全 文 ：植物生理与分子生物学学报 , oJ u rn a l of 灿 n t p hy s ot ot 盯 a n J物 le e u扮 B io ot 盯 20 0绍, 30 (5 ) : 5 17一5 22
谷肤甘肤转移酶基因过量表达能加速盐胁迫下转基因拟南芥的生长
戚元成 ’ ,2 * 张世敏 ’ 王丽萍 3 王明道 ’ 张 慧 “
( ’ 河南农业大学生物技术与食品科学学院 , 郑州 4 5 0 0 0 2 ; 2 山东师范大学逆境植物重点实验室 , 济南 2 5 0 0 14 ; 3 中国科学院上海生
命科学研究院植物生理生态研究所 , 上海 2 0 0 0 3 2)
摘要 : 盐地碱蓬谷脱甘肤转移酶基因 (gl ut at ih on e s -
tr an s fe r a s e g e n e
,
GS 乃克隆到植物表达载体 p R o K 11 35 5
启动子的下游 , 通过农杆菌介导 , 利用花絮浸泡法转
化拟南莽 。 转化子在含有卡那霉素的培养基上经过筛
选以后 , 将初步验证为阳性的转基因植株通过 P C R -
Sou th e nr 进一步证实。 经过选育 , 筛选并分离到卡那霉素
的抗性并且遗传稳定的 T 3代纯合子转基因拟南芥品 系。
通过 N or t he m 杂交证实外源基因在转基因拟南芥中表
达 。 在盐胁迫条件下 , 通过测量转基 因植株 (G )T 和野
生型植株(w l , )的生物量和谷胧甘肤 (氧化型 : G S ;G 还
原型 : G s H )发现 : 转基因植株的生物量较野生型有一
定程度的提高; G S S G 含量在转基因品 系中比野生型的
含量明显高。 因此 , 过量表达 G S T 能够提高转基因植
株在盐胁迫条件下的生长 , 而且这很可能是 由于还原
型谷胧甘肤被氧化的结果 。
关键词 : 谷耽甘肤转移酶 ; 盐胁迫 ; 拟南芥; 过量表达
中图分类号 : Q 7 4
盐害是影响植物生长 的一个重要因素 , 它对
农业的危害已成为一个全球性的问题 。 植物对盐
胁迫耐受性的分子生物学研究不仅对于培育耐盐农
作物品种和开发大面积的盐碱地具有重要的应用价
值 , 而且也 己成为植物基因表达调控及信号转导
等基础理论研究的重要内容 ( z h u 2 0 0 0 , 2 0 0 一) 。
现在认为高盐胁迫导致植物损伤的一个重要
原因可能是 由于高盐所产生的活性氧的缘故 , 活
性氧几乎可 以和所有生物大分子反应 , 造成脂类
和蛋白质代谢异常 。 植物在高盐胁迫下会表现出
一些复杂的分子水平的反应 , 它包括合成胁迫应
答蛋白和渗透保护物质 。 这些盐胁迫表达产物通
过清除活性氧或防止活性氧破坏细胞结构来起解毒
作用 (Z h u 2 0 0 1) 。 基因功能的研究可以通过改变基
因的表达 , 观察其对表型的影响 以及 由此引发的
对其它基因的影响 。 改变基 因表达有两个方向 ,
一 是增强其表达 ; 再者是减弱或彻底 终止其表
达 。 利用转基因植物来过量表达清除活性氧相关
基因已经成为验证这些基因生理功能的很有用的工
具 (A n e n 1 9 9 5) 。 例如用转基因烟草来过量表达过
氧化物歧化酶或者谷肤甘肤还原酶发现在一定条件
下可以防止氧化损伤 (B o w l e r 等 19 9 1 , S e n G u p t a 等
19 93
, v
an C a m p 等 19 96) ; 用转基因烟草过量表达谷
肤甘肤转移酶可以提高幼苗在盐胁迫条件下的生长
( R o x a s 等 19 9 7 , 2 0 0 0 ) 。 植物谷肤甘肤转移酶在植
物对异源物质的代谢和内源代谢中都表现了一定的
功能 , 通过转基因技术使之在植物体中过量表达
显示它使植物在盐胁迫下具有一定耐盐性 (戚元成
等 2 0 0 2 ) 。
山东师范大学逆境植物重点实验室 (王丽萍等
20 2) 从盐地碱蓬 (uS a da : a ls a) 幼苗的 c D N A 文库中
克隆到了一个 0 . 9 k b 的 G S T 基因的全长 c D N A 。
N白lrt 犯m 杂交结果表明粼X) im n o VL 的 N 副Cl处理 48 h ,
幼叶中 G S T m R N A 的表达量是对照的 2 ~ 3 倍 , 说
明碱蓬中 G S T 基因受盐诱导 ; S o ut h er n 杂交结果
证明 G S T基因在碱蓬基因组中可能有至少 2个以上
的拷贝 。 本文通过农杆菌介导的花序浸泡法将 GS T
基因转到拟南芥中 , 确实获得了所想得到的转基
因植株的分子生物学证据 ; 对纯系初步分析表明
外源基因 G S T 过量表达并显示 了一定的耐盐性 。
材料与方法
1
.
