全 文 ：SCIENCE & RESEARCH
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科学
研究
2015·5
收稿日期 ：2014-12-06
通讯作者 ：侯玉霞（1963-），女，教授，主要从事毒理学研究。
密毛白莲蒿富集铅的分子机制
崔兆庆1，龚玉新1，侯玉霞2
（1.清华大学附属中学，北京  100084；2.中国农业大学理学院，北京  100193） 
中图分类号：S823.4 文献标识码：A 文章编号：1004-4264（2015）05-0001-04
摘 要：本研究以一种可作为牧草的植物——密毛白莲蒿为试验对象，通过添加不同浓度硝酸铅进行铅胁
迫，用q-PCR测定相关样品在富集铅过程中的基因表达变化。结果表明，密毛白莲蒿根部和茎叶部组织中存
在的YS3、MT基因与铅富集相关，YS3、MT基因的表达受铅胁迫诱导而上调，茎叶部组织中MT基因上调表
达量显著高于根部组织（P<0.05），根部组织YS3基因上调表达量比茎叶部组织高2.5倍。该研究为进一步明
确牧草铅富集的分子机制，提高我国乳品安全水平提供了重要的理论依据。
关键词：密毛白莲蒿；铅；基因表达
随着我国工业化和城市化进程的提速，重金属污染
日益严重，铅污染目前已成为我国最主要的重金属污染
源之一。铅污染主要表现为农田和水体（饮用、灌溉）
铅含量严重超标，除导致农作物生长受阻、产量下降或
个体死亡外，还能经食物链传递，对人体造成严重伤
害。土壤或水体中的铅移动性差、滞留时间长、不能被
微生物降解，但可经水、植物等介质传递并积聚在食物
链顶端的人体中，影响人类健康并导致严重的公共卫生
事件和群体性事件。单单2011年1~8月我国就发生11起
重金属污染事件，其中9起为血铅事件。因此亟需开展
关于牧草铅富集的相关研究。
密毛白莲蒿（Artemisia. sacrorum.Ledeb.. var..
messerschmidtiana.(Bess.).Y..R..Ling）是菊科蒿属的
一种半灌木状草本，根状茎粗壮，可作牧草。2010年内
蒙古农业大学的罗于洋等用盆栽试验证明：密毛白莲蒿
地上部和根系对最大铅积累量分别为2.857.86mg/kg和
294.17mg/kg，根部对铅的富集系数最大为0.14[1]。然
而密毛白莲蒿对铅富集的相关机制研究基本处于空白状
态。为了能明确密毛白莲蒿富集铅的机理，本研究重点
评价铅胁迫下密毛白莲蒿的相关基因表达量变化。
1 材料与方法
1.1  试验材料
密毛白莲蒿HE生态型采自内蒙古白音诺尔铅锌矿
区，其种子由国科大邱枫副教授赠予。
主要试剂：cDNAⅠ链合成试剂盒、Taq酶、
dNTP、琼脂糖、DNAase（Promega公司）；总RNA提
取试剂盒(TRIzol法)（Invitrogen公司）；SYBR®.Premix.
DimerEraserTM.(Perfect.Real.Time).（Takara公司）。
仪器设备：贺利氏Biofuge.Stratos型台式高速冷
冻离心机；沙多利斯万分之一天平；美国NanoDrop公
司ND-1000型全波长分光光度计；美国bio-rad公司
的荧光定量PCR. iQ5和梯度PCR；英国Syngene公司.
