢复生长后的长势（体现在植
株体型较大和子叶数量较多两个方面）明显优于野
生型（如图４－Ａ）；但３个转基因株系之间无明显
差异．而受２５０ｍＭ　ＮａＣｌ胁迫的幼苗在去除盐胁
迫后，仅部分幼苗能够恢复生长，转基因株系恢
复生长的幼苗数量多于野生型，且长势明显优于野
生型的（见图４－Ｂ）；此外，转基因株系表现不同的
恢复生长能力，从大到小依次为：１－７，１０－１，
１０１－６．
５４６
　 四川大学学报（自然科学版） 　 第５０卷
图２　不同ＮａＣｌ浓度对ＢｎＲＣＨ 转基因拟南芥萌发的影响
Ｆｉｇ．２　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ＮａＣｌ　ｏｎ　ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＢｎＲＣＨｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｐｌａｎｔｓ
（Ａ）：Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　０ｍＭ　ＮａＣｌ　ｏｎ　ＢｎＲＣＨｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ａｎｄ　ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ　ｐｌａｎｔｓ　ｉｎ　ＭＳ　ｐｌａｔｅｓ　ｆｏｒ　１０ｄａｙｓ．
（Ｂ）：Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　１００ｍＭ　ＮａＣｌ　ｏｎ　ＢｎＲＣＨｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ａｎｄ　ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ　ｐｌａｎｔｓ　ｉｎ　ＭＳ　ｐｌａｔｅｓ　ｆｏｒ　２６ｄａｙｓ．
（Ｃ）：Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　１５０ｍＭ　ＮａＣｌ　ｏｎ　ＢｎＲＣＨｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ａｎｄ　ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ　ｐｌａｎｔｓ　ｉｎ　ＭＳ　ｐｌａｔｅｓ　ｆｏｒ　２６ｄａｙｓ．
（Ｄ）：Ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ　ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ　ｗｉｔｈ　ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｐｌａｎｔｓ　ａｆｔｅｒ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　０、１００、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ　ｉｎ　ＭＳ　ｐｌａｔｅｓ　ｆｏｒ　２６ｄａｙｓ
图３　ＮａＣｌ对ＢｎＲＣＨ 转基因拟南芥幼苗生长的影响
Ｆｉｇ．３　Ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ＮａＣｌ　ｏｎ　ＢｎＲＣＨｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ
（Ａ）：Ｔｈｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｌａｎｔｓ　ｕｎｄｅｒ　ｓａｌｔ　ｓｔｒｅｓｓ．１２－ｄ－ｏｌｄ　ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ　ｗｅｒｅ　ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ　ｉｎｔｏ　ＭＳ
ｍｅｄｉｕｍ　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ　ｗｉｔｈ　１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，ａｌ　ｔｈｅ　ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ　ｇｒｅｗ　ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ｓａｌｔ　ｓｔｒｅｓｓ　ｆｏｒ　２４ｄａｙｓ，
