全 文 ：分子植物育种 , 20 04 年 ,第 2 卷 , 第 3 期 , 第 35 8一 3 64 页
M o l e c u l ar Plant B er
e d in g
,
2 004
,
V o l Z
,
N o
.
3
,
3 5 8一 3 64
研究报告
R E S EA R C H R卫P O R T
利用 G at e w ay 克隆技术大规模克隆拟南芥转录因子
梅文倩 宋文强 潘怡 巩威 朱玉贤 ’
北京大学蛋白质工程及植物基因工程国家重点实验室 , 北京 , 10 0 8 71
* 通讯作者 ,由 u yx @ w a t e l , .p ku ,ed 认切
摘要
随着越来越多基因组全序列的测定完成 , 基因组的研究进入了功能研究阶段 。 功能基因组的研究需要
把大量基因连入不同载体 , 传统的酶切连接构建载体的方法不能满足这种大规模克隆的需要 。 G at e w ay 技
术是一种高效的大规模克隆系统 , 而且对载体和宿主没有依赖性 。 本文利用 G at e w ay 大规模克隆技术将 16
个拟南芥转录因子的 O RF 克隆入植物表达载 p P T v 和酵母表达载体 pY T v 中 , 酵母融合表达实验和 we st -
em
一
bl ot 检测证明了该克隆途径的可行性 , 并且得到的 iH s 一aT g 融合蛋白 , 为拟南芥转录因子的大规模蛋白
质组学研究奠定了良好的基础 , 同时基因序列的聚类分析为将来进一步的功能研究提供了有利信息 。
关键词
克隆技术 , 转录因子 , We s t e rn 七 lot , 聚类分析
H ihg T hr o u g hP ut C lo n in g o f A l ’a ib d op is T r an s c r iPt i o n F a e t o r s U s in g
G at e w ay C l
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o n g w e n q i a n g P an y i G
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, 由 u 岁@ w a ter 卫ku 启 du · cn
A B S T RA C T
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M o s t o f ht e m w e r e e xP
r e s s e d e o r e e t ly i n ye a s t
b y w e st 的 b l o t d e t e e t i o n , w h l c h s ho w s G aet w ay e l o n in g t e e bn o l o灯 15 e fe e t iv e i n h ihg 一htr ou gh Put c lo n in g . T h e
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K E Y WO R D S
G at e w ay
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利用 G t ae wy a克隆技术
H i gT h hro u g l
lP ut C lo n in go A f
王’ a bid口 P si T s e r a l liP rt io n F ae t o s rU s in g
大规模克隆拟南芥转录因子
G t ae wy aC lon i
n
随着越来越多的动植物基因组全序列被测定 ,
前所未有的编码基因 (开放阅读框 ) 被识别 , 但是
目前绝大部分基因的功能还不清楚 。 要阐明这些基
因的功能 , 就必须把不同的开放读码框连入各种载
体 , 进行蛋白表达 , 抗体制备 , 寄主细胞转化和表型
分析 , 细胞内定位 , 以及 目的蛋 白与其他分子 的相
互作用等后续的研究 。 传统的酶切连接的方法不能
满足大规模克隆的需要 。 只有高效的 、对载体和寄
主没有依赖性的克隆系统 , 才能完成这项繁杂的工
作 。 G at e w ay 克隆技术就是一个高效的大规模克隆
系统 , 由 hiv itr o g en 公司开发
。 该技术利用 人 噬菌
体的位点特异性重组 ( 人 噬菌体用此重组系统进
行裂解途径和溶原途径之间的互相转换 ) , 实现了
不需要传统酶切连接过程的基因快速克隆和载体
间平行转移 , 同时还保持正确的 ORF 和方向 。
人 噬菌体是一种中等大小的噬菌体 , 由蛋白质
外壳和双链 D N A 分子组成 。 它是 以大肠杆菌为宿
主的一种温和噬菌体 , 是细菌病毒 。 人 噬菌体进入
大肠杆菌以后 , 将其基因组整合到细菌染色体上 ,
成为细菌基因组的一部分 , 随细菌的复制而复制 。
在某种情况下 , 整合的噬菌体基因组脱离细菌染色
体进行 自我复制 , 最终导致宿主菌的裂解 , 释放大
量噬菌体后代 。 在 人 噬菌体的生活史中 , 整合与脱