GBOX-HR-E-M型全自动凝胶成像系统；丹麦Het0公
司真空冷冻干燥机；日本三洋公司的高压灭菌锅、超低温
冰箱和制冰机；国产可控环境生长箱；北京六一仪器厂的
水平电泳槽和电泳仪；德国Eppendorf公司的移液器。
1.2  试验方法
1.2.1. 供试密毛白莲蒿样品的制备
液培：密毛白莲蒿种子，4℃冷藏15d，30℃浸泡
12h，去除漂浮水面的种子。沉水种子控干水分。超
净台上0.1%高锰酸钾处理5~10min，无菌水洗1次，
4%次氯酸钠浸泡10min，无菌水洗3~4次。处理后的
种子转入MS培养基，光照培养箱无菌培养育苗。培
养条件：温度：25℃(白天)/20℃(晚上)；相对湿度：
70%~75%；光照周期：14h/10h（光/暗）；光照强
度：1500lx。4叶期后转入1/2.Hoagland营养液通气培
养（培养条件同液培），培养液每4天更换1次，4周后
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进行铅胁迫处理。
铅胁迫处理：共进行3种胁迫处理，每种胁迫处理
设3个重复。3种胁迫分别为1/2.Hoagland营养液（磷酸
二氢钾浓度为5μmol/L）中加入硝酸铅，至铅离子浓度
分别为200μmol/L、400μmol/L、800μmol/L，以不含
铅离子的1/2.Hoagland（磷酸二氢钾浓度为5μmol/L）
营养液为对照。将培养好的密毛白莲蒿幼苗分别转移至
各种处理液中，同液培条件培养。
供试样品收集：分别在胁迫1h、6h、12h、24h
时，收取各浓度铅胁迫处理和对照的密毛白莲蒿样品。
所取样品分根和叶片分置于自封袋，-80℃保存，用于
酶活性测定和q-PCR。
1.2.2. 密毛白莲蒿抗氧化酶提取和活性测定
1.2.2.1. 酶液提取
取0.5g样品加5mL4℃预冷的0.05mo1/L.pH.7.8的
磷酸缓冲液(含1%PVP，0.1%Triton.X-100，0.1mmol/L.
EDTA)，冰浴研磨，4℃.12.000g离心10min，取上清液
即为粗酶液，用于蛋白浓度和各种酶活性测定。
1.2.2.2. 酶活测定
蛋白浓度测定采用考马斯亮兰法进行[2]；SOD活性
测定采用NBT（氮蓝四唑）法进行[3]；CAT活性测定采
用高锰酸钾滴定法进行[4]；POD活性测定采用愈创木酚
法进行[5]；GR活性测定采用NADPH比色法进行[6]；APX
活性测定采用ASA氧化法进行[7]。
1.2.3. 密毛白莲蒿MT、YS3基因转录的q-PCR分析
1.2.3.1. 密毛白莲蒿总RNA的提取
取未经胁迫的鲜嫩密毛白莲蒿整株样品0.5g，
用无菌水冲洗3遍，滤纸吸干表面水分，放入预处理
研钵中，液氮下快速研磨至细小粉末；将粉末迅速转
入1.5mLEP管中，加入1mL.Trizol，充分悬浮后室温
放置5min；加入200μL氯仿，剧烈振荡15s，室温静
置5min；4℃，12.000r/min离心15min，取上清，加
入等体积的异丙醇，充分混匀，-70℃放置10min；
4℃，12. 000r/min离心15min，弃上清。沉淀中加入
1mL.75%的乙醇，离心弃上清，沉淀真空干燥后加入
30μLDEPC水溶解；1.2％的琼脂糖凝胶进行电泳检测
RNA。
1.2.3.2. 引物序列
密毛白莲蒿MT、YS3基因及内标β-actin的三对特
异性引物由国科大邱枫副教授赠予，产物理论片段长度
分别为108bp、102bp、111bp，具体引物序列为：
YS3-F:...5..GGACTCTGCGACACGTCATTC......3.
YS3-R:...5..ATC.ATATGGCTTTGCGGCAGG.......3..
MT-F:....5..TGTGGCGATAACTGCAGTTGC..... 3
MT-R:....5..GCAGGTGCAGGGAATCACAGTTG..3..
ACT-F:..5..TGAGGCACCCTTGAATCCCA........3
ACT-R:...5..CACACCATCACCAGAGTCCAGC......3.