ａｎｄ　ｔｈｅｎ　ｔｈｅ　ｐｈｏｔｏｓ　ｗｅｒｅ　ｔａｋｅｎ
（Ｂ）：Ｔｈｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｌａｎｔｓ　ｕｎｄｅｒ　ｓａｌｔ　ｓｔｒｅｓｓ．１２－ｄ－ｏｌｄ　ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ　ｗｅｒｅ　ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ　ｉｎｔｏ　ＭＳ
ｍｅｄｉｕｍ　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ　ｗｉｔｈ　２５０ｍＭ　ＮａＣｌ，ａｌ　ｔｈｅ　ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ　ｇｒｅｗ　ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ｓａｌｔ　ｓｔｒｅｓｓ　ｆｏｒ　２４ｄａｙｓ，
ａｎｄ　ｔｈｅｎ　ｔｈｅ　ｐｈｏｔｏｓ　ｗｅｒｅ　ｔａｋｅｎ
６４６
第３期 　　 陈凤莲，等：油菜ＢｎＲＣＨ 基因提高转基因拟南芥的耐盐性研究 　
图４　去除ＮａＣｌ胁迫后不同拟南芥幼苗恢复生长能力的差异
Ｆｉｇ．４　Ｔｈｅ　ｒｅｃｏｖｅｒｙ　ａｂｉｌｉｔｙ　ｔｏ　ｇｒｏｗ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ　ａｆｔｅｒ　ｒｅｍｏｖｉｎｇ　ｔｈｅ　ｓａｌｔ　ｓｔｒｅｓｓ
（Ａ）：Ｔｈｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｒｅｃｏｖｅｒｙ　ａｂｉｌｉｔｙ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ＲＬＤ　ａｎｄ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｐｌａｎｔｓ．１２－ｄ－ｏｌｄ　ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ　ｗｅｒｅ　ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ
ｕｎｄｅｒ　ｓａｌｔ　ｓｔｒｅｓｓ　ｏｆ　１５０ｍＭ　ＮａＣｌ　ｆｏｒ　２４ｄａｙｓ，ｔｈｅｎ　ｒｅｍｏｖｅ　ｓａｌｔ　ｓｔｒｅｓｓ，ａｌ　ｔｈｅ　ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ　ｗｅｒｅ　ｔｒａｎｓ－
ｆｅｒｒｅｄ　ｂａｃｋ　ｔｏ　ｎｏｒｍａｌ　ＭＳ　ｐｌａｔｅｓ　ａｎｄ　ｇｒｏｗｎ　ｆｏｒ　１２ｄａｙｓ．
（Ｂ）：Ｔｈｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｒｅｃｏｖｅｒｙ　ａｂｉｌｉｔｙ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ＲＬＤ　ａｎｄ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｐｌａｎｔｓ．１２－ｄ－ｏｌｄ　ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ　ｗｅｒｅ　ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ
ｕｎｄｅｒ　ｓａｌｔ　ｓｔｒｅｓｓ　ｏｆ　２５０ｍＭ　ＮａＣｌ　ｆｏｒ　２４ｄａｙｓ，ｔｈｅｎ　ｒｅｍｏｖｅ　ｓａｌｔ　ｓｔｒｅｓｓ，ａｌ　ｔｈｅ　ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ　ｗｅｒｅ　ｔｒａｎｓ－
ｆｅｒｒｅｄ　ｂａｃｋ　ｔｏ　ｎｏｒｍａｌ　ＭＳ　ｐｌａｔｅｓ　ａｎｄ　ｇｒｏｗｎ　ｆｏｒ　１２ｄａｙｓ．
　　上述结果表明：在盐胁迫条件下，与野生型
相比，ＢｎＲＣＨ 转基因拟南芥对ＮａＣｌ胁迫的反应
不敏感，且在盐胁迫后较野生型具有较强的恢复
生长的能力，因此ＢｎＲＣＨ 基因能够提高转基因
拟南芥的耐盐性．
４　讨　论
植物对不良环境的适应性和抵抗力称为抗逆
