全 文 ：中国农学通报 2011,27(12):255-260
Chinese Agricultural Science Bulletin
基金项目：农业部转基因生物新品种培育重大专项 (2009ZX08005-027B)；兵团博士基金项目 (2008JC01)；石河子大学高层次人才项目
(RCZX200730)。
第一作者简介：张萍，女，1985年出生，安徽灵璧县人，硕士研究生，研究方向：植物基因工程。通信地址：832003石河子大学生命科学学院研究生08
级422信箱，E-mail：ping2010zhang@sina.com。
通讯作者：李鸿彬，男，1980年出生，河南舞阳市人，副教授，博士，研究方向：植物分子生物学与基因工程。通信地址：832003石河子大学生命科学学
院，Tel：0993-2039660，E-mail：lihb@shzu.edu.cn。
收稿日期：2011-01-27，修回日期：2011-04-22。
过量表达棉花GhACO2基因增强拟南芥抗逆性研究
张 萍 1，王 斐 1，孙 辉 1，李鸿彬 1,2
（1石河子大学生命科学学院，新疆石河子 832003；
2石河子大学农业生物技术重点实验室，新疆石河子 832003）
摘 要：乙烯在植物生长发育过程中起到非常重要的作用，ACO基因对于细胞内乙烯的合成起到关键的
作用，然而乙烯在植物响应非生物胁迫方面的功能有很大的未知性。研究通过PCR方法从棉花基因组
中克隆获得GhACO2基因，构建了植物过量表达载体p35S::GhACO2，通过花序侵染法转化拟南芥，用
卡那霉素对转化植株进行初步筛选，进一步对阳性植株进行PCR和GUS组织化学分析检测，结果表明，
在转基因拟南芥叶片中有很强的GUS活性，茎和根有微量表达；GhACO2基因已经整合到拟南芥基因
组中，成功获得转基因拟南芥。经过纯合筛选后获得转基因T2代拟南芥植株，利用NaCl和PEG6000对
T2代植株进行盐胁迫和干旱胁迫处理，结果显示，与野生型拟南芥相比，转GhACO2基因拟南芥对盐胁
迫和干旱胁迫的耐受性显著性的增强。研究结果为进一步探讨GhACO2的生物学功能和利用基因工
程技术进行转基因育种质奠定了基础。
关键词：棉花GhACO2；过量表达；乙烯；拟南芥抗逆性
中图分类号：Q78 文献标志码：A 论文编号：2011-0270
Overexpression of a Cotton GhACO2 Gene Enhancing the Stress Tolerance of Ababidopsis Thaliana
Zhang Ping1, Wang Fei1, Sun Hui1, Li Hongbin1,2
(1College of Life Science of Shihezi University, Shihezi Xinjiang 832003;
2Key Laboratory of Agro-biotechnology of Shihezi University, Shihezi Xinjiang 832003)
Abstract: Ethylene signaling plays important roles in multiple processes of plant growth and development,
ACO gene is the key factor regulating biosynthesis of ethylene, however, functions of ACO gene and ethylene in
abiotic stress responses remain largely unknown. Here, the author cloned a cotton GhACO2 gene from cotton
fiber cDNA and constructed a plant overexpression vector p35S::GhACO2. Genetic transformation of
Arabidopsis was performed by floral dip method, successive selection were completed with kanamycin and
further PCR and GUS histochemical detection of transgenic arabidopsis plants. The results of selection showed
that GUS enzyme of transgenic arabidopsis plants was expressed greatly in leaf and little in stem and root,
GhACO2 gene was integrated in the Arabidopsis genome and transgenic positive plants were obtained
successfully. The T2 generation homozygous transgenic plants were obtained by selfing, and were used to
undergo salt-stress and drought-stress treatment by NaCl and PEG6000. The results indicated that, with the
comparison of Col wide type plants, stress tolerances of transgenic plants were enhanced significantly. All
these results established the basis of researching biological functions of GhACO2 further and transgenic
breeding by genetic engineering technology.