1 材料 、 菌种和试剂
拟南芥 (A ar b i故 , is : hat lian a) C 0 ih mb ia 生态型 。
大肠杆菌 ( E s c h e r i c h i a c o l i ) : X L I一 B l u e M R F’
(M e r A
,
M e r B
一 ,
T e t
r
)菌株为本实验室保存 ; 农杆
菌 (A g or b a e et r i u m t u m aef c ie n s )G V 3 10 1菌株为本实
验 室保 存 ; 克隆 载 体 K S ; 植 物 表达 载 体
P R O K l l
。
限制性内切酶 、 连接酶及 D N A 随机引物标记
2 0 0 3
一
12
一
2 5 收到 , 2 0 0 4 一 0 7 一 0 5接受 。
本 项 目为 国家和 山东 省科 委重 点基 础研 究课题 专 项经 费
( 0 7 9 9 9 0 1 1 7 0 0 )资助项 目的一部分 。
*
E
一
m a i l : y u a n e h e n g q i2 0 0 3 @ 16 3
.
e o m : T e l : 0 3 7 1
一
3 5 5 5 1 5 3
植物生理与分子生物学学报 30 卷
试剂盒等为 T a K a R a 公司产品 ; a 一 3 2P 一d C T P 购 自
北京亚辉公 司 。
1
.
2 植物表达载体的构建及农杆菌的转化
本实验用的植物表达载体为 p R O K H , 它含
有新霉素磷酸转移酶 (N P T n )基因 , 可赋予被转化
植物细胞以卡那霉素抗性 的筛选标记 , 利于转化
植株的筛选 。
p R OKJ I 多克隆位点上游有非特异性的组成型
表达 的 3 5 5 启动子 , 它可 以使外源基因在植物生
长发育的任何阶段 、 任何组织器官 中表达 。 为使
外源基因 G S T 正向插入 p R O K n 载体 , 先将基因
片段 以 KP n l 和 E co R I 克隆位点插入 K S 中 , 再
利用 K S 载体多克隆位点上的 KP n l 和 Xb a l 位点
切下外源片断 , 正向插入 p R O K H 载体的相应位
点得到 pG S T , 抽提出质粒做酶切验证以确保外源
片断插到 p R O K H 一上; 构建好 的 p G s T 用直接转
化法转化农杆菌 G V 3 10 1 : 在 2 0 0 林L 感受态细胞
中加入 1 林g 重组质粒 , 冰浴 3 0 m in ; 液氮中冷
冻 1 m i n ; 3 7 oC 水浴中融化细胞 2一3 m i n ; 加 l l n L
L B
,
28 ℃轻轻振荡 2 , 4 h ; 轻轻离心 l ln in , 用 .01 11正比
悬浮沉淀 , 将细胞悬液涂布于含卡那霉素 50 p ,g/ 1l l L、
利福平 4 0 林g/ m L 的 L B 平板上 , 2 8℃培养 2一 3 d 。
为确保平板上的菌株确实为含有表达载体的阳性菌
株 , 扩大培养后提取质粒做酶切 验证得到 G S T
。 n N A 片断 (图 l ) 。
, 2 0 0 0 b P
夕架吕韶
图 1 KP n l和 Xb a l双酶切 p G s T 得 G S T e D N A 片断
F ig
·
1 PG S T d i g e s t
e
d b y KP
n l a n d Xb
a
l
1
.
3 拟南芥幼苗的培育
将拟南芥种子播种于盛满培养土的直径 7 c m
的培养杯中 , 每杯播 5 处 , 每处几颗 , 用纱网
覆盖 , 萌发 2一3 d 后移至 4 ℃光照培养箱中放置 1
周 (进行春化 ) , 再放到 2 3 ℃ 的组织培养室中生
长 , 1 周后每处只 留一棵最好 的苗 。 到植株长至
茎高约 3 c m 时 , 去除其顶生花序 , 以刺激叶生
花序的生长 (注意避免伤及 叶生花序 ) 。 待叶生花
序长 出 , 其下 部的花己有授粉的出现时进行转
化 。 转化前 , 将已授粉花及果荚除掉 。
1
.