1.2.3.3. 密毛白莲蒿YS3、MT基因对铅胁迫相应的定
量分析
分别提取浓度为0μmol/L（对照样品）、200μmol/L、
400μmol/L、800μmol/L经铅胁迫处理1h、6h、12h、
24h的密毛白莲蒿（3个重复处理样品的混合材料）根
（地下部组织）、叶茎（地上部组织）的RNA。
每个除DNA的RNA样品分别取等量RNA，各自以
YS3-R、MT-R和ACT-R为引物进行RT合成各基因片
段相应的cDNAⅠ链，以特定的cDNAⅠ链为模板，
相应的YS3-F和YS3-R、MT-F和MT-R、ACT-F和
ACT-R为引物经q-PCR扩增，以ACT-F和ACT-R扩增
为内标，获得YS3、MT基因的相对表达量。
2 结果与讨论
2.1  引物特异性分析
2.1.1. 密毛白莲蒿总RNA提取
用Trizol方法提取了密毛白莲蒿整个植株的RNA，
结果如图1所示。

图1 密毛白莲蒿RNA（1.2%变性胶）
从图1可以看出，试验所提取的密毛白莲蒿RNA样
品中，基本无DNA残留，18Sr和28SrRNA条带清晰完
整，28S与18S亮度比约为2:1，可用于后续试验。
2.1.2. RT-PCR检测引物特异性
密毛白莲蒿RNA去除DNA后经Oligo. (dT)反转
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cDNA，用设计的MT、YS3基因正反向引物和β-actin
正反向引物进行PCR扩增，扩增产物经1.5%琼脂糖胶
电泳检测，图2结果显示产物大小与理论长度一致，结
果表明，试验设计中MT、YS3、β-actin的引物可有效
扩增出MT、YS3、β-actin的基因片段，并且有很好的
特异性，因此该三对引物可用于q-PCR。
200bp
100bp

图2 密毛白莲蒿MT、YS3和β-actin基因片段的RT-PCR
M.Marker； 1.β-actin； 2.MT ； 3.YS3
2.2  响应铅胁迫的密毛白莲蒿MT、YS3基因表达
差异
2.2.1. 密毛白莲蒿根和茎叶部组织RNA提取
用Trizol方法分别提取了不同浓度硝酸铅胁迫不同
时间的密毛白莲蒿和对照密毛白莲蒿根部和茎叶部组织
的RNA，结果如图3、4所示。
图3 密毛白莲蒿根部组织RNA
1~4.未经胁迫的1、6、12、24h对照样品；5~8.200μmol/L硝酸铅胁迫
1、6、12、24h样品；9~12.400μmol/L硝酸铅胁迫1、6、12、24h样品；
13~16.800μmol/L硝酸铅胁迫1、6、12、24h样品
.
图4 密毛白莲蒿茎叶部组织RNA
1~4.未经胁迫的1、6、12、24h对照样品；5~8：200μmol/L硝酸铅胁
迫1、6、12、24h样品；9~12.400μM硝酸铅胁迫1、6、12、24h样品；
13~16.800μmol/L硝酸铅胁迫1、6、12、24h样品
图3、4结果表明：不同浓度硝酸铅胁迫不同时间
及相对应的对照密毛白莲蒿样品中，根部和茎叶部组
织中提取的RNA中，28S.rRNA与18S.rRNA条带清晰、
完整，条带下方无弥散、点样孔干净，说明RNA基本
无降解、无蛋白残留。在进行基因组消化后，可用于
q-PCR定量分析。
2.2.2. 密毛白莲蒿MT、YS3基因对铅胁迫的响应
将2.2.1中所提各RNA样品经DNAaseⅠ消化后，
根据电泳结果，调整相关样品浓度。分别以YS3-R、
MT-R和ACT-R为引物，cDNA第一链合成试剂盒合
成MT、YS3和β-actin基因片段的. cDNA，分别以
YS3-F、YS3-R，MT-F、MT-R和ACT-F、ACT-R为
引物对，用SYBR®试剂盒进行q-PCR。以β-actin基因
表达量为内标，获得各样品中MT、YS3基因的相对表达
量，结果如图5~6所示。
.
.....................a........................................b
图5 密毛白莲蒿根部组织YS3、MT基因表达对铅胁迫的响应
a.MT基因; b.YS3基因。
Pb0.未经胁迫对照样品；Pb200. 200μmol/L浓度硝酸铅胁迫样品;Pb400.
