全 文 ：第 27卷 第 2期 西北农业大学学报 Vol. 27 No. 2
1999年 4月 Ac ta Univ . Ag ric. Bo reali-occidentalis Apr. 1999
拟南芥菜一个组织特异基因的克隆与研究
刘庆法 1, 2 刘 勤 1 王中华 1
( 1西北农业大学农学系 ,陕西杨凌 712100) ( 2复旦大学遗传研究所 ,上海 200433)
摘 要 利用启动子陷阱技术 ,鉴定和分离了一个在拟南芥菜的维管束和花药的绒毡层
细胞中高度特异性表达的基因。 经鉴定 ,该基因全长为 4. 4 kb,编码一种与 RN A helica se A
高度同源的蛋白。组织化学和原位杂交的证据表明 ,该基因只在维管束中少数细胞内转录、翻
译并在原位发挥作用。
关键词 拟南芥菜 ,基因表达 ,组织特异性 ,绒毡层 ,维管束 ,基因克隆
分类号 Q789, S188
细胞分化和器官发生过程中基因表达的调节是发育生物学的中心问题之一。 研究表
明 , mRN A的转录和蛋白质的翻译在植物的生活周期中具有时空特异性。 了解这种特异
性的机制对植物基因工程的研究具有重要意义。
Bellen和 OKane等 [1 ]在果蝇 , Allen等 [2 ]在小鼠上首先利用在一个弱启动子控制下
的报道基因 lacZ,建立了检测细胞和组织特异性增强子序列的直接方法。近年来植物中遗
传转化技术的发展为在分子水平上研究植物中特定基因的调控、植物分化和发育的遗传
控制提供了可能性 [3 ]。 Topping等 [ 4]和 Lindsey等 [5 ]利用 T-DNA标签 ( tagging )技术在植
物上建立了类似的系统 ,用以鉴定组织或细胞特异性调控序列并研究其在植物中控制基
因特异性表达的机制。 其原理是: 向受体植物引入一个没有启动子的 gusA作为报道基
因 ,当这一基因被引入到受体基因组的一个基因的启动子下游时 ,则 gus基因可以被激
活 ,从而表现出并与被插入的基因形成可以共转录的融合基因。因此 , gus基因的表达模
式就反映了被插入的基因所具有的调控序列的特性。这个插入序列应该与被插入的基因
及其调控序列是紧密连锁的 ,这样就很容易分离和克隆这些序列 [ 5]。利用这种技术 , Lind-
sey等先后分离了多种组织和器官特异性的基因 [4～ 8 ] ,证明了这种技术的广泛适用性。 本
文报道利用这一方法鉴定并克隆的一个在拟南芥菜 ( Arabidopsis thaliana C24)维管束和
花药的绒毡层细胞中高度特异性表达基因的研究结果。
1 材料与方法
1. 1 植物的遗传转化
拟南芥菜生态型 C24的转化参照 Clarke等 [9 ]的方法进行 ,所用农杆菌 ( Agrobacteri-
um tumaf iciens )为 LBA4404株系。
1. 2 遗传转化所用载体的基因组成
本研究中用的载体为 p gusBin19[4 ] ,由 gus A的编码区与 nos终止序列组成的 2. 2
收稿日期 1998-09-29
作者简介 刘庆法 ,男 , 1962年生 ,副教授 ,在读博士
kb的片段插入到 pBin19[10 ]的多克隆位点构成。 gusA序列的 5′末端与 T-DNA的左边界
重复序列 LB相邻。
1. 3 基因的克隆
参照 Lindsey等 [5 ]的方法获得了 AtV T-1中 T-DNA的侧翼序列 , 以此为探针从
cDN A文库中得到了与该插入突变有关的关键基因。 cDN A文库的构建以野生型拟南芥
菜生态型 C为 m RNA来源 ,参照文献 [11]描述的方法进行。 5′-AmpliFinder系统的使用
参照厂家 ( CloneTech )的说明进行。
1. 4 组织化学分析
gus酶活性的组织定位 ,参照 Block和 Debrouw er [12 ]建立的塑料包埋的组织原位酶
活性组织化学方法进行了改良 [13 ]。 实验材料采用插入了 T-DNA的转化子植株 AtV t-1
进行。 受检组织 (叶片、茎、根和花器等 )参照文献 [14 ]的方法在室温下用 1 mmo l /L的 5-
溴 -4氯 -3-吲哚 -β -D-葡萄糖醛酸 ( X-g luc, Biosynth G, Staad, Swizerland)染色 12 h.缓冲
液为含 10 mmo l /L EDTA,体积分数为 0. 1% Tri ton X-100[15 ]的 100 mmol /L磷酸缓冲
液。为了抑制可能的背景反应 ,反应体系中加入了不到 200 g /L的甲醇。为了抑制反应中
间产物在组织中的扩散 ,在缓冲液中加入了 1 mmol /L的铁氰化钾。塑料包埋剂采用 His-
to resin( Reichert jung 70-2218-500)。适当大小的材料参照厂家的说明进行固定和包埋 ,切
