全 文 ：孙 悦，王 蕾，姬筱雅，等． 大丽菊花瓣生长与衰老相关基因 DpXTH的表达分析［J］． 江苏农业科学，2012，40( 7) : 28 － 31．
大丽花花瓣生长与衰老相关基因 DpXTH的表达分析
孙 悦，王 蕾，姬筱雅，郑必平，谈建中
( 苏州大学金螳螂建筑与城市环境学院，江苏苏州 215123)
摘要: 为了研究木葡聚糖内糖基转移酶 /水解酶( XTH) 基因在大丽花花瓣生长和衰老过程中的功能，本试验以大
丽花( Dahlia pinnata Cav) 花瓣为材料，在克隆大丽花花瓣 XTH基因 cDNA序列( DpXTH) 的基础上，以 18S rRNA为内
参基因，利用半定量 RT － PCR技术，检测了大丽花花瓣生长与衰老过程中 DpXTH 基因的表达变化。结果显示，大丽
花开花过程中 DpXTH的表达量急剧增加，盛花期达到最大，而衰老期又迅速下降，表明 DpXTH 与花瓣的生长发育密
切相关，可能在大丽花花瓣生长的不同阶段 DpXTH对细胞壁中木葡聚糖的代谢具有不同的调控方式。
关键词: 大丽花; 花瓣; 生长; 衰老; 木葡聚糖内糖基转移酶 /水解酶( XTH) ; 基因表达
中图分类号: S682． 2 + 61; Q786 文献标志码: A 文章编号: 1002 － 1302( 2012) 07 － 0028 － 03
收稿日期: 2011 － 12 － 20
作者简介:孙 悦( 1987—) ，男，河北沧州人，硕士研究生，讲师，研究
方向为园林植物分子生物学。E － mail: sunyue － 8702@ 163． com。
通信作者:谈建中，博士，教授，主要研究方向园林植物生物技术。
E － mail: szutjz@ hotmail． com。
开花植物的生命周期中，开花和花瓣衰老是高度调控的
生命活动［1］，其中开花涉及花瓣细胞壁的延伸［2］，而花瓣衰
老则涉及到细胞壁的降解［3］。因此，细胞壁结构的改变是开
花和花瓣衰老过程中一个重要的生理变化。木葡聚糖是细胞
壁的一种结构多糖，是双子叶植物细胞初生壁的主要半纤维
素，是细胞壁的主要机械支撑物质，它的酶切裂解可以引起细
胞壁的降解。木葡聚糖内转糖苷酶 /水解酶( xyloglucan endo
－ transglucosylase /hydrolase，XTH) 对木葡聚糖链有内切和连
接的双重效应，从而对细胞壁的膨胀疏松起重要作用。XTH
是由一个庞大的基因家族编码，目前为止，已经在很多植物中
分离和鉴定了编码 XTH的基因，如在模式植物拟南芥、水稻、
毛果杨基因组中分别有 33、29、41 个成员。XTH 基因家族中
每个成员的功能各不相同，如拟南芥的 XTH 基因( AtXTH21 )
通过改变纤维素沉积和细胞壁延伸参与主根的生长［4］; 香蕉
MA － XET1 在果实成熟过程中参与果皮和果肉的软化［5］; 胡
杨木 PeXET与其耐盐性有关［6］; 在猕猴桃中，XET 在植物发
育中发挥多种功能，但并不都与猕猴桃果实快速生长时期的
细胞壁松弛有关［7］。
目前有关 XTH 与植物生长发育之间关系的研究已有很
多报道，有关花卉 XTH 的研究也日益受到人们的关注，但对
于菊科花卉 XTH基因结构与功能的研究尚未见报道。本研
究在已经获得大丽花花瓣 XTH基因 cDNA( DpXTH，基因登录
号 HM053613) 的基础上，利用半定量 RT － PCR 技术分析了
大丽花开花和花瓣衰老过程中 DpXTH的表达变化，以便为深
入研究 DpXTH基因的生物学功能提供实验基础。
1 材料与方法
1． 1 植物材料
供试植物材料为单瓣型大丽花( Dahlia pinnata Cav) 黄色
系品种。根据发育和衰老的不同程度，将花瓣分为 4 个时期:
现蕾期( Y0) ，花瓣发育完全，但未伸展;透色期 ( Y1) ，花瓣开
始伸展，瓣色鲜艳;盛花期( Y2) ，花瓣充分伸展，花色、花型呈
现品种固有特征;衰败期( Y3 ) ，花瓣失水萎蔫，外形凌乱，边
缘呈褐色，花朵渐失观赏价值。从长势良好的植株上选取各
个时期的花瓣，双蒸水冲洗干净，晾干后立即用液氮快速冷
冻，置超低温冰箱中保存备用。
1． 2 总 RNA的提取与反转录
用 Trizol总 RNA提取试剂盒( 天根) 分别提取大丽花各
个时期花瓣的总 RNA，用 1%的琼脂糖凝胶电泳检测其完整
性，测 D260 nm /D280 nm，估计总 RNA 纯度。使用反转录试剂盒
( Fermentas) 合成第一链 cDNA。
1． 3 引物设计
根据 DpXET序列 ( GenBank 登录号: HM053613 ) 设计特
异性引物 XTH － F: 5 － CAATGAAGCTAAA GGGG － 3和 XTH
－ R: 5 － TCAAATTCCGGCTAAAC － 3; 内参基因 18S rRNA
的引物序列参考文献［8］，序列如下，18S rRNA － F: 5 － GTTG-