性（ｓｔｒｅｓｓ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）．凡是不利于植物生长发育
的环境统称为逆境，包括高温、干旱、高盐、缺氧、
寒冷等非生物胁迫和寄生植物的寄生、病源物浸染
等生物胁迫．盐胁迫是影响植物生长和农作物产
量的最重要的非生物胁迫因素之一，盐胁迫会破
坏植物体内离子失衡和渗透平衡，造成氧化伤害，
抑制生长代谢，甚至导致植物死亡［１２，１３］．盐碱土
中的盐类通常为 ＮａＣｌ、Ｎａ２ＳＯ４、Ｎａ２ＣＯ３和 ＮａＨ－
ＣＯ３等，盐胁迫造成植物体内Ｎａ＋过量积累，影响
了植物对 Ｋ＋和Ｃａ２＋等营养的吸收，从而影响植
物正常生长，对植物造成伤害［１４］．因此，本实验
以ＮａＣｌ模拟盐胁迫条件，研究ＢｎＲＣＨ 的表达对
拟南芥生长的影响．
植物体在遭遇盐胁迫时，在许多方面都会发
生变化，主要体现在影响种子萌发、幼苗的生长、
主侧根的长度、幼苗的鲜重、叶绿素含量［１５］、开花
时间等等．如Ｂａｊｉ［１６］等用３００ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ胁迫
玉米幼苗时发现幼苗鲜重显著降低，Ｌｉ　Ｚｈｉ－
ｇａｎｇ［１７］等发现拟南芥ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ突变体在不同浓
度ＮａＣｌ胁迫下，其种子萌发率和幼苗生长均受到
不同程度的抑制．本实验主要研究在 ＮａＣｌ胁迫
下，转基因拟南芥种子萌发和幼苗生长的变化，
得到了相似的结果．若以萌发并且长出子叶作为
存活的依据，在０～１５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ浓度之间，
随着 ＮａＣｌ浓度升高，拟南芥存活的数量减少．
１５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ是拟南芥种子存活的抑制浓
度，即此时所有拟南芥种子均能长出胚芽，但随
着时间推移全部死亡；而在１００ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ浓
度时，野生型拟南芥仅有１０％的种子能生长出子
叶而存活，ＢｎＲＣＨ 转基因株系有３０％～６０％的
种子能够存活．此外，本实验还对以萌发出胚芽
作为萌发依据时的萌发率进行了统计，结果显示：
随着ＮａＣｌ浓度升高，拟南芥的萌发率逐渐降低；
３００ｍｍｏｌ／Ｌ浓度时，拟南芥几乎不能萌发；在
１５０、２００、２５０ｍｍｏｌ／Ｌ浓度时，转基因拟南芥中子
的萌发率均显著高于野生型．上述结果可以说明
ＢｎＲＣＨ 基因提高了拟南芥对盐胁迫逆境的耐受
能力．
植物耐盐是指通过生理或代谢过程来适应细
胞内的高盐环境的影响，这对盐生植物与非盐生
植物的抗盐能力都有特别重要的意义［１８］．研究表
明植物的抗盐机理主要有３种，一是避让（ａｖｏｉｄ－
ａｎｃｅ）（逃避盐害），通过降低盐类在体内积累，从
而避免盐类的危害；二是忍耐（ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）（忍受盐
害），通过生理的或代谢的适应而忍受已进入细胞
的盐类；三是缓解（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｏｎ）［１９］．本实验在研
７４６
　 四川大学学报（自然科学版） 　 第５０卷
究拟南芥幼苗对盐胁迫的反应时，在１５０ｍＭ～
２５０ｍＭ　ＮａＣｌ培养基中，拟南芥幼苗虽不会致死，
但幼苗子叶叶片蜷缩且出现不同程度的发黄甚至
变成褐色．此种现象说明在一定的较低盐浓度范
围内，植物通过自身的抗盐机制得以存活较长时
间，此时若除去盐胁迫，植物仍能恢复生长而存
活．虽然恢复正常生长条件之前，转基因拟南芥
与野生型表型相比差异不明显，但野生型株系的
子叶比ＢｎＲＣＨ 转基因株系的子叶先变成黄色，
且除去盐胁迫恢复生长后，ＢｎＲＣＨ 转基因株系
长势明显优于野生型，即转基因株系恢复能力强，
也能够说明ＢｎＲＣＨ 基因能够提高拟南芥幼苗对
盐胁迫的耐受性．
通过以上研究证明，ＢｎＲＣＨ 基因能够提高
转基因植物的耐盐功能，在植物抗逆反应过程中
发挥重要作用．因此该基因将有可能在培育耐盐
作物新品种、提高农作物产量、开发利用盐渍化土
地等方面具有重要研究意义．
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［责任编辑：白林含］
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