400μmol/L浓度硝酸铅胁迫样品；Pb800. 800μmol/L浓度硝酸铅胁迫样
品，下图同。
a b
图6 密毛白莲蒿茎叶部组织YS3、MT基因表达对铅胁迫的响应
图中结果表明：（1）密毛白莲蒿根部和茎叶部
组织都存在YS3、MT基因；（2）YS3、MT基因受铅
胁迫诱导表达上调，胁迫浓度越大表达上调量越高，
与非胁迫对照相比，MT基因根部表达最高可上调6倍
以上（800μmol/L胁迫24h）、茎叶部可上调6.5倍以
上（800μmol/L胁迫24h）；YS3基因根部表达上调6
倍以上（800μmol/L胁迫6h）、茎叶部表达上调近4
倍（800μmol/L胁迫24h）；（3）YS3、MT基因上调
表达量与胁迫时间相关，根部和茎叶部MT基因及茎叶
组织的YS3基因在研究的所有胁迫浓度下均随胁迫时
间延长而表达上调量增加；根部YS3基因在胁迫浓度
为200μmol/L和400μmol/L时，表达量在胁迫12h达到
最大，800μmol/L胁迫时表达量在胁迫6h达到最大；
（4）根组织中YS3基因受胁迫诱导，表达上调值高于
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Molecular Mechanism of Accumulation of Lead by Artemisia Sacrorum
Ledeb. var. messerschmidtiana (Bess.) Y. R. Ling
CUI Zhao-qing1, GONG Yu-xin1, HOU Yu-xia2
(1. The High School Attached to Tsinghua University, Beijing 100084;
2. College of Science,China Agricultural University, Beijing 100193)
Abstract: In this study, Artemisia sacrorum Ledeb. var. messerschmidtiana (Bess.) Y. R. Ling, a forage grass, was
chosen as experimental object. When different concentrations of lead was added, the gene expression changes were
determined by q-PCR. The results showed that the gene relating with lead accumulation existed in root, stem and
leaf tissues. MT expression in stem and leaf tissue was significantly higher than that in root tissue (P < 0.05). YS3
expression in root tissue was 2.5 times higher than that in leaf and stem tissues. The finding provides an important
theoretical basis to improve the safety of Chinas dairy products.
Key words: Artemisia sacrorum Ledeb. var. messerschmidtiana (Bess.) Y. R. Ling; Lead; Gene expression
茎叶组织；而MT基因受胁迫诱导，茎叶组织中表达上
调值高于根部组织。为了更好的说明胁迫诱导YS3、MT
基因上调表达在根部和茎叶组织中的差异，将同一胁迫
浓度和同一胁迫时间下的茎叶和根部组织中YS3、MT基
因表达量进行了比较，结果如图7所示。
.
MT
基
因
的
表
达
（
茎
叶
/根
）
YS
3基
因
的
表
达
（
根
/茎
叶
）
时间（h） 时间（h）
a b
图7 铅胁迫诱导密毛白莲蒿茎叶部和根部组织YS3、MT基因上调
表达量比值
a. MT基因茎叶部/根部; b.YS3基因根部/茎叶部
图7结果表明在整个胁迫周期中，铅胁迫诱导茎叶
部MT基因上调表达量大于对根部MT基因的诱导表达，
在胁迫12h茎叶部MT基因上调表达量与根部MT基因上
调表达量比值达到最大，前者为后者的1.5倍以上；铅
胁迫诱导根部YS3基因上调表达量大于对茎叶部MT基因
的诱导表达，在胁迫6h根部.YS3基因上调表达量与茎叶
部YS3基因上调表达量比值达到最大，前者为后者的2.5
倍以上。这一结果表明基因表达量与铅协迫程度有正相
关关系，提示我们可以通过基因表达量的测定反映出牧
草对铅富集的程度。
3 结论
密毛白莲蒿根部和茎叶部组织中存在YS3、MT基
因；YS3、MT基因的表达受铅胁迫诱导而上调，胁迫
浓度越大，上调表达量越高；铅胁迫时，茎叶部组织中
MT基因上调表达量高于根部组织1.5倍以上；根部组织
YS3基因上调表达量高于茎叶部组织2.5倍以上。这一结
果提示我们可以通过基因表达量的检测来评价牧草密毛
白莲蒿对铅的富集程度。
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