片后在相差显微镜下观察、照相。
1. 5 组织原位杂交分析
原位杂交参照文献 [16 ]的方法进行了改良 [ 13]。材料采用拟南芥菜 C24野生型的茎
段、根和叶片等。探针采用目的 DNA的两个片段 Iww36和 Iww38,以随机引物法进行标
记。放射自显影后在相差显微镜下观察照相。
2 结果与分析
2. 1 T-DNA侧翼序列的 IPCR扩增、目的基因的分离和鉴定
以前的研究已经证明 , AtV T-1是一个仅含有单拷贝 T-DNA插入的转基因系 [5 ]。 以
T-DNA为探针与纯化的 AtV T-1转基因系基因组 DNA的限制性酶切产物进行 Sor th-
ern杂交 ,分离出了含有 T-DNA插入片段的基因组 DNA片段 ,该片段含有长约 0. 5 kb
的植物 DN A.根据 Lindsey等 [5 ]的方法采用 IPCR方法 ,获得了 T-DNA侧翼的植物
DNA片段并进行了克隆。
以上述克隆片段为探针 ,从 cDN A文库中分离了与插入突变有关的克隆 ww136.经
Southern杂交分析 (图 2) ,确定该克隆的插入片段长度为 3. 7 kb.为了方便序列分析 ,又
对该克隆的插入片段进行了亚克隆 ,得到 ww 36和 ww38.为了确定该克隆是否是完整的
基因 ,又以这两个亚克隆的插入片段为探针进行了 Northern杂交 ,发现野生型拟南芥菜
中与之相对应的 m RNA的为 4. 4 kb.从而证明克隆 136 AtV T-1的插入片段不是一个完
整的基因 ,尚缺约 0. 7 kb的 cDN A.随后用 Clone Tech公司的 5′AmpliFinder cDN A末
端快速扩增 ( 5′RACE)系统克隆了丢失的 0. 7 kb cDN A片段。至此 ,完成了该基因 4. 4
kb cDN A的克隆工作。根据该基因的全序列 ,其编码区与酵母、人、牛、果蝇、小鼠等生物
中广泛存在的 RNA helicase A有高度同源性。 对该基因全序列的分析结果将另文报道。
12 西北农业大学学报 第 27卷
图 1 利用 gus为报道基因研究植物基因表达调控的原理
A. Ti质粒 T-DN A片段的基因结构 , g us基因没有 5′调控序列和启动子 ,正常情况下不能被转录 ; B.假定的一个植物
结构基因 X的结构 , P为其启动子 ; C, D.当无启动子的 gus基因插入到植物基因启动子 P的下游时 ,启动子 P即可激
活 gus基因 ,使其与植物基因的 5′区一起被转录和翻译 ,从而形成融合蛋白 ,该基因产物具有 gus酶的活性 ,可以把 X-
glu分解产生蓝色产物 ,从而反映出启动子 P的所控制的植物基因 X的表达特异性。 C为 gus插入到植物基因 X的启
动子 P和结构基因之间的情况 ; D为 g us基因插入到植物基因 X的内部 ,形成融合基因的情况。 LB和 RB分别代表 T-
DN A的左右边界区 , nos代表 nos基因的 3′终止序列 , T表示植物基因 X的终止序列。
图 2 w w 136克隆与拟南芥
菜基因组的杂交结果
A. DN A的 Sou th ern杂交 ;
B.总 RN A的 Northern杂交
2. 2 gus活性的组织化学定位
以转基因系 AtV T-1为材料 ,对 gus的活性进行了组织化
学定位研究。利用报道基因 gus分析植物基因表达的原理如图 1
所示。 研究发现 ,在以 X-gluc染色的幼苗中 gus活性只出现在
根、茎、叶等器官的维管束 (图 3A, 3B)和花药的绒毡层以及花丝
维管束 (图 3C)中 ,在这些器官的其他组织中未见 gus活性。 可
见 ,这是一个只在维管束和绒毡层中表达的特异基因。
为了进一步精确分析 gus活性在维管束中的分布 ,又对染
色的根、茎、叶进行了切片观察 ,发现在维管束中也不是所有的
细胞都有 gus活性 ,例如在根的维管束中 ,维管束鞘、韧皮部的
细胞中可以见到明显的 gus活性 ,而其木质部的细胞未见 gus
染色反应 (图 3D)。在茎中 ,维管束中的形成层细胞有明显的 gus活性 ,而木质部的全部细
胞、韧皮部的筛管细胞以及维管束鞘内的髓部所有细胞中均未见有 gus活性。 由此可见 ,
AtV T-1是一个只在维管束中的极少数细胞和花药绒毡层细胞中表达的高度特异性基
因。
2. 3 基因表达的原位杂交分析
基因的表达是一个极为复杂的过程 ,至少包含了 m RNA的转录和蛋白质的翻译两个
大的步骤。在这两个步骤中还有复杂的 mRNA和蛋白质的加工过程。基因的转录和翻译
以及所编码的蛋白质功能的发挥不一定是在同一种细胞里完成的。如果把一个基因的转
录、翻译以及翻译产物功能的发挥 3个步骤发生的地点 (即组织或细胞 ) ,分别以 A, B和
C表示 ,则 A, B, C可以是相同的组织或细胞 ,也可能 A和 B是一种而 C是另外一种 ,也