离的过程就是保守的位点特异性重组 。 这个重组过
程不同与同源重组或转座 , 它具有更高的特异性 ,
而且特异 D N A 链的切割和重接过程中没有 D N A
的合成 。
位点特异性重组 反应分两大类 , R es ol va se 一 nI -
ve rt as e fa m l y 和 ntI l乞1l l i ly 。 人 噬菌体的特异性重组
属于 hit fa n l i fy , 其特点是形成 DN A 与酪氨酸的共
价中间物 。 人 噬菌体的重组系统包括 4 个重组位点
和 4 种蛋 白 。 人 噬菌体编码的整合酶 ( hit e gr as e,
iht ) 负责切割和重接 D N A 链 , 帮助 D N A 链的交
换 ; X IS 是位点特异性重组反应特有的 , 跟切割有
关 , 在 IH F (ntI e r g r a t i o n H o s t F a e t o r) 和 hit 存在的情
况下 , 介导 at R 和 a t t L 间的重组 。 另两种蛋 白是宿
主编码的 , IH F 参与切割和重接反应 ; IF S 在特殊的
J清况下提高切割反应的效率 。 特异 的重组位点包括
噬菌体上的 a t t p ( P o P , ) 和宿主菌上的 a t tB (B o B , ) ,
整合反应发生在这两个位点之间 , 形成整合的原噬
菌体 , 并且它两端的边界序列是 at L (B 0 P’ )和 a t tR
(P o B’ ) 。 在 a tL 和 a tR 之间的精确的重组又重新生
成噬菌体上 的 at tP 位点和宿主菌上的 a t tB 位点
(L
a n即 , 19 8 9 ) 。
G at e w ay 克隆技术主要 由三大反应组成 : TO P O
反应 、 L R 反应和 B P 反应 。
通过 T O P O 反应将 目的基因的 P C R 产物连入
nE ytr 载体 。 T O PO 反应中 E n ytr 载体的特异序列
C C C T T 被拓扑异构酶 ( T o p o i s o m e r a s e ) 所识别并
切开 , 酶通过 2 74 位的酪氨酸与切 口处 的磷酸基形
成共价键 , 从而偶联在载体上 。 当加入 P C R 产物时 ,
形成 的 3 ’ 突出端 G T G G , 攻击 P C R 产物序列 , 与接
头序列 C A C C 退火 , 去掉多余的接头序列 G T G G ,
将 P c R 产物以正确方向连入载体 (图 l) 。
L R 反应用于将目的基因从 E n ytr 载体重组入
D e s t in at i o n 载体 , 反应 由 h t , IH F 和 x i s 酶混合物催
化 。 E n t yr 载体上基因两端具有 at L I 和 at ZL 位点 ,
D es it n iat on 载体上含有 at tR I 和 a t tRZ 位点 , 在重组
蛋 白的作用下发生定向重组 , 形成新的位点 a t tB I
和 at tB 2, 将 目的基因转移到 D se t ian it o n 载体中 。 LR
反应完成后筛选正确的克隆的机制是 : En ytr 质粒
上带有卡那抗性 ( K n 1 P ) , 而 D es t in at io n 质粒带有氨
节青霉素抗性 (却“ ) , 正确的目的质粒应该带有氨
节青霉素抗性 ( AP “ ) 。 D es it n at i o n 质粒上带有 c dB
基因 ( B e rn a r d an d C o u ut r i e r , 1 9 9 2 ) 阻碍大肠杆菌
图 1 T O P O 反应原理
注 : T F表示拟南芥转录因子基因
F lg
l l r e 1 T h e P血e iP le o f T O P O r e ac t i o n
N o et : T F er P er s e nt s tr an s e ir P t io n fa e to
r g e n e o f A I ’a b id op is
分子植物育种
Mo le e u l ar Plnt a Be r
e n g i d
的生长 , 只有发生重组被目的基因片段替换掉后 ,
才可以使宿主菌不受影响 。
B P反应用于将目的基因从 D es it n iat on 载体或
PcR 产物重组入 E n仰载体 , 基本过程与 LR 反应
相似 , 但是特异性重组位点分别为 a t tB 和 a t p 。 在
获得目的基因的 P C R 片段时 , P C R 的 夕引物末端
加入 a t tB I 位点 ( 2 5b a s e+4 G ) , 3 , 末端加入 a t B Z ,
这种平末端 P C R 产物与含有 a tt P 位点的载体一起
存在时 , 在重组蛋白催化下 , 生成含有 目的基因的
E n tyr 质粒 。 但将外源基因的 P CR 片段克隆入 E n t r y
质粒 B P 反应不如 T O P o 反应更优化 。 (图 2)
据 hi vi tr o g e n 公司网站上的统计 (
~
.