4 花序浸泡法转化拟南芥和转化子筛选
制备好含 p G S T 的农杆菌菌液 10 m L , 在转
化前 l d , 转入含卡那霉素 5 0 林g /m L L B 培养基
的大瓶培养过夜 ; 第 2 天 , 当菌液 O D 60 在 1 . 2一 1 . 6
之间时取出使用 。 室温 2 s o o x g 离心 15 m i n , 弃
上清 , 沉 淀悬浮于相应体积的渗透培养基 ( 1 12
M S
, 蔗糖 5% , M E S 0 . 5 9 几 , 1 m g /m L 的 6一 B A
母液 10 “ L几 , S i lw e t L 一7 7 2 0 0 林L IL )中 , 使 o D 。 。
在 0 . 8 左右 。
将农杆菌悬浮液倒在小烧杯中 , 将长有拟南
芥的培养杯倒扣其上 , 保证莲座叶以上部分浸没
于液体中 , 浸泡 巧 m in 。 取出植株 , 横放在塑
料盘中 , 用保鲜膜封好以保持湿度 , 放在恒温室
培养 。 第 2 天打开 , 竖直培养 , 仍用保鲜膜保
持湿度 6~7 d 。 根据情况可再浸染一次 。 培养 3科
周待种子成熟后收取种子 , 干燥器中存放 2 周 。
将收获的转化子 T 。 先用 7 0 % 的乙醇浸泡 2
m in
, 再用 10 % 的 N a C 10 溶液涡旋洗涤 巧 而 n 进
行消毒 , 用无菌水洗 5 次后 , 用 0 . 1% 的琼脂重
新悬浮种子 , 然后均匀种到固体筛选培养基 (M S ,
3% 蔗糖 , p H 5 . 8 , 0 . 8% 琼脂 , 卡那霉素 3 0 m g /
)L 表面上 , 4 ℃春化 1 周 , 放入恒温组织培养室
培养 。 利用植物表达载体赋予转基 因植株的卡那
霉素抗性 , 转基因植株幼苗为绿色 , 未转基 因的
植株幼苗由于不 具卡那霉素抗性 , 逐渐黄化死
亡 , 最后只剩绿色的转基因植株存活 。 将具有卡
那霉素抗性的幼苗移 出培养 , 成熟后收获 T ; 代种
子 。 上述方法筛选 T ,代种子 , 未黄化植株成熟后
收获 T : 代种子 。 T : 代经筛选 , 己经能够得到稳
定遗传的 T 3代纯合子品系 , 利用纯合子可以做一
些生理 测验 。
1
.
5 P C R
一
S o u th e r n 杂交检测
用 P C R 方法检测外源基因的整合情况 , 但由
于 P C R 扩增十分灵敏 , 有时会出现假阳性扩增 ,
因而为最后确定外源基因是否整合 , 又对扩增产
物进行 S o u t h e r n 杂交 。 通过 S o u t h e r n 杂交来排除
P C R 方法可能带来的假阳性现象 。 如果 P C R 方法
扩增出了特异条带 , 而 S o ut h er n 杂交后该条带处
无杂交信号 , 说明该 P C R 条带是假阳性条带 , 该
条带对应的植株也就是假阳性转基因植株 。
取一片拟南芥叶片 (小于 2 m m x Z m m ) , 放到
5 期 戚元成等 : 谷胧甘肤转移酶基因过量表达能加速盐胁迫下转基因拟南芥的生长
含有 4 0匹 0. 2 5 mol 几 N ao H的 0.L 5 m离心管中 ,
在沸水浴中煮 3 0 5 。 加入 4 0 林L 0 . 2 5 m o l几 盐酸 ,
2 0 匹 缓冲液 (0 . 5 m o lL/ T r i s 一 H e l p H = 5 . 0 , 0 . 2 5%
N P
一
4 0 )
, 沸水浴煮 2 m i n 。 一8 5 0 0 x g 离心 1 m i n ,
弃去液体 , 剩余组织用作 P C R 反应液并加入
d N T sP
、
T aq 酶和灭菌双蒸水 , 使每个管中反应
混合液达 5 0 匹后 , 进行 P C R 扩增 。 反应条件参
数为 : 9 5 oC 5 m i n , 1个循环 ; 9 5 oC 3 0 5 , 5 5 oC
3 0 5
,
7 2 oC 3 0 5
,
4 0 个循环 ; 7 2 oC 1 0 m i n , l
个循环 。 P C R 完毕后 , 电泳检测 。
电泳后利用毛细法将 P C R 产物转移至尼龙膜
上 , 紫外光下交联 5 而 n 固定 D N A , 以 G S T 。 D N A
为探针模板 , 用 D N A 随机引物标记试剂盒
(T a K a R a )做同位素标记 , 进行 S o u th e r n 杂交 , 然
后进行放射 自显影 ( s a m b r o o k 等 19 5 9 ) 。
1
·
6 N o r t h e r n 杂交检测
转基因植株 T 3代的纯合子品系 GT I 和野生型
幼苗生长两周以后移到含有蛙石的培养杯中 , 用
H oa gl an d 溶液培养 。 当植株长到 3科 c m 时用 N初C l
巧 0 r n 们n o比 分别处理转基因植株 O 、 24 、 48 h , 然
后用异硫氰酸肌方法 ( C h o m o e z y s h i 和 s a e e h i 29 5 7 )
提取拟南芥幼苗总 R N A , 用 甲醛变性凝胶进行 电
泳 , 电泳完毕将 R N A 转移 至尼龙膜上 , 交联 5
m in 固定 R N A , 同样以 G S T c D N A 为制备探针的
模板 , 探针标记 及杂交 、 放射 自显 影 方 法 与
S o u t h e r n 杂交相 同 。
1
.