Key words: cotton GhACO2; overexpression; ethylene; the stress tolerance of Arabidopsis
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0 引言
乙烯（ethylene）是一种植物激素，在植物整个生命
周期中起着至关重要的作用，它对植物的生长发育过
程如种子萌发、果实成熟、叶片衰老、器官脱落及响应
胁迫反应等有广泛的影响[1]。1-氨基环丙烷-1-羧酸氧
化酶（ACO）基因是乙烯合成途径中的最后一个关键
酶，也称为乙烯形成酶（EFE），许多研究表明，其对于
细胞内乙烯的合成起到重要的调控作用，并可以通过
促进乙烯产生增强植物耐受胁迫条件的能力。在棉花
中，GhACO2是ACC氧化酶基因家族一员，该基因的
表达与细胞内乙烯的生成紧密相关，并且参与纤维细
胞的伸长发育过程。此研究通过在拟南芥中过量表达
棉花GhACO2基因研究其对于植株生长发育和参与
抗逆性等多方面影响，有助于解析ACO基因参与植物
发育的功能，并为进一步通过基因工程技术利用该基
因进行转基因育种建立基础和提供有价值的参考。
乙烯的生物合成途径最早由Liberman于 1966年
首次在苹果上得到证实。乙烯生物合成途径中有多个
基因共同参与。其中，ACO基因是合成乙烯的最后一
个基因，其编码的酶可以将ACC氧化并生成乙烯，对
于细胞内乙烯的生成起到关键作用。陈银华等[2]通过
农杆菌介导的遗传转化法将3种不同结构的外源ACO
基因导人番茄基因组中，可以显著增强细胞内乙烯的
产生。叶志彪等[3]用ACO反义基因转化番茄，使番茄
内乙烯的产生受到了明显的抑制。Ayub等[4]将ACO
反义基因导入甜瓜可抑制乙烯99%以上。Shi等[5]报道
乙烯在纤维细胞的伸长过程中起关键作用，ACO基因
对于纤维细胞内乙烯的产生发挥着重要作用。除了调
控植物生长发育过程外，乙烯的产生与植物耐受胁迫
能力的增强密切相关。研究表明：乙烯及乙烯的前体
ACC处理能提高水稻和拟南芥的抗盐性，ACC处理能
显著增加野生型拟南芥Col幼苗在高盐环境下的抗盐
能力[6]。在盐分胁迫条件下，耐盐马铃薯品种具有较
高的乙烯产生速率，盐胁迫引起根部ACC的积累并转
移到叶片，加速叶片中ACC向乙烯的转化[7]。利用拟
南芥乙烯突变体研究表明，在干旱胁迫条件下，乙烯的
产生与植物的抗旱性紧密相关[8]。
调控合成乙烯的关键基因GhACO2在棉纤维细
胞快速伸长阶段发挥关节作用；但是，该基因在植物
抗逆性方面的功能未见报道，此研究以拟南芥为研究
对象，将该基因转化拟南芥研究该基因在植物耐受胁
迫条件方面的功能。此研究从棉花纤维组织中克隆
到调控乙烯合成的关键基因GhACO2，构建植物表达
载体并在拟南芥中过量表达，研究GhACO2基因对于
拟南芥植株发育的影响及其在拟南芥抗逆性方面的
功能。
1 材料与方法
1.1 试验材料
拟南芥（Arabidopsis thaliana）哥伦比亚野生型由
北京大学朱玉贤教授提供。大肠杆菌（Escherichia
coli）和农杆菌GV3101由石河子大学农业生物技术重
点实验室提供；凝胶回收试剂盒、质粒提取微量试剂盒
购自TIANGEN公司；限制性内切酶Xba I、BamH I、T4
连接酶购自大连宝生物公司；其他试剂购自上海生工
生物工程有限公司或国产分析纯试剂。
1.2 方法
1.2.1 GhACO2基因的克隆和植物过量表达载体的构
建 根据Genbank库中提供的序列设计引物，在上、下
游引物分别引入Xba I和BamH I酶切位点，引物序列
为：
上游引物：5-CTGTCTAGAATGGAGGTAGCTT
TCCC-3
下游引物：5-GCGGATCCTCAAACAGTTGCAA
TAGG-3
引物合成由上海生物工程公司完成。PCR扩增
反应条件为95℃预变性4 min，95℃变性30 s，52℃退火
30 s 72℃延伸 45 s，循环 30次，72℃延伸 7 min，4℃保
存 。 GhACO2 基 因 PCR 产 物 回 收 后 ，连 接 到