ivin tr
o -
g en
.
co m )
, 从 2 00 年到 2 0 03 年 , 在世界一流刊物
如 S e ien e e , 协加 r e G e en t i e s , Na uetr M e d , 用 C ,
PN A s
,
M B c 等中有 54 篇文章使用 G at e w a y 克隆
技术 。 W a l h o ut 等人在 2 0 0 0 年发表在 sc ien ce 上的
rP
o t e i n i n衍 at i o n m a P P ign i n C . el 电脚 n s u s ign P r o et in s
ivon vl ed in vul va l d
e v e l叩m e in 中使用 G at e w a 克隆
技术 , 用来在酵母双杂交系统中进行蛋白相互作用
的研究 。 R u d o lP h 等人 ( 2 0 0 3 ) 发表在 PN A S 上的
p eP it d e
一
m e d iaet d b
r o a d
一
sP e c t r u m p lant er
s l s t a n c e t o
ot sP o vi ur se s 中使用了 G a t e w a y 系统中的 TOP O 反
应构建了 E n t刁质粒 。 G r a n d 一eP r ct 等人在 2 0 01 年
的 N at . M e d . 中的 s c A P l i g a l l d s aer p ot e in n ew
iln 记一 fo w e irn g d ur g s 中用 G at e w ay 克隆技术克隆目
的基因 。 这些数据证明 G at e w ay 克隆技术已经广泛
应用于各种研究工作 。
本实验室在拟南芥转录因子的大规模克隆和
表达鉴定这一项 目中 , 使用 G a t e w ay 克隆技术 。 本
文以 16 个转录因子为例说明 aG et w a y 克隆技术流
程并对这些转录因子进行 w es et m bl ot 鉴定和蛋白
序列聚类分析 。
1 材料与方法
1
.
1 实验材料
拟南芥 : 哥伦比亚野生型拟南芥 ( ` A」习 ib d叩is
ht a ila n a) 植株 。
试剂 : R N A 提取试剂盒 NR ea sy p lant m in ik t 购于 QIA GNE 公司 , RT 一Pc R 试剂盒 、 P ENT R D ier c -
it on
a l T o P O e lo n i n g 试剂盒 、 G aet w盯皿 r e a e t i o n 试
剂盒均购于 hiv iotr ge n 公司 , D N A 胶回收试剂盒购
于 C L O N TE C H 公司 , 质粒提取试剂盒购于 P r o n l a -
ga 公司 , T aq D NA p ol ytn er as e 购于鼎 国公司 , D N A
op l帅 er as e P fu 购于上海生工 , dN T P 购于 T a k a r a 公
司 , 内切酶 A S c l 、 SA C n 购于 iB ol ab 公司 , W e st -
e扭 bl ot 所用抗体 , 一抗购于 R& D 公司 , 二抗购于
orP m
e
ga 公司 。 其它试剂为国产分析纯 , 购于北京地
区化学试剂商店 。
引物合成及 DN A 序列测定由上海博亚公司完成 。
1
.