7 盐处理和植株生物量测定
野生型拟南芥和转基 因品系 G T I 、 G T Z 、
G T 3播种于盛满培养土的直径 7 c m 的塑料培养杯
中 , 培养杯下面有小孔而且培养土里混有蛙石 以
增加通透性 , 这样便于植株的生长和 以后 的处
理 。 植株出现 4 片真叶时去除过多幼苗使每个培
养杯中保留 3 棵比较健壮的幼苗 。 发芽以后 10 d ,
对转基因品系和野生型植株进行盐处理 。 N a CI 浓
度分为 O 、 5 0 、 1 0 0 、 1 5 0 m m o l / L 。 每个品系每
个浓度 5 个重复 , N a C I浓度每天递增 5 0 m m o l几 ,
到处理的终浓度时保持 , 这样一直持续 巧 d 。 处
理时 N a CI 溶解在 H oa gl an d 培养液中 , 每天处理
幼苗 2 次以减少 N a CI 浓度的变化幅度 。 巧 d 以后 ,
测量 3个转基因品系和野生型拟南芥地上部分的鲜
重和干重 , 计算出每克鲜重所含干 重的数值 。
1
.
8 谷肤甘肚含量测定
三个转基因品系和野生型拟南芥如上述方法
用 H o a gl an d 溶液培养 ; 幼苗长至 4 周以后用 N a CI
1 5 0 m m o l /L 盐激处理 0 、 2 4 、 4 s h 。 每个品系每
个处理时间 5 个重复 , 每个培养杯里有 3 棵拟南芥 。
处理完毕后 , 在研钵内加上 1 m L 2 . 5 m ol L/
H C 10 ; 研磨 , 1 8 5 0 0 X g 离心 5 m i n , 用 K ZC o 3
s m o比将上清液的 p H 调节到 6一 7 之间 。 在 I l n L
的反应体系中测定总谷眺甘肤的含量 , 反应体系
包括 8 0 0 匹 0 . 3 m o比 N A D p H , 10 0 抖L 6 m m o U
L D T N B
,
1 0 0 林L 提取液 , 一个单位的谷肤甘肤
还原酶 。 在 4 12 n m 下测定光吸收值 。
对于氧化态谷肤甘肤 ( G S S G )的测定 , 以上述
1 m L 的反应体系和反应组分 , 额外在提取液里加
上 2 林L 的 2 一 乙烯喀咙 , 然后将反应体系在 2 5℃
培养 l h 。 总谷胧甘肤和氧化态之差就是还原态的
谷肤甘肤 ( G S H ) 。
2 结果
2
.
1 转基因拟南芥的筛选和外源基因表达
T 。转化子在卡那霉素 30 mg 几 的 M S 培养基上
共筛选了 2 0 0 平皿 , 每皿有 2 0 0 粒左右 。 共筛选
到阳性植株 3 8 棵即 3 8 个品系 。 筛选到 的转基 因
植株 , 由于外源基因与拟南芥基因组重组时 , 可
能只与同源染色体中的一条发生重组 , 也可能在
不 同的两条上双位点或者多条染色体上多位点插
入 , 这样在后代中就会表现出 ( 2 2一 1) : 1 和 (2 4一 l) : 1
的分离规律 。 因此 , 必须筛选到转基因植株纯合
系 , 才能得到稳定的转基因植株 。 筛选到的阳性
植株 (即 T 。代如图 2) 自交后 , 得到分离规律符合
(2 2一 :1) 1的品系 2 0 个 ; 其它 18 个品系有的基本符
合 ( 2 4一 1) : 1 , 有的规律不够 明显 。 因为这不是研
究重点 , 为了利用尽可能短的时间得到纯合子 ,
对这 18 个品系没再研究 。 单株收种子即为 T I代种
子 , 这些种子 中有纯合子也有杂合子 , 经筛选获
得不发生分离的株系 T : 代 (图 3 A ) , 它们所结的种
图 2 转化子 T O代在卡那霉素 M S 培养基上的筛选
R g
·
2 T o P r o g e n i e s s c r e en
e d w iht k an am y
e in o n M S
植物生理与分子生物学学报 30 卷
8076543210
冉Unù一UO
ǎ息兰。一岑合O
图 3 转化子T : 代在卡那霉素M S 培养基上的筛选
F ig
·
3 T Z P r o g e n i e s s e r e e n e d w i ht kan am y
e in o n M S
A
:
H o m o z y g o u s : B : H e t e or z y g o u s
.