13第 2期 刘庆法等:拟南芥菜一个组织特异基因的克隆与研究
可能 A是一种而 B和 C是另外一种 ,还有可能 A, B, C是 3种不同的组织或细胞。
图 3 AtV T-1的 gus组织化学定位
A, B, C分别示根、茎、花药绒毡层和花丝维管束 ; D表示根的切片。 箭头所指为 gus表达部位
图 4 以 WW36和 WW38为探针对
拟南芥菜 C24株系的原位杂交
拟南芥菜选用 C24株系的 6日龄幼苗茎 ,
箭头所指为杂交信号
以上利用 gus报道基因进行的研究只能反映翻
译以后成熟蛋白质的活性分布情形 ,不能反映
转录以及转录、翻译和成熟产物的功能发挥是
否有相同的组织特异性。另外 ,当 gus基因被植
物基因的启动子激活以后 , gus酶的活性是否能
够精确地反映植物内源基因的表达特征 ,一直
是一个尚未完全解决的问题。因此 ,以 ww36和
ww38为探针对野生型拟南芥菜中该基因的表
达进行了组织原位杂交分析。
图 4是拟南芥菜 C24野生型 6日龄幼苗茎
的原位杂交结果。杂交结果显示 ,该基因只在维
管束的形成层细胞中才能转录 ,在其他组织或
细胞类型中不转录。
结合图 3中对 gus酶活性的组织化学分析
结果 ,认为该株系中 gus基因所对应的内源基因只在维管束的形成层细胞中转录、翻译和
加工 ,并在这些细胞中发挥作用。
3 讨 论
象其他多细胞生物一样 ,高等植物的一个基本特点是在发育过程中的细胞分化和形
态发生 ,从而形成结构和功能高度分化的组织和器官。这一过程是通过一系列特异基因的
14 西北农业大学学报 第 27卷
启动和关闭实现的。最终形成的结构和功能各不相同的组织和器官中也有着一系列基因
的特异表达。 显然 ,在高等植物生活周期中 ,一方面 , mRN A的转录和积累有着高度的时
空特异性 ,这是个体发育正常进行的分子基础 ;另一方面 ,特定的基因是由各种各样的环
境和体内的生物化学途径激活的 ,这就构成了植物生长发育可塑性的遗传学基础 [2, 17, 18 ]。
阐明细胞分化和器官发生过程中基因的特异表达和协调 ,以及不同组织和器官中基因表
达的特异性是发育生物学的中心研究课题之一。但是 ,以往的研究中主要是通过研究发育
过程中基因表达的变化以及解析代谢网络来进行的。 90年代以来 ,分子生物学技术的发
展 ,使人们能够利用转基因技术来获得并分析和鉴定与特定形态发生过程相关的以及在
特定组织和器官中特异表达的突变体 ,分离各种特异表达的基因 ,在分子水平上解剖发育
过程的基因调控。
启动子陷阱技术是 90年代初建立的一种可以直接识别细胞和组织特异性基因、环境
或发育调节的基因并产生可见标记的方法 ,借助这种方法还可以鉴别和分离细胞、器官、
组织或发育、环境调节的特异基因以及与特定发育过程相关的基因及其调控序列。这一技
术已经成功地在若干物种得到应用 [19, 20 ] ,分离了植物在分化发育过程中建立极性的相关
基因 [6 ]、与线虫侵染相关的应答基因及其启动子 [6 ]、胚胎发育相关基因 [ 7, 8]、胚胎和幼苗形
态发生相关基因 [21 ]等。本文报到的是利用这种方法分离的一个高度组织特异的基因。实
践已经证明 ,启动子陷阱技术是一种十分有效的鉴定、分离特异基因及其调控序列、研究
基因表达的方法。 这种技术在产生各种特异性标记以及在确定基因组序列功能方面的价
值是显然的。
维管束是高等植物的特有结构 ,不但对植物体起着支撑作用 ,而且担负着物质和能量
运输以及部分信息传导的任务 ,在植物的生命活动中有着极为重要的作用。维管束也是许
多危害植物的刺吸式口器昆虫吸食汁液的渠道。分离和研究在维管束中特异表达的基因
不但对于进一步深入研究维管束的生理功能和代谢特点等有着重要意义 ,而且对于研究
寄主对虫害的应答以及利用基因工程技术防治病虫害也有着不可低估的作用。从水稻中
分离的一个维管束特异基因的启动子已经广泛用于刺吸式昆虫的基因工程研究。 绒毡层
是植物雄性生殖器官中的重要营养结构 ,对于花粉的发育有着重要的生理功能。对绒毡层
细胞特异基因的研究有助于揭示绒毡层和花粉发育的关系 ,这对于阐明植物雄性不育的
机理将有所帮助。利用绒毡层特异启动子创造雄性不育系也已经初步获得成功 ,显示出潜
在的巨大的应用价值。RNA helicase A是一种与 RNA加工有关的酶 ,它在维管束和绒毡
层中的生理意义还不清楚。 本研究所揭示的这种在维管束和绒毡层中共同表达的 RNA
helicase A基因及其表达调控的理论意义和应用价值还有待于进一步研究探索。
参 考 文 献
1 Bellen H I, OKane C J, Wil lson C, et al. P-element-mediated enh ancer detect ion: a vers atil e method to s tudy devel-