CAGTTAAAAAGCTC GT － 3，18S rRNA － R: 5 － TTGATTTCT-
CATAAGG TGCC －3，引物委托上海生工生物工程公司合成。
1． 4 DpXTH和 18S rRNA部分片段的克隆
PCR反应体系: cDNA 模板 1 μL，上游引物( 20 μmol /L)
0． 5 μL，下游引物 ( 20 μmol /L ) 0． 5 μL，Taq 酶 ( 0． 5 U )
0． 1 μL，10 × Taq buffer 2． 5 μL，dNTPs 2． 5 μL，加水补足
25 μL。PCR反应条件:预变性 94 ℃ 3 min;变性 94 ℃ 30 s，
退火 50 ℃ 1 min，延伸 72 ℃ 1 min，35 个循环; 72 ℃ 延伸
10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，回收目的片段，进行
T /A克隆( pUCm － T 载体、感受态菌种 JM109) ，经鉴定后阳
性克隆送上海生工生物工程公司进行测序。
1． 5 最适循环数的确定
分别以 23、26、29、32、35、38、41、44 个循环数对 DpXTH
基因和 18S rRNA基因进行扩增，以调整并确定最适宜的循
环次数。 PCR 反应体系: cDNA 模板 1 μL，上游引物
( 20 μmol /L) 0． 5 μL，下游引物( 20 μmol /L) 0． 5 μL，pfu 酶
( 0． 5 U) 0． 1 μL，10 × pfu buffer 2． 5 μL，dNTPs 2． 5 μL，加水
补足 25 μL。PCR 反应条件:预变性 94 ℃ 3 min; 变性 94 ℃
—82— 江苏农业科学 2012 年第 40 卷第 7 期
DOI:10.15889/j.issn.1002-1302.2012.07.142
30 s，退火 50 ℃ 1 min，72 ℃延伸 1 min; 72 ℃ 延伸 10 min。
1． 6 半定量 PCR反应
调整各样品持家基因 18S rRNA的 cDNA用量，以保证用
于扩增基因的模板量一致，以相同的模板量扩增 DpXTH 基
因。采用如下 PCR 反应体系: cDNA 模板，上游引物
( 20 μmol /L) 0． 5 μL，下游引物( 20 μmol /L) 0． 5 μL，pfu 酶
( 0． 5 U) 0． 1 μL，10 × pfu buffer 2． 5 μL，dNTPs 2． 5 μL，加水
补足25 μL。PCR反应条件: 预变性 94 ℃ 3 min; 变性 94 ℃
30 s，退火 50 ℃ 1 min，延伸 72 ℃ 1 min，29 个循环; 72 ℃ 延
伸 10 min。
1． 7 电泳与定量分析
取 10 μL PCR产物，在 1． 3%的琼脂糖凝胶中电泳检测。
使用 Quantity One 4． 6． 2 对电泳图进行定量分析。
2 结果与分析
2． 1 大丽花花瓣总 RNA的提取与分析
对提取的总 RNA进行琼脂糖凝胶电泳分析，可以看到清
晰的 28 S、18 S 2 条带( 图 1) ，测得各样品( Y1、Y2、Y3 和 Y4)
的 D260 nm /D280 nm比值分别为 2． 07、1． 84、1． 90 和 1． 78，提取的
总 RNA完整性和纯度符合后续试验的要求。
2． 2 大丽花花瓣 DpXTH和 18S rRNA部分片段的克隆
利用设计的 2 对引物分别进行 PCR 扩增，结果都得到了
与预期大小相符合的条带，而且未检测到非特异性条带( 图
2) 。测序结果显示 XTH片段长度为 352 bp，18S rRNA 片段长
度为 483 bp( Genbank登录号: JN863719) 。经 Blast 比对，确定
所克隆的片段为 DpXTH和 18S rRNA的部分序列( 数据略) 。
2． 3 大丽花花瓣 DpXTH基因的表达分析
2． 3． 1 最适循环数的确定 如图 3 和图 4 所示，DpXTH基因
和18 SrRNA基因在38个循环时进入平台期，为确保2种基
因同时进入指数扩增期，选择 29 个循环进行半定量 PCR。
2． 3． 2 大丽花不同时期花瓣 DpXTH 基因的半定量 RT －
PCR结果 为了避免同管扩增内参基因对 DpXTH 基因扩增
效果的影响，本研究采用异管扩增。使用 18S rRNA 基因对
各个时期的 cDNA模板量进行调整，扩增产物亮度一致后，以
相同模板量对 DpXTH 基因进行扩增。用 DpXTH 基因与 18S
—92—孙 悦等:大丽菊花瓣生长与衰老相关基因 DpXTH的表达分析
rRNA PCR扩增产物的电泳图光密度比值来表示 DpXTH基因
在不同时期的表达量变化。结果显示，花蕾期( Y0) DpXTH基
因几乎不表达，之后表达量迅速增加，盛花期( Y2) 达到最大，
衰败期( Y3) 的表达量又急剧下降( 图 5) 。
3 讨论与结论