子 即 T : , 共 得 到 1 4 个 转 基 因 纯 合 子 品系
( G T I一 14) 。 纯合的转基因植株即可用于分子生物
学指标分析和生理测试 。
卡那霉素抗性筛到 的阳性植株 , 未必就是转
基 因植株 , 因不同个体 间卡那霉素的抗性也有差
异 , 需要分子证据来验证 。 最方便快捷的方法就
是 P C R 扩增 。 转基因植株的叶片总 D N A 经处理
后作 PC R 扩增模板 , 用 G S T 的特异引物进行 PC R
扩增 , 经琼脂糖凝胶电泳分析 , 转基因植株扩增
出了 7 0 0 b p 的特异性条带 , 野生型和对照植株没
有扩增出条带 , P C R 一 S o ut h er n 结果进一步验证了
G s T 外源片断已经整合到拟南芥基 因组中 (图 4) 。
图 5 N o rt h e m 杂交证实外源基因表达
F ig
.
5 E x P er s s i o n o f tr an s g e n e e o n if n n e d by N o rt h e m b l o t i n g
L an e l : T r e a te d w i ht s a l t fo r 48 h ; L a n e Z : T er a t e d w i ht s al t fo r
24 h : L an e 3 : T r e a te d w iht s al t fo r o h : L an e 4 : W i ld yt pe
.
理过程中 , 转基因品系比野生型植株稍高但不是
很明显 , 叶的发育和花期基本上也没多大差异 。
通过测量地上部分的鲜重和干重发现 , 转基因品
系的干重较野生型虽不是大很多 , 但却有明显的
差异 (图 6 ) 。
-门卜- G T
- 今- W下
o 占 5 0 1 0 0 1 5 0
N a C I co n ce n tar t io n (m m o比)
图 4 P C R一 S o ut h e rn 杂交验证转基因植株
F i g
·
4 T r a n s g e in e P la n t s e o ifn mr
e d b y P C R
一
S o u t h e rn b l o t i n g
L
aen
s l
一
6 : T r a n s g e n ie l ien
s: L a n e 7 : W i ld yt P
e ; Laen s
: PG S T :
L a n e g : H
Z
O
.
图 6 不同 N a O 浓度处理 G T 品系和 W T 品系引起地上部
分的千重变化
iF g
·
6 hT
e s h o o t it s s u e dyr w e i hg t o f G T a n d W T P1a n t s etr a te d
w iht N a C 1 0
,
50
,
10 0
,
15 0 r n r Qo ll/ 二
为 了检测外源基 因的表达情况 , 由图 5 的
N o rt hem 杂交可以看出外源 GS T 己在转基因拟南芥
中表达 , 野生型中没有杂交信号 。 N aC I 15 0 r n r n o F
L 处理 2 4 h , G S T m R N A 水平的表达量较低 ; 处
理 4 8 h 以后 , G S T m R N A 表达量增加 。 可能是
由于细胞 内的代谢 已稳定 , 盐胁迫下的酶促反应
机制开始启动 , 相关酶类被激活 。 这跟以前盐处
理盐地碱蓬分析 G S T m R N A 水平的结果基本一致
(王丽萍等 2 0 0 2 ) 。
.2 2 转基因拟南芥生物量变化
转基因品系和野生型植株在几种浓度 N a O 处
.2 3 转基因拟南芥谷肤甘肤含量变化
通过测量转基因品系和野生型植株总谷肤甘
肤 ( G S S G + G S H )和氧化型谷胧甘肤 (G S s G ) , 由图
7 可 以看到 , 总谷肤甘肤含量在转基因品系和野
生型 中差异很大 。 o h 时 , 差异还不很大 , 随着
处理时间的延长 , 转基因品系中的总谷胧甘肤比
野生型中的越来越高 , 到 4 8 h , 几乎是野生型中
的 2 倍 。 总谷胧甘肤含量的增加主要是由于转基
因品系中氧化型谷胧甘肤含量大幅度的增加 (图
8 )
, 导致谷肤甘肤库氧化水平发生变化 , 使
( G S S G ) / (G S S G + G S H )比值增加 (图 9 ) 。
5 期 戚元成等 : 谷胧甘肤转移酶基因过量表达能加速盐胁迫下转基因拟南芥的生长
-门卜- G T
一州卜一 W T
2 4
节m e (h )
50243 01(考ìgoEu)工SQH+95也
图 7 N ac l 巧o r n l n o比不同时间盐激下谷肤甘肤总量在 G T
和 W T 中的变化
F ig
.
7 L e v e l s o f ot tal g lu t a th i o ne in G T an d WT Plant
s du ir n g
Sal t S t比 5 5
- . - G T
. -令- W丁
0532
l J.月.
ǎ弓ì全是)`ūQS绝
o 6 24
节m e ( h )
图 8 N a C I 巧 o m m o比不同时间盐激下氧化型谷肤甘肤含
量在 G T 和 认叮 品系中的变化
F i g
.
8 L e v e l s o f o x id i z e d g l u t a th i o n e i n G T a n d W T l i
n e s
d u ir n g s al t s tr e s s
- . 一 . G T . .刊卜- 叭厅
24节m e (h )
.LrJrfk,070654210
ē%à污S的O十H甲i口5巴
图 9 N a C l l 5 0 m m o比 不同时间盐激下 G T 和 WT 品系中
的 (G S S G ) / (G S H+ G S S G )比值变化
R g
.