opmen t in Dros ophi la. Dev elopmen t, 1989, 3: 1288～ 1300
2 Allen N D, Cran D G, Barton S C, et al. Trans genes as probes for active ch romosomal d omain s in mouse develop-
men t. Nature, 1988, 333: 852～ 855
3 Kulemeier C, Green P J, Chua N H. Reg ulation of gene exp ression in high er plants. Ann Rev Plan t Ph ysiology,
1987, 38: 221～ 257
4 Topping J F, Wei W, Lindsey K. Functional tagging of reg ulatory elements in the plan t g enome. Dev elopm ent ,
15第 2期 刘庆法等:拟南芥菜一个组织特异基因的克隆与研究
1991, 112: 1009～ 1019
5 Lindsey K,Wei W , Clarke M C, et al. Tagging g enomic s equences th at direct transg ene expression by activation of
a promoter t rap in plan ts. Transg enic Research , 1993, 2: 33～ 47
6 Barth els N, van der Lee F M, Kla J, et al. Regulatory sequences of Arabidopsis drive repor ter gene expression in n e-
matode feeding s tructures. Th e Plant Cell , 1997, 9: 2119～ 2134
7 Lindsey K, Topping J F, da Rocha P S C F, et al. Ins ertional mu tagenesi s to dis sect embryonic dev elopm ent in Ara-
bidop sis. In: Wang T, Cuming A C. Em bryog enesis: generation of a plant. UK: Ox fo rd Pres s. 1996. 51～ 76
8 Topping J F, Lindsey K. Promoter t rap markers di ff eren tial st ructu ral and posi ti onal com ponen ts of polar develop-
men t in Arabidopsis. Th e Plan t Cell, 1997, 9: 1713～ 1725
9 Clarke M C,Wei W , Lind sey K. High f requency transformation of Arabidopsis thal iana b y A grobacterium tumefa-
ciens. Plant Molecular Biolog y Report , 1992, 10: 178～ 189
10 Bevan M W. Binary Agrobacterium vectors for plant transformation. Nuclear Acids Research, 1982, 22: 8711～
8721
11 Maniati s T, Fri ts ch E F, Sam brook J. M olecular Cloning: A laborato ry manual. Cold Sp ring Harb or: Cold Spring
Harbor Laboratory Press, 1982. 364～ 471
12 Block M D, Debrouw er D. Insitu histoch emis t ry on plas tic-embedd ed plant material: th e dev elopm en t of an art i-
fact-f reeβ-glucuronidase ass ay. Plan t J, 1992, 2: 261～ 266
13 刘庆法 ,郝峥嵘 ,沈大棱 .植物基因表达的组织原位杂交和原位组织化学分析技术的改进 .植物学报 , 1997, 40: 580
～ 584