2 实验方法
1 2
.
1拟南芥 R N A 的提取
按 QIA G EN R N e a sy lP ant M in 称 的程序进行 。
RT
一
Pc R
: 按 hiv iotr g en 公司 RT
一
P c R 试剂盒程序进
行 。
1
.
.2 2 目的基因的获得和克隆载体的构建
用 p E N T R D ier e t io an l T o p o C l o n in g 兀 t s 进行
黔瞥- a t 日I G住N E a t 8 2. .拼榷翻{ 二二二二』考阶~ po e s t l n at io n一 G o N :
De st in a t io n
V e tC o r 月瞬黔 . . . . 刁. . 沸豺卜 B y一户or d u以
P D e s t jn a t io n
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G EN E o r P C R
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c士。 r ,魂鳃曰. . . 卜. . 卜锄黔 叫少曝书. . . 书. 卜瓢粼产 B y 一p ro d u Ct
a t P I C m R c c d B a t P Z at R I C m
尺 c浏B 日t R Z
图 Z LR 反应和 B P 反应原理
F ig u r e 2 T h e P irn
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利用G ate wy a克隆技术
C lon l l l goA r a fb记 o p s扮 T rn ae s r1 Ptin oF cato rsU sin g
大规模克隆拟南芥转录因子
G t ae wy aC l
n o
n i gT
e eh n o loy g
目的片段的克隆 。 根据数据库 M I P S中公布的拟南
芥 O盯 序列 , 设计 目的基因两端引物 。 在基因 夕 引
物端加入 e nt yr ve ct or 定向序列 以及表达增强序列
c A c c A c A A A
。 以 p fu 从拟南芥 c D N A 中扩增得到
目的片段的平末端产物 。 回收片段经电泳定量后 ,
按 P c R 产物 : T o Po ve ct or 为 :5 1 的比例 , 按 p E N -
T R D i r e e t i o n a l T o P o e l o n in g 儿 t s 的程 序 进 行
T O PO 反应 。 TO P O 反应得到的阳性克隆 , 用载体上
的通用 引物和基因特异性引物进行 P C R 筛选并进
行测序 。
2一3m in ,重复 4 次 , 离心取上清 ;重复裂解酵母 1 次 ,
合并上清 , 进行 SD S ~ P A G E 。 电泳后 , 用电转移法将
蛋白转移至硝酸纤维素膜上 。 膜于含 5%脱脂奶粉的
P B S T 中封闭过夜 , 用含 .2 5%脱脂奶粉的 P B S T 将
抗 iH s 一T ag 的抗体稀释至终浓度为 l p 留m l , 37 ℃反
应 Zh , PB S T 洗涤 3 只 10m i n 。 用含 2 . 5%脱脂奶粉的
P B S T 将 H R P 标记的抗鼠的二抗稀适合倍数 , 37 ℃
反应 l h , PB S T 洗涤 3 x 1 0m i n , 以 D A B 为底物进行
显色反应 , 最后用 d dH ZO 终止反应 。
1
.
2
.
3 目的基因在表达载体中的克隆
将测序正确的克隆提取质粒 , 电泳定量后 , 按
G at ew ay LR lC on as
e E n yZ m e M ix 的程序与酵母表
达载体 p P TV , p Y T V 进行反应 , 反应结束后 , 将反应
产物转化 D H S Q 感受态 。 酶切鉴定阳性克隆 。
2
.