pMD18-T Vector上，转化大肠杆菌DH5α，提质粒并双
酶切鉴定后，送上海生工技术公司测序。将经过测序
鉴定正确的 pMD18-T-GhACO2重组质粒和植物表达
载体PBI121p35S同时用Xba I和BamH I进行酶切，回
收DNA片段后用T4连接酶将 2个线性片段连起来，
并转化导人DH5α感受态细胞中，在含有 50 mg/L Kan
的培养基平板上挑取白斑克隆 PCR鉴定，用Xba I和
Bam H I 双酶切鉴定，得到植物表达载体 p35S::
GhACO2。
1.2.2 拟南芥的遗传转化 制备好已转化了植物表达载
体 p35S::GhACO2质粒的农杆菌菌液，在转化前 1天，
转入含 50 μg/L卡那霉素（Kan），50 μg/L利福平（Rif）
和20 μg/L的庆大霉素（Gen）的液体LB培养基的三角
瓶 28℃，200 r/min，培养过夜，当菌液OD600在 1.5~2.5
之间时取出使用。4℃ 4000 r/min离心10 min，弃上清，
将沉淀用渗透培养基（蔗糖 5%，Silwet L-77200 μL/L）
悬浮，使OD600在 0.8左右。用滴管把农杆菌悬浮液滴
在花蕾上，尽量保证每朵花至少被滴过 1次。将浸染
过的拟南芥放在恒温室暗培养，第 2天在正常光照条
件下继续培养，收取种子。
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张 萍等：过量表达棉花GhACO2基因增强拟南芥抗逆性研究
1.2.3 转基因植株的卡那霉素筛选及 PCR检测 将收
取的拟南芥种子于4℃低温春化3天后，灭菌后均匀播
种于含有50 mg/L Kan的1/2 MS培养基中。提取在培
养基中 12天未黄化幼苗的DNA进行PCR鉴定，检测
是否转入GhACO2基因。
1.2.4 转基因拟南芥的GUS组织化学检测 转基因植
株经PCR鉴定在含GUS基因的情况下，取不同的组织
器官，用X-Gluc染色液对GUS基因表达情况进行鉴
定，以未转化植株为对照。先将材料用固定液（1%甲
醛和 0.05% Triton X-100）室温固定 30 min，用洗脱液
（50 mmol/L磷酸钠缓冲液）冲洗 3遍，GUS染色液
（50 mmol/L磷酸钠缓冲液，4 mmol/L K4[Fe(CN)6]，
10 mmol/L Na2EDTA，1%，0.5 mmol/L X-gluc，2%甲
醇，100 mg/mL氯霉素）染色 2 h，取出材料，用体积分
数 30%、50%、70%、100%的乙醇逐级漂洗，然后进行
GUS染色观察。
1.2.5 盐胁迫和干旱胁迫处理及表型观察 将收取的拟
南芥种子于4℃低温春化3天后灭菌，然后将野生型拟
南芥均匀播种于1/2 MS培养基，而转基因拟南芥均匀
播种于含有50 mg/L Kan的1/2 MS培养基中。发芽10
天以后，对转基因植株和野生型植株分别进行盐处理
和干旱处理。NaCl 浓度分别为 0、50、100、150、
200 mmol/L；PEG6000浓度分别为 0、5%、10%、15%、
20%。试验设计 3个独立重复，培养 10天以后观察并
拍照。
2 结果与分析
2.1 GhACO2基因的克隆和鉴定
通过 PCR反应，从棉花纤维组织 cDNA中扩增
GhACO2基因，得到大小为960 bp的特异性片段，经测
序后与预期的结果相符（图1）。
2.2 植物过量表达载体的构建与鉴定
将 p35S::GhACO2重组质粒经Xba I和BamH I双
酶切后，电泳分析中出现 1条 960 bp左右的片段，为
GhACO2基因目的条带（图 2），表明成功植物表达载
体 p35S::GhACO2。将重组子通过电转化法转化农杆
菌GV3101，将农杆菌菌液经 PCR后获得了GhACO2
基因目的片段条带（图3），与预期结果一致，可用于下
一步拟南芥的遗传转化。
2.3 拟南芥转基因植株的抗性筛选及PCR检测
通过花序浸染法的基因转化方法，将含有 p35S::
GhACO2重组质粒的农杆菌转化野生型拟南芥。经过