14 Jef fers on R A. Assaying chimerical g enes in plants: the gus g ene fusion s ystem. Plan t Molecular Biolog y Report ,
1987, 5: 387～ 450
15 Martin T, Schmid t R, Al tmann T, et al , Non-des t ruct ive as say s ystems for d etection ofβ-g lucuronidas e activi ty in
high er plants. Plant M olecular Biolog y Repo rt, 1992, 10( 1): 37～ 46
16 Cox K H, DeLeon D V , Angerer L M, et al. Detection of m RNA in u rchin e emb ryos by insitu hyb ridi zation using
as ymmetric RN A probes. Developmen tal Biology, 1984, 101: 485～ 494
17 Goldberg R B. Plants: novel developmental process es. Science, 1988, 240: 1460～ 1467
18 Edw ards J W , Coru zzi G M. Cell specif ic gene ex pres sion in plants. Ann Rev Genet, 1990, 24: 275～ 303
19 Hope I A. Promoter t rapping in Caenorh abd it is elegans. Dev elopm en t, 1991, 113: 399～ 408
20 Claes B, Smal le J, Dek eys er R, et al. Organ-d ependen t regu lation of a g ene promo ter isolated f rom rice by promot-
er-t rapping in tabacco. Plan t J, 1991, 1: 15～ 26
21 Topping J F, Ag yeman F, Henricot B, et al. Identi fication of molecular mark ers of embryogenesi s in Arabidopsis
th aliana by promoter t rapping. Plan t J, 1994, 5: 895～ 903
Cloning and Studies on a Tissue-Specific Gene in Arabidopsis
thaliana Identified by Promo ter Trapping
Liu Qingfa
1, 2 Liu Qin1 Wang Zhonghua1
( 1 Depa rtment of A gronomy, Northwestern A gricultural University ,Yangling , Shaanx i 712100)
( 2 Inst itu te of Genet ics ,Fudan University, Shanghai 200433)
Abstract By the aid of promo ter t rapping , a v ascular and tapetum-specifically ex-
pressed gene was identi fied, characterized and expressiona lly analy zed. The resul ts
show ed that the gene w as 4. 4 kb in leng th, coding a pro tein highly homo logous to RN A
helicase A. Histochemical and tissue in situ hybridization analy sis rev ealed tha t i t w as
expressed and processed in xylem and tapetum cells, and functions in these cells only.
Key words Arabidopsis thal iana , g ene expression, tissue-specific, tapetum, vascu-
lar , g ene cloning
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