4 转录因子在酵母中的表达
A
. 酵母转化 : L认 c 转化法 , 参见 《分子克隆实
验指南》
B
. 酵母表达 : 阳性克隆转接于 1 . 5m l SC ~ U RA
液体培养基中 (含 2% 葡萄糖 ) , 30 ℃ , 280 r/ m in 培
养 24 h , O D 值达到 .4 0 时 , 1: 50 转接入含 2%棉子糖
( ar if n o s e ) 的 s e 一U RA 中 , 3 0 0C 培养约 1 6 h , 当 o D
达到 0 . 6一 1 . 0 时 , 加入 4 0% 半乳糖 ( g al a e t o s e ) 至终
浓度为 2%进行诱导 , 3 0℃振荡培养 4 h 后 , 将表达菌
株置于冰上 20 ~ 以上
,
4℃离心 30 0 r /m in Z一 3m in
快速弃上清 , 用 巧 o p L 冰冷的 d H ZO 洗去培养基
后 , 菌体贮于 一70 ℃ ,用于表达检测 。
2
.
5 酵母表达物的 w es et m 检测
将表达的酵母菌用 2 0 p L Y ea st lys is b u fe r 悬
浮 , 加入 10 0 p L g l a s s b e a d s , V o rt e x 3 0 5 , 冰上间歇
2 结果与分析
2
.
1 拟南芥转录因子目的基因的获得
根据 M I P S 数据库中公布的拟南芥转录 因子
ORF 序列设计并合成引物 , 提取拟南芥不 同组织
(幼苗 、成年全株 、前期花 、 后期花等 ) 的 RN A , 通过
R T
一
P C R 的方法获得 c D N A 作模板 , 进行 P C R 。 所获
得的 16 个转录因子正式编号及长度如表 1 所示 ,
P CR 结果如图 3 所示 , 其中 16 号 ( tA l g l 5 3 6 0 ) 是
以前期花 c D N A 为模板获得的 PC R 产物 , 其它转录
因子均以幼苗 c D N A 为模板获得的 P C R 产物 。
2
.
2 目的基因的克隆筛选
将 P C R 获得的拟南芥转录 因子 c D N A 通过
T O P o 反应连入 E n t yr 载体 , 经过 Pc R 和测序鉴定
的阳性克隆再通过 L R 反应重组入酵母表达载体
p Y T V 和植物表达载体 p P T V 中 。 A sc l 、 sa cl l双酶
切鉴定阳性克隆 , 如图 4 所示 。
2
.
3 转录因子蛋白表达的 W e s et m lB ot 检测
我们利用表达蛋白 c 端融合的 6 又 iH s 的 tag ,
以抗 hi s 一 tag 的单抗为一抗检测基因的表达情况 , 如
表 1 16 个拟南芥转录因子的正式编号及长度
T ab l e l T h e lo e u s l 1u
l 11b e r a I 1d l e l 1gt h o f l 6 A r a b id o P s i s t r a l 1 s e帅 it o n fa ct o r s
图中编号 基因编号 O即长度 图中编号
N o
.
in ht e if gU
r e l o e u s ID le n gt b o f ORF N
o
.