9 C h an g e s in (G S S G ) /(G S H + G S S G ) r a t 10 in G T an d W T
l in e s d u ir n g s a l t s etr s s
3 讨论
将 GS T c D N A 连接到双元表达载体 pR O lK l上 ,
得到双元表达载体 pG S T 。 用直接法转化土壤农杆
菌 , 验证表达载体转进农杆菌 (图 1 ) , 再用花序
浸泡法转化拟南芥 。 然后在含有卡那霉素的培养
基上筛选转化子 , 初步得到阳性植株 (图 2 ) , 进
一步用 P C R 一 S o u t h e rn 验证为阳性植株 (图 4 ) 。 将验
证为阳性植株的品系在含有卡那霉素的培养基上筛
选 , 直 到不发生分离 , 从而得到纯合子品系 (图
3A )
。 利用纯合子做了 N o rt he m 杂交来分析外源基
因的表达情况 , 结果表 明外源基因在 / N a C I 1 5 0
m m ol 几 盐激条件下经过短暂停滞表达量开始增
加 ; 野生型不存在外源 G S T 基因 , 因而没有杂交
信号 (图 5 ) 。
N a C I O
、
5 0
、
1 0 0 和 15 0 m m o l /L 胁迫 1 5 d ,
虽然转基因品系和野生型在叶的发育和花期上没有
明显可见 的差异 , 通过测地上 部分鲜重和干重 ,
发现转基因品系的干重较野生型差异明显 (图 6) 。
N a C I 1 5 0 m m o l / L 盐激处理后 , 总谷肤甘肤
含量在转基因品系中比野生型中高很多 (图 7) , 通
过分析总谷肤甘肤含量的组成情况 , 发现这种增
加主要体现在转基因品系中氧化型谷肤甘肤含量大
幅度的增加 (图 8) , 导致谷肤甘肤库氧化水平发生
变化 , 使 ( G s S G ) z ( G s s G + G S H )比值增加 (图 9 ) 。
一般认为 , G S H 对于植物耐受高盐所造成的
氧化胁迫有一定的作用 (A o n o 等 19 9 3 , B r o a d b e n t
等 1 9 9 5) , 而在我们的实验中 , 转基因植株中积
累较多的 G S S G , 这可能意味着处于高盐环境中
的拟南芥在有氧条件下体内产生了 H ZO : 和其它的
有毒代谢物质 。 H Zo : 的存在激发了外源 G S T 自身
或拟南芥内源 的 G p X (g l u t a ht i o n e p e or x i d a s e )活胜 ,
这种 G P X 活性在 H ZO : 存在的情况下将 G S H 氧化
成 G S S G , 使拟南芥体内的 G S H 库发生改变 , 恰
恰是这种改变诱发了 G S T 的活性 , 而 G S T 催化
G S H 和有毒代谢物的接合 , 使植物体将标记好 的
有毒代谢物清除 (G or n w a l d 和 p l a i s a n e e 2 9 9 5 ) 。 这
跟 N or the m 杂交结果也是相符的— 经过短暂的适应 , G s T m R N A 的量才开始升高 , 由此使转基
因植株在高盐环境下表现出一定的生长优势 。
也有可能外源 G S T 过量表达影响了谷肤甘肤
和抗坏血酸的代谢以及抗坏血酸 一 谷肤甘肤抗氧化
途径中其它酶类的表达 , 而这些酶类的表达对于植
株耐盐胁迫也有一定的补充作用 (R o xa s 等 2 0 0 0) 。
总之 , 我们实验室从盐地碱蓬中克隆并在拟
南芥中过量表达的 GS T 基因 , 无论是用 N aC I处理
盐地碱蓬分析 G召T m R N A 的表达量还是分析该基
因在拟南芥中的过量表达 , 都表明它是一个盐胁
迫相 关基因 。
参 考 文 献
A o n o M
,
K u b o A
,
S aj i H
,
T an
a k a K ( 199 3 )
.
E n h an
c e d t o le arn
c e
to Ph o t o o x id iat v e s tre
s s o f tr an s g e n i e iN c o t ia an at b
a e u m
w i t h h i g h e h lo r o P l a s t i e g lu t a t h i o n e r e d u e t a s e a c it V i ty
·
52 2 J o
ur na lf oP勿 n tPh y s勿 o ty ga d nM d l e eu阮 r B沁肠舒 20 0 4 , 30 (5 ): 5 17一 52 2
P l
a n r C e ll P h y s io l
,
34 : 1 29一 136
A ll e n R D ( 19 95 )
.
D is s e e t i o n o f o x id a t i v e s etr s s t o le r a n e e u
s
in g
t r a n s g e n ie P la n t s
.