含有 50 mg/L Kan的 1/2 MS培养基上生长 12天，未转
化成功的拟南芥幼苗逐渐白化死亡，转化成功的拟南
芥正常生长（图4）。
M 1 2
5000
3000
2000
1000
750
500
250
100
M：Marker5000；1：GhACO2扩增条带；2：阴性对照
图1 棉花GhACO2基因PCR扩增
M 1 2
5000
3000
2000
1000
750
500
250
100
M：Marker5000；1：p35S::GhACO2重组质粒的双酶切
（Xba I和BamH I）；2：p35S::GhACO2重组质粒
图2 p35S::GhACO2重组质粒的双酶切鉴定
M 1 2 3 4 5 6 7
5000
3000
2000
1000
750
500
250
100
M：Marker5000；1~5：菌液扩增结果；6：阳性对照；7：阴性对照
图3 转p35S::GhACO2农杆菌的GhACO2
基因菌液PCR检测
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对卡那霉素初筛后的转基因拟南芥植株分别提取
幼苗基因组DNA，并进行了半定量RT-PCR 检测，出
现GhACO2基因大小为 960 bp阳性条带的为转基因
阳性植株（图 5），表明GhACO2基因已经成功整合到
拟南芥基因组中。
2.4 转基因拟南芥的GUS组织化学检测
取经过卡那霉素和PCR检测的转基因拟南芥T2
代植株20天幼苗进行GUS检测，经X-gluc染色显示，
叶片中有明显的蓝色，茎和根也有微量的蓝色（图6），
这表明在转基因拟南芥的叶、茎和根中都有表现出
GUS活性，野生型拟南芥植株各器官都没有检测到
GUS基因的表达，p35S::GhACO2重组子已经成功转
A B
A：未转化植株；B：转化植株
图4 转基因拟南芥的卡那霉素抗性筛选
5000
3000
2000
1000
750
500
250
100
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
M：Marker5000；1~18：不同的独立转基因植株PCR产物；19：阳性对照；20阴性对照
图5 转基因拟南芥植株的PCR检测
化拟南芥。
2.5 转基因拟南芥对于盐胁迫和干旱胁迫的耐受性获
得显著提高
2.5.1 转GhACO2基因拟南芥耐受干旱胁迫的能力获
得增强 将在培养基内培养10天的野生型拟南芥和转
基因拟南芥分别移入未加入或加入 PEG6000的培养
基中继续培养。经过 10天的培养后后，在不含有
PEG6000的条件下，转基因拟南芥植株和野生型拟南
芥植株没有明显的差异（图7A）；在15%的PEG6000的
处理下，转基因拟南芥和野生型拟南芥植株发育有着显
著的差异。野生型拟南芥生长发育受到强烈的抑制，转
基因拟南芥植株的生长发育受到一定的抑制，但发育
状况明显优于野生型拟南芥（图7B），表明GhACO2基
因使拟南芥耐受干旱胁迫的能力获得增强。
A B
A：转化植株，箭头所示为经GUS染色显现的蓝色部分；B：未转化植株
图6 转基因拟南芥的GUS组织化学染色
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2.5.2 转GhACO2基因拟南芥耐受盐胁迫的能力获得
增强 将在培养基里培养10天的野生型拟南芥和转基
因拟南芥分别移入未加入或加入NaCl的培养基中继
续培养。在不含有NaCl的条件下，转基因拟南芥植株
和野生型拟南芥植株没有明显的差异（图8A）；经过10
天的NaCl处理后，转基因拟南芥植株的生长明显优于
野生型拟南芥，在 150 mmol/L NaCl的处理下，野生型
拟南芥生长发育受到强烈的抑制，部分叶片逐渐白化，
转基因拟南芥植株的生长发育受到轻微的抑制，但发
育状况明显优于野生型拟南芥（图8B），表明GhACO2
A B
Col 转基因植株 Col 转基因植株
A：0% PEG6000；B：15% PEG6000
图7 转基因拟南芥在干旱胁迫下的表型分析
A B
Col 转基因植株 Col 转基因植株