in ht e if g u r e
iA l g l 2 9 80
A t l g 22 19 0
iA 3 92 5 73 0
iA 39 57 60 0
A t4 92 79 50
A t492 8 14 0
A t49 32 800
A t 5 9 07 580
9 87bP
7 86bP
1002 bP
80 4bP
10 0 5bP
87 9bP
66 6bP
62 4b P
l 0
l l
l 2
13
l 4
l 5
l 6
基因编号
lo e u s ID
iA s g l 39 10
A t 5 g l 85 60
A t 5 9 5 19 90
iA 595 32 90
tA l g 2 55 60
iA l g 7 80 80
A tZ g3 12 30
iA l g l 53 6O
O RI长度
len hgt
o f ORF
6 36bP
99 0bP
6 75bP
IO65bP
10 8b6 P
10 05bP
7 l l bP
60 ObP
分子植物育种
Mole c ula rl Pa t nB
re e d i ng
Z M1 65 1 1 4j 2 1 1 3j o 1
l l! ` 10!斗 【 0 10
图 3以拟南芥不同组织c A N D为模板获得的 1 6个转录因子
的 R P C产物
注 : M: Ma 「ke r( la l nbda D/ A N Hi od l n+ Ee o R I)
i Fg U
re 3P CR r fag m
e t nsa m l Pi fe d o r fm
c N DAi nd ie fe r t ni s t
-
s ue o fAra i bd o Psi s
N
oe t: M: Ma k re r( a l m bda N DA/ 矛 I泛刀d l l l十瓦a R I)
图 5所示 。 1 6个重组质粒在酵母中都能顺利表达 ,
并且表达蛋 白的表观分子量与实际计算分子量基
本相符 。 W e st em 显色条带所指示的分子量大小应
为相应转录 因子蛋 白分子量加上约 20 kd 的标签蛋
白分子量 。 在这些蛋白中 , 我们发现某些等电点偏
酸性的蛋 白表观分子量 比实际分子 量 略大 , 如
丸492 7 9 5 0 、 A t 4 g Z s 14 o , 但 总 体 差 异 不 大 。
A t4 g犯 5 0 0 、献5 9 5犯 9 0 、 iA 5 g o 7 5 8 0 除检测到表达蛋
白主条带外 , 还检测到一些反应强度很弱的小分子
量条带 , 推测是蛋白表达或提取过程中 , 发生 了少
量降解 。 同时我们发现 , 虽然 16 个基因均检测到相
应得蛋 白表达 , 但不同蛋白之间的表达量差异很
大 。
2
.
4 转录因子蛋白序列的聚类分析
蛋白的同源性越高 , 意味着它们越可能在相似
图 4 连入表达载体 pY T v 和 p PvT 的转录因子酶切鉴定图
注 : M :I D N A la d er (由长度为 40 0 一 90 b0 p 的片段组成 ;) M2 :
M a r k e r l( a n l b血 D N A /I il ldl n 十 E c o R】) ; 由 A s d 和 aS cl l双酶
切 , 其中 1 、 2 、 5 、 10 号转录因子基因内有 aS d l 的酶切位点
F i g l l r e 4 eR
s tr i e t i o n P at em s o f tr a 们s e irP t io n fac to r s in e X P r e s
-
s io n v e e ot r P Y T V an d PP T V
N o et : M I : D N A l ad d
e r ( le n hgt
s o f ht e D N A 如 gln e n t s aer for m
40 Dbp ot 90 0饰 ) ; M Z : M akr 二 ( la l l〕bda D N A仔石门山n +
E e O R」) ; G e n e s aer d ig e set d by er s itr e ti o n e n d onu
e le a s e s A s CI
a n d S a祖 ; T h e r e ar e aS cl er c o gn it i o n s i te in s id e ht e tr a n s c ir P-
it on fa
c
OtT I
,
2
,
5
,
1 0
的途径中发挥相似的作用 。 我们利用 C L U S T A LX
对这 16 个预测为拟南芥 A P ZE/ RE B P 家族的转录
因子的蛋白序列进行比对 , 分析结果用 M EG A Z 进
行 N J 聚类 , 结果如图 6 所示 。 拟南芥 A p Z扭RE B P
家族根据 D N A 结合结构域特征分为两大亚家族 ,
A P Z 亚家族以基因 乃子份和 A N T 为代表 , 基因内含
有两个特征性 D N A 结合结构域 A p Z ; ERE B P 亚家
族以基因 石尺F 和 E尺石召尸为代表 , 基因内含有一个
特 征性 D N A 结合结构域 A p Z ( iR ec hm a un an d
M e界 r o w i tz , 19 9 8 ) 。 从聚类树上我们可以看出 , 这
16 个转录因子与 E RE B P 类蛋白关系更密切 , 因为
M a kr e r 2 9 10 13 5 16 1 M a r k e r 15 3 4 1 2 8 14 1 1 6
6 6 2 k D a
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图 5 16 个转录因子在酵母中表达情况的 W e s et m b lot 检测结果
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利用 G at e way克隆技术大规模克隆拟南芥转录因子
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A t l g8 708 0— A t9 37 560 0— A4 t9 2 8 4 10— A4 t9 2 8 0 0 3— A t 59 9 9 0 1 5A t l g6 530 A t 59 8 0 7 50— E E R日尸一 2— EF R一 1 A2 t9 2 1 3 30一 A4 t9 2 9 0 7 5A t9 52 9 0 53A t l9 12 9 8 0一 A t s g19 310— A t 59 18 6 50厂- 一- 一- - 一一 - A t 39 2 570 3
一 A t l g2 5 50 6— A N下 A PZ~下不一曰
图 6. 1 6个转录因子以及 A PZ, A N T , ERF 一 1 , E RE B P一2 蛋白序列的聚类分析
注 : A : 序列比对结果 ; B : 根据 A 构建的 N J 聚类树
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分子植物育种
M ol e eu la rP lt a nB r e
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它们在聚类树上位于同一大的分支 。 在研究未知蛋
白的功能时 , 利用聚类分析可以有助于我们对它们
进行功能推测 。
3 讨论与展望
3
.