P la n t P h夕5 10乙107 : l 一7
B o w l e r C
,
S l o o t e n L
,
V a n d
e n
b r a n d
e n
S ( 19 9 1 )
.
M a n g a n e s e
s u P e r o x i d a s e d i s m u t a s e e a n r e d u e e e e l l u l a r d a m a g e
m e d i a te d b y o x y g e n r a d ic a l s i n tr a n s g e n i c P la n t s
. 石材召O
J
,
10 : 172 3一 17 3 2
B r o
a
d b e n t P
,
C r e i s
s e n
G P
,
K u l a r B ( 19 9 5 )
.
O
x
i d a t i
v e s t r e s s
r e s P o n s e s i n t r a n s g e
n
i e t o b a e e o e o n t a i
n i n g a l t e re d l e v e l s
o f g lu ta ht i o n e re d u e t a s e a e t i v i t y
.
P al n t J
,
8 : 2 47一 255
C h o m e z y n s k i P
,
S a e e h i N ( 1 98 7 )
.
S in g l e
一 s te P m e ht o d o f R N A
i
s o l a t i o n b y a e i d g u a n i d i n i u m th i o c y a n a t e
一
P h e n o l
-
e h lo
r o of r m e x t r a e t i o n
.
A
n a
l B io
c
h
e
m
,
16 2 (1 ) : 15 6
一 1 59
G r o n w a l d J K
,
P l a i s a n e e K L ( 1 9 9 8 )
.
I s o l a t i o n a n d
e h a r a c te ir
z a t io n o f g l u at ht io n e s
一
atr n s fe
r a s e i s o z e m e s ofr m
S
o r g h
“ m ` P la n t P h y s i o l , 1 17 : 87 7一 89 2
Q i Y C (戚元成 ) , Z h a n g H (张 慧 ) , Z h a o Y X (赵彦修)
(20 02 )
.
P la n t g lu t a th i
o n e s 一 tr a n s fer
a s e a n d s a l t s t r e s
s
.
J
Sh
a n d o n g No mr
a l nU i
v
(Na
t S e i ) 「一力东师范大学学报
(自然科学版 ) ] , 17 (2 ): 7 1一 7 5 ( in e h i n e s e )
R o x a s V P
,
S m i t h R K
,
A l l e n E R
,
A l l e
n
R D ( 1 9 9 7 )
.
O v e r e
x P r e s s i o n o f g l u t at h i o n e s
一
tr an s f e r a s e /g lu ta ht i o n e
Pe
r o x i d a s e e n h a n c e s th e g r o w t h o f t r a n s g e n ic t o b a c c o
s e e d l i n g s d u ir n g s tre s s
.
aN
t B io te e h
,
15 : 9 88一 9 9 1
R o x a s V P
,
L o dh l SA
,
G a r e t t D K
,
M a h an J R
,
A l le n R D (20 00 )
.
S t
r e s s to l e r a n e e i n t r a n s g e n i c to b a e e o s e e d li n g s th a t
o v e r e x P r e s s g l u t a t h i o n e s
一
t r a n s f e r a s e / g l u t a t h i o n e
Pe r o x id a s e
.
P la n t eC ll P hy
s io l
,
4 1 : 122 9一 12 34
S a m b r o o k J
,
rF i t s
c
h E F
,
M a n i at i s T (198 9 )
.
M o le e u l ar C lo山 n g :
A L a b o r a t o r y M a n u a l
.
C o l d S P r i n g H ar b o r
,
N Y : C o l d
S Pr i n g H a r b o r L a b o r a to r y P r e s s
,
47 4一49 0
S e n G u P t a A
,
W e b b R P
,
H o l o d a y A S
,
A l le n R D ( ( 19 9 3 )
.
O v e r e x Pr e s s i o n o f s u Pe r o x i d e d i s m u t a s e Por t e c t s Pla n t s
fr o m o x id a t i v e s t r e s s
.
P al n r P妙 5 10 1, 10 3 : 106 7一 10 7 3
v a n C am
P W
,
C ap i au K
, v a n M o n t a g u e M (199 6)
.
Ehn an e e m e n t
o f o x i d at i v e s t r e s s to l e r a n e e i n t r a n s g e n i e t o b a e e o Pl a n t s
o v e印 r o d u e i n g F e 一 s u Pe r o x i d e id m u t a s e i n e h l o r o Pl a s ts .
P l
a n t P hy s io l
,
1 12 : 17 03一 17 14
w an g L p (王丽萍 ) , Q i Y e (戚元成 ) , hZ a o Y X (赵彦修) , z h an g H
(张 慧) (2 00 2 ) . C lo in n g an d s e q u e n e in g o f G s T g e n e o f
S u a eda
s a ls a a n d i t s e x P r e s s io n e h ar a c t e ir s ti e s
.
J P al n t
p h夕s i o l M口1 B i o l (植物生理与分子生物学学报 ) , 28 (2 ):
13 3一 1 36 (i n C h i n e s e )
Z h u JK (20 00 )
.