A：0 mmol/L NaCl；B：150 mmol/L NaCl
图8 转基因拟南芥在盐胁迫下的表型分析
基因使拟南芥耐受盐胁迫的能力获得增强。
3 结论
本研究以克隆了棉花纤维中调控乙烯合成的关键
基因GhACO2，以PBI121载体为基础构建了植物过量
表达载体 p35S::GhACO2，将载体转化农杆菌后通过
花滴法转化拟南芥，在进行初步卡那霉素筛选和后续
的PCR及GUS染色检测分析后，GhACO2基因已经整
合到拟南芥基因组中，在转基因拟南芥叶片中有很强
的GUS活性，茎和根有少量表达，成功获得转基因拟
南芥植株。经过纯合和筛选后，获得T2代转基因拟南
芥植株，并用于后续的胁迫处理。
此研究选择T2代转基因植株和Col野生型拟南
芥，利用培养基进行胁迫处理，在 150 mmol/L NaCl和
15% PEG6000的处理下，Col野生型拟南芥植株整体
包括叶片和根系发育等都受到了显著的抑制，有些叶
片逐渐白化；转基因拟南芥的发育受到了轻微的抑制，
但发育状况显著的优于Col野生型拟南芥。研究结果
表明：棉花GhACO2基因在拟南芥中的过量表达显著
性的增强了其对于盐胁迫和干旱胁迫的耐受性。
4 讨论
乙烯在植物响应逆境胁迫方面发挥着重要作用，
在调控乙烯生物合成路径的SAM、ACS、ACO基因中，
在某些植物中ACO基因对于乙烯的合成起着关键作
用。许多研究表明，ACO基因的表达调控着细胞内乙
烯的产生，并与植物耐受胁迫条件的能力紧密相关：在
NaCl胁迫条件下，ACO基因的表达快速增加并伴随着
乙烯含量的升高 [9]；在烟草中，盐处理能显著增加
NtACO1，NtACO2和NtACO3基因的表达 [10]；在一种
豆科植物的根组织中，NaCl胁迫处理诱导了ACO基
因的表达和乙烯的大量产生[11]；ACO基因的表达和乙
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烯的产生与PEG处理的干旱胁迫密切相关[12-13]。
此研究将棉花GhACO2基因转化到拟南芥中，转
基因拟南芥对于盐胁迫和干旱胁迫的耐受性显著性的
优于野生型未转基因拟南芥，GhACO2基因调控着细
胞内乙烯的合成，说明GhACO2基因的表达和乙烯的
产生对于拟南芥植株耐受性的功能获得起到重要的作
用，此结果与在其他植物上的许多研究结果：盐胁迫和
干旱胁迫诱导ACO基因的表达和乙烯的产生的结果
相一致。乙烯能够促进活性氧的产生和抗坏血酸过氧
化物酶的表达[14]，而在胁迫条件下，通常活性氧和抗坏
血酸过氧化物酶都会受到诱导产生。因此，GhACO2
基因可能部分通过活性氧和抗坏血酸过氧化物酶的作
用增强植物的抗逆性。本研究首次进行棉花GhACO2
基因在植物抗逆性功能方面的探索研究，是对该基因
功能研究的延伸，对于深入研究该基因的生物学功能
具有重要理论研究意义。
本研究中的拟南芥培养和胁迫处理均是在培养基
上进行的，将前期培养好的野生型植株和转基因植株，
分别选取生长均匀的植株放入同一条件的培养基上进
行培养观察。利用培养基培养拟南芥并进行胁迫处理
具有明显的优势，有利于培养出生长发育整齐的植株
并用于随后的试验，这种处理方式比将幼苗移入营养
土中的条件统一性要高，能够保证一致的培养和胁迫
处理条件，使得结果重复性好、可信度高。
棉花GhACO2基因在棉纤维发育过程中调控着
乙烯的生物合成，并且对于纤维伸长发育起着关键的
作用[5]。此研究发现GhACO2和乙烯对于植物抗逆性
增强有重要作用，ACO基因和乙烯通过哪些信号通路
和物质进而增强植物抗逆性的机制有待于进一步研
究。
棉花是中国最重要的经济作物之一，棉花纤维是
纺织工业的重要原料来源。乙烯在植物的整个生长发
育时期内都发挥着重要作用 [15]，本研究结果是棉花
GhACO2基因生物学功能研究的拓展，有助于利用基
因工程技术进行棉花等作物的优质、抗逆等品质方面
的转基因生物新品种培育工作的顺利开展，具有重要
的生产实践应用价值。
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