1 G a t e w a y 克隆技术适用于大规模基因的
克隆
利用 G at e w ay 克隆技术进行基因的批量克隆
为基因组学研究提供了有力的技术平台 。 该技术操
作简便 , 反应条件易于控制 。 一般情况下 , 该技术流
程的限制因素是获得含有目的基因的中间载体 。 在
实验中 , 经 T O P O 反应获得阳性克隆主要取决于两
个因素 : 平末端 P C R 产物的质量以及反应中目的片
段和载体的比例 。 正常情况下 , 能够获得 5 0% 以上
的阳性克隆。 但某些情况下 , E n tw 载体上的基因反
向插入率较高 , 这与基因的结构特征有关 , 通常是
由于基因两端序列特异性较弱 , 引起与载体定向序
列发生同源配对 。 基因从 E n t r y 质粒重组入表达载
体是一个成功率较高的过程 , 克隆阳性率可达 90 %
以上 。 少数情况下 , 该反应的一个重要干扰因素是
共转化现象的存在 , 即中间载体和表达载体同时进
入宿主菌 。 这一情况可以通过改变反应物的比例以
及改变筛选压力来改进 。
实验中所用的蛋 白表达系统是酵母表达系统 。
该系统的优势在于以胞内形式表达蛋 白 , 而且表达
的蛋白是可溶的 , 保证了蛋白的生理活性 。 又 由于
是真核表达系统 , 所以更适于表达真核来源的蛋
白 。 但该系统蛋白表达量较低 , 因此不适于需要大
量蛋白样品的实验 , 推测蛋白表达量低的部分原因
是密码子偏爱度的影响 。
3
.
2 获得的拟南芥转录因子蛋白可用于进一
步的功能研究
转录因子 的大规模克隆和表达为下一步的功
能研究提供了很好的平台 , 我们在实验中得到的酵
母表达载体将进一步用于蛋白表达 , 用于制作蛋白
芯片 , 在体外大规模研究蛋白和蛋 白间相互作用
(Z h
u et .al
,
20 01 )
,深入研究转录因子在基因表达调
控网络中的重要作用 。 同时 , 通过研究过表达转录
因子的相应转基因植物确定这些转录 因子在植物
中的生理功能 。 一方面 ,通过表型变化来判断相关
蛋白在植物体内的作用 。 另一方面 , 通过酵母单杂
交 ( uL o et al . , 1 9% ) 等方法得到转录因子的 D N A
结合信息 , 在数据库中搜索出含有这些 D N A 元件
的下游基因 , 在过表达植物中 , 检侧这些下游基因
的表达变化 ,确定特定转录因子的调控途径 。 这些
信息将有助于我们理解转录因子与哪些生理功能
相关 。
致谢
本研究由国家自然基金委员会重大国际合作
项目 ( 3 0 2 2 1 12 0 2 6 1 ) 资助 。
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