G e n e t i e a n a l y s i s o f P l an t
s al t to l e r a n c e u s i n g
A ar b id( 邓7 5 15
.
P al n t P妙 5 10 1, 12 4 : 9 4 1一 9 4 8
hZ
u JK (20 0 1 )
.
P la n t s a l t t o l e r a n e e
. 乃℃ n ds P al n t cS i , 6 : 6 6一 7 1
o v e r e x P r e s s i o n o f G S T G e n e A c e e l e r a t e s t h e G r o w t h o f rT
a n s g e n i c
A ar b i凌矽5 15 U n d e r S a l t S t r e s s
Q l uY
a n
一
C h e n g
’ 2 ` ,
Z H A N G S hi
一
M i
n ’ , W人N G L i一 p in g 3 , W A N G M i n g 一D ao ’ , Z H AN G 枷12
(’ C o l l e g e of B i o lo g i c a l eT c h n i口u e a n d oF o d s c i e n e e
,
eH
n a n A g r i e u i ru r a l nU i
v e rs ity
,
Zh e n g z h o u 4 5 0 0 0 2
,
C h in a : ZK e ) aL b
o ra to 尽 of p la n t
S r re s s 尺 e s ` a rc h of s h a n do n g 脚 rm a l nU iv e rs i ty , J i n a n 2 5 0 0 1 4 , C h in a ; 3 nI s r i t u re of p la n r p h夕5 10 10舒 a n d E c o lO舒 S h a n g h a i ln s t i r u t e s fo r
B i o lo g ic a l S e ie n c e s
,
hC i
n e s e A e a de m y of sc i
e n e e s
,
S h a n g h a i 2 0 0 0 3 2
,
C h i n a )
A b s t r a c t : T h e S u a e da
s a ls a g lu that i
o n e s
-
t r a ll s
-
fe r a s e g e n e ( G S乃 w a s i n s e rt e d d o w n s t r e a m o f
th e 3 5 5 P r o m o te r in ht e P lant
e x P re s s i o n v e c tor
p R O K 11(F ig
.
l ) a n d th e n w a s in t r o d u c e d i n t o
A r a b i d o P s i s t h a l i a n a b y A g r o b a e t e r i u m
t u m et fa
c i e n s t h r o u g h f l o r a l d i P m e t h o d
.
rT a n s fo rm an t
s w e re s e le e t e d fo r ht e i r a bi li ty t o
g ro w o n me d i
u m c o n t ia in n g k a n am y
e i n (F ig
s
.
2
,
3 )
.
T h e fa e t th a t th e G S T g e n e h a d b e e n tr a n s
-
允仃e d in t o ht e a ar b id口P s i s ht a li a n a gen o me w a s
e o n if mr
e d b y ht e P C R
一
S o u th e rn b lo t t in g a n a ly
-
5 15 (F i g
.
4 )
.
A ft e r e u l t i v a t i o n
,
in d e P e n d e n t h o
-
m o z y g o u s t r a n s g e n ie l in e s w e r e o b t a in e d a ft e r
s e le e t i o n o f T
3
P r o g e n ie s o n M S m e d iu m e o n
-
t a i n i n g k a n a m y e in
.
T h e e x Per s s io n o f th e g e n e
t r a n s fe r e d i n t o th e A ar b id op
s i s ht a l ia n a w a s
e o n if
mer
d b y N o rt h e rn b l o it n g (F ig
.
5 )
.
D u ir n g
s a l t s t r e s s
,
a n a ly s i s o f t o t a l g l u t a th io n e (b o th
o x id i z e d a n d r e d u c e d t y P e ) a n d b i o m a s s o f
tr a n s g e n i e a n d w ild A ar b id户P s is .hT e b i o m a s s o f
t r a n s g e n i e lin e s (G T ) w a s s li g h t l y b u t s ig n iif
-
c a n t ly g r e a t e r th a n th a t o f w i ld ty P e l in e (W T )
(F ig
.
6 )
,
a n d l e v e l s o f o x i d i z e d g lu t a t h i o n e
(G S S G ) w e er s ig n iif c a n t l y h ig h e r i n tr an s g e in e
l i n e s th a n i n w i ld t y P e (F ig s
.
8
,
9 )
.
T h e r e fo r e
,
o v e er xP er s s io n o f G S T e an i n er
a s e A ar b id户P s i s
g r o w th u n d e r s a l t s tr e s s
,
a n d ht i s e fe
e t e an b e
e a u s e d b y o x i d a t i o n o f ht e er d u e e d g l u t a th io n e
(G SH )
.
K e y w o r d s : g l u t a th io n e s
一
t r a n s fe r a s e : s a l t s tr e s s : A ar b id o p
s
is
o v e er x P r e s s l o n
T h i s w o r k w a s s u P Po rt e d by th e S t a t e a n d S h an d
o n g P r o v in e ia l K e y
B a s i e R e s e a r e h P r o g r a m F o u n d a t io n (G 7 9 9 9 0 1 17 0 0 )
.
*
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