XTH基因是一个多基因家族，其功能多样，参与植物的
多种生命活动，如细胞壁的松弛、植物组织的伸长、植物果实
的软化、次生维管组织的形成以及植物细胞程序化死亡
( PCD) 等［9 － 10］。此外，Yokoyama 等还揭示一些 XTH 基因不
只存在于细胞壁中，也存在于细胞板中，参与细胞分裂［11］。
有关花卉植物 XTH基因的研究结果显示，XTH 基因在花生长
发育过程中的功能不尽相同，如拟南芥中 AtXTH28 参与雄蕊
花丝发育［12］，月季中 RbXTH1 和 RbXTH2 参与花瓣的脱
落［13］，康乃馨中 DcXTH2 和 DcXTH3 参与花瓣的伸长和发
育［14］。为研究大丽花花瓣中 XTH基因的功能，本研究以 18S
rRNA基因片段为内参基因，利用半定量 RT － PCR 技术检测
了 DpXTH基因在大丽菊花瓣生长发育过程中的表达量变化。
研究结果显示，DpXTH 基因在大丽花现蕾期几乎不表
达，而在初花期和盛花期的表达量迅速增加，这与康乃馨、唐
菖蒲等花卉中一些 XTH 基因的表达模式相同［15 － 16］，表明
DpXTH基因与大丽花花瓣的早期生长密切相关。一般认为，
花瓣的早期生长主要是由于细胞的分裂，后期生长则与细胞
的膨大有关［17］，由此推测在大丽花花瓣后期生长过程中
DpXTH通过参与细胞壁重构，导致细胞膨大，引起花瓣的伸
长，而在花瓣生长的早期可能未参与细胞的分裂。其次，大丽
花 DpXTH的表达量在花瓣衰老时急剧下降，这与宫灯百合中
XET 酶活性［1］、康乃馨中半纤维素酶活性［18］的变化倾向一
致。业已清楚，在宫灯百合和康乃馨花瓣的衰老阶段木葡聚
糖发生大量降解［1，18］，推测大丽花花瓣衰老阶段也发生木葡
聚糖及细胞壁的降解，可能与前一阶段 DpXTH基因的大量表
达及其生物学功能有关。以上研究结果初步探明了大丽花花
瓣中 DpXTH基因的表达模式，揭示了其在大丽花花瓣发育过
程中的重要作用，为深入研究花器官生长发育的分子机制奠
定了基础。
参考文献:
［1］ODonoghue E M，Somerfield S D，Heyes J A． Organization of cell
walls in Sandersonia aurantiaca floral tissue［J］． Journal of Experi-
mental Botany，2002，53( 368) : 513 － 523．
［2］Yamada K，Takahashi R，Fujitani C，et al． Cell wall extensibility and
effect of cell － wall － loosening proteins during rose flower opening
［J］． Journal of the Japanese Society for Horticultural Science，2009，
78( 2) : 242 － 251．
［3］Doorn W G V，Woltering E J． Physiology and molecular biology of
petal senescence［J］． Journal of Experimental Botany，2008，59( 3 ) :
453 － 480．
［4］Liu Y B，Lu S M，Zhang J F，et al． A xyloglucan endotransglucosy-
lase /hydrolase involves in growth of primary root and alters the depo-
sition of cellulose in Arabidopsis［J］． Planta，2007，226 ( 6 ) : 1547
－ 1560．
［5］Lu W J，Nakano R，Kubo Y，et al． Cloning and expression analysis of
an XET cDNA in the peel and pulp of banana fruit ripening and sof-
tening［J］． Acta Botanica Sinica，2004，46( 3) : 355 － 362．
［6］杜丽萍． 胡杨木葡聚糖内转糖苷酶基因 PeXET 的克隆及功能分
析［D］． 北京:北京林业大学，2009．
［7］Percy A E，OBrien I E W，Jameson P E，et al． Xyloglucan endotrans-
glycosylase activity during fruit development and ripening of apple and
kiwifruit［J］． Physiologia Plantarum，1996，96( 1) : 43 － 50．
［8］李 莉． 拟南芥开花调控基因 EFS1 的功能研究［D］． 保定: 河北
农业大学生命科学学院，2009．
［9］Campbell P，Braam J． Xyloglucan endotransglycosylases: diversity of
genes，enzymes and potential wall － modifying functions［J］． Trends
Plant Science，1999，4( 9) : 361 － 366．
［10］李 伟，李 娜，陈晓阳． 团花树木葡聚糖转葡糖苷酶 cDNA 克
隆及序列分析［J］． 北京林业大学学报，2010，32( 5) : 45 － 49．
［11］Yokoyama R，Nishitani K． Endoxyloglucan transferase is localized both
in the cell plate and in the secretory pathway destined for the apoplast in
tobacco cells［J］． Plant Cell Physiol，2001，42( 3) :292 －300．
［12］Kurasawa K，Matsui A，Yokoyama R，et al． The AtXTH28 gene，a
xyloglucan endotransgl － ucosylase /hydrolase，is involved in automat-
ic self － pollination in Arabidopsis thaliana［J］． Plant and Cell Phys-
iology，2009，50( 2) : 413 － 422．
［13］Singh A P，Tripathi S K，Nath P，et al． Petal abscission in rose is as-
sociated with the differential expression of two ethylene － responsive
xyloglucan endotransglucosylase /hydrolase genes，RbXTH1，and
RbXTH2〗［J］． Journal of Experimental Botany． 2011，62 ( 14 ) :
5091 － 5103．
［14］Harada T，Torii Y，Morita S，et al． Cloning，characterization，and ex-
pression of xyloglucan endotransglucosylase /hydrolase and expansin
genes associated with petal growth and development during carnation
flower opening［J］． Journal of Experimental Botany，2011，62 ( 2 ) :
815 － 823．
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［15］Harada T，Torii Y，Morita S，et al． Differential expression of genes i-
dentified by suppression subtractive hybridization in petals of open-
ing carnation flowers［J］． Journal of Experimental Botany，2010，61
( 9) : 2345 － 2354．
［16］Doorn W G V，Balk P A，Houwelingen A M V，et al． Gene expres-
sion during anthesis and senescence in Iris flowers［J］． Plant Molec-
ular Biology，2003，53( 6) : 845 － 863．
［17］Reale L，Porceddu A，Lanfaloni L，et al． Patterns of cell division and
expansion in developing petals of Petunia hybrida［J］． Sex Plant Re-
prod，2002，15: 123 － 132．
［18］de Vetten N C，Huber D J，Gross K C． Endoglycanase － catalyzed
degradation of hemicelluloses during development of carnation ( Di-
anthus caryophyllus L． ) petals［J］． Plant Physiol，1991，95 ( 3 ) :
853 － 860．
朱艳霞，邱业先，钱 玮． 一种适用于太湖底泥基因组 DNA的提取方法［J］． 江苏农业科学，2012，40( 7) : 31 － 33．
一种适用于太湖底泥基因组 DNA的提取方法
朱艳霞1，邱业先2，钱 玮2
( 1．苏州科技学院环境科学与工程学院，江苏苏州 215011; 2．苏州科技学院化学与生物工程学院，江苏苏州 215009)
摘要: 采用 6 种方法对太湖底泥基因组 DNA进行提取，利用琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度计测定和 PCR 扩增
效果等反映 DNA纯度和质量的指标，综合分析不同提取方法的优劣。结果显示，在提取过程中使用溶菌酶优于使用
蛋白酶，冻融和 TENP前处理过程耗时且效果不佳，二次沉淀在提高 DNA 纯度中起关键作用。结果表明，溶菌酶 －
SDS －二次沉淀法是一种适用于太湖底泥基因组 DNA 的提取方法，提取的 DNA 质量好、纯度高，更胜于包括土壤
DNA快速抽提试剂盒在内的其他 5 种方法，可直接用于对 DNA质量要求较高的后续试验中。
关键词: 太湖底泥; 基因组 DNA; 提取方法
中图分类号: S181 文献标志码: A 文章编号: 1002 － 1302( 2012) 07 － 0031 － 03
收稿日期: 2011 － 12 － 06
作者简介:朱艳霞( 1987—) ，女，江苏苏州人，硕士研究生，主要研究
方向为水污染控制。E － mail: zhuyx@ 163． com。
通信作者:邱业先，男，教授，博士生导师，主要研究方向为生物材料。
E － mail: qyx542@ mail． usts． edu． cn。
太湖位于江苏省、长江三角洲南部，是我国第二大淡水
湖。从 20 世纪末开始，太湖北部梅梁湾地区频繁发生蓝藻暴
发，使太湖成为了我国最大的存在富营养化问题的湖泊［1］。
湖泊生境中营养物质的循环主要受到表层沉积物中微生物代
谢活动的影响［2］，微生物的生存及生命活动决定着水生生物
链基本环节的发展。因此，加强沉积物中微生物多样性研究
对于阐明微生物群落与其生境的关系，揭示群落结构与功能
的联系，进而指导微生物群落功能的定向调控具有重要的现
实意义。
传统的分离培养微生物的方法是湖泊微生物多样性研究
最早运用的方法，但是，能够在培养基上生长的细菌仅占不到
环境微生物总量的 1%。近 10 年来日益成熟的分子生物学
技术突破了传统技术手段的局限，给太湖底泥微生物研究带
来了新的希望。建立高效可靠的太湖底泥微生物总 DNA 提
取方法，是进行微生物分子生态学研究的基础。近年来有关
从土壤［3］、水体［4］、海洋沉积物［5］、活性污泥［6］中提取 DNA
的方法已得到了较好的发展，但从湖泊底泥中提取 DNA的方
法较少。随着太湖底泥微生物研究的逐步深入，太湖底泥微
生物 DNA的提取和研究也逐渐引起了人们的关注。如申慧
彦等从太湖北部梅梁湾表层沉积物样品中直接提取到基因组
DNA，并对微囊球藻的 16S rRNA基因进行 PCR扩增［7］;陈楠
等以藻华暴发期的太湖不同区域沉积物为对象，通过末端限
制性酶切片段长度多态性( T － RFLP) 的分子生态学手段，分
析沉积物中细菌群落结构差异［1］。赵兴青等对玄武湖、莫愁
湖和太湖不同位置的表层沉积物 DNA进行提取，并采用 PCR
－ DGGE技术比较不同微生物群落结构特征［8］。
本研究在前人研究工作的基础上，对 6 种太湖底泥微生
物总 DNA提取方法进行了比较，找到了一种适合太湖底泥基
因组 DNA的提取方法，以期为进一步通过分子生物学手段对
太湖底泥微生物的研究提供借鉴和参考。
1 材料与方法
1． 1 试验材料
1． 1． 1 样品 DNA提取材料的采样时间是 2011 年 4 月，采
样地点位于太湖竺山湖( 31°2855N，120°0494E) 。利用沉
积物柱状采样器，采集 0 ～ 20 cm 深度底泥样品，采集后冷藏
带回实验室，于 － 20 ℃冰箱保存。测定其理化性: 平均含水
率 39． 37%，干土平均有机质、总氮、总磷含量分别为 15． 53、
1． 89、2． 08 mg /g。
1． 1． 2 主要仪器 高速冷冻离心机( 飞鸽 GL － 20G －Ⅱ) ;
小型台式高速离心机( eppendorf 5417R) ; 电泳仪( 六一 DYY
－2C) ，凝胶成像分析系统 ( 捷达 801 ) ; PCR 扩增仪 ( eppen-
dorf AG5332 ) ; 全 波 长 紫 外 分 光 光 度 计 ( 热 电
NanoDrop2000) 。
1． 1． 3 主要试剂 DNA 提取液 ( pH 值 = 8． 0 ) : 0． 1 mol /L
Tris － HCl，0． 1 mol /L EDTA，0． 1 mol /L 磷酸钠，1． 5 mol /L
NaCl，1% CTAB; PBS 缓冲液 ( pH 值 = 7． 2 ) : 135 mmol /L
—13—江苏农业科学 2012 年第 40 卷第 7 期