全 文 ：农业生物技术学报 JournalofAgriculturalBiotechnology 2006,14 (4):533~536
*基金项目:国家自然科学基金资助项目(No.30270854)资助。
作者简介:**并列第一作者:韩国辉(1979~),男,硕士研究生;郭玉鹏(1975~),男,博士研究生。
***通讯作者。Authorforcorespondence.副研究员,博士,主要研究方向:植物分子生物学。
E-mail:.Tel:010-68919536
收稿日期:2005-05-23 接受日期:2005-06-24
·研究论文·
拟南芥CycD2基因在水稻中的表达及初步分析*
韩国辉 1,2**,郭玉朋 1,3**,卢艳敏 1,张治国 1,宛淑艳 1,郑 霞 1,廖祥儒 2,孙学辉 1***
(1.中国农业科学院生物技术研究所,北京100081;2.河北大学生命科学学院,保定071002;
3.兰州大学生命科学学院,兰州730000)
摘要：细胞周期蛋白CycD2基因是在拟南芥(Arabidopsisthaliana)基因组中发现的,对调节细胞周期具有重要作用的调控
因子。研究利用 RT-PCR技术由拟南芥幼苗 mRNA扩增了 CycD2基因,构建了超量表达载体并对单子叶植物水稻(Oryza
sativassp.japonica)进行了转化。对获得的转基因植株进行半定量 RT-PCR分析表明,CycD2mRNA的确能够在水稻中积累。
超量表达CycD2的转基因水稻植株在发育早期生长与发育加快,表现为幼苗植株根长和株高均显著高于对照(转空载体植
株),加快了水稻的生长速率。
关键词：CycD2;水稻;过量表达;根癌农杆菌
中图分类号:S188 文献标识码:A 文章编号:1006-1304(2006)04-0533-04
PrimaryAnalysisofEctopicExpressionofArabidopsisCycD2inRice
HANGuo-hui1,2**,GUOYu-peng1,3**,LUYan-min1,ZHANGZhi-guo1,WANShu-yan1,
ZHENGXia1,LIAOXiang-ru2,SUNXue-hui1***
(1.InstituteofBiotechnologyResearch,ChineseAcademyofAgriculturalScience,Beijing100081,China;2.ColegeofLifeScience,
HebeiUniversity,Baoding071002,China;3.ColegeofLifeScience,LanzhouUniversity,Lanzhou730000,China)
Abstract:CycD2hasbeenidentifiedinArabidopsisgenomefirstly,andplayedanimportantroleinregulationofcelcycle.In
thisstudyCycD2wasamplifiedfromthemRNAofArabidopsisyoungseedlingsviaRT-PCRandover-expressionvectorwas
obtainedbyinsertingthefragmentdownstream35promoterofthepCAMBIA1303vector(thereaftercaledpCAMBIA-CD2).The
vectorwasthenintroducedintorice (Oryzasativassp.japonicacv.Nipponbare)byAgrobacteria-mediatedtransformation.
Semi-quantityRT-PCRanalysisshowedthatCycD2mRNAwasaccumulatedintransgenicriceplants.Thegrowthanddevelopment
rateofCycD2transgenicplantswereaccelerated,e.g.therootlengthwaslongeraswelastheheightofyoungseedlingswashigher
thanthecontrol(transformedwithnon-recombinantvector)significantly.
Keywords:CycD2;Oryzasativa;ectopicexpression;Agrobacterium
细胞分裂是影响分生组织活性乃至植物生长速
率的主要因素。细胞周期蛋白(cyclin)是重要的细胞
分裂和细胞周期调控因子。在酵母和动物细胞中,细
胞周期蛋白增加表达会直接缩短G1期,但是这通
常会导致产生较小的细胞,或者补偿性地延长细胞
周期的其它时期(Polymenisetal.,1999)。
CycD2最早在拟南芥中发现,在G1期的早期
被激活并受蔗糖调控(Catherineetal.,2000)。Muray
etal.(2000)证明在超量表达拟南芥 CycD2(CycD2;
1)的转基因烟草植株中,从幼苗期到成熟的各个时
期,转基因植株生长和地上部分生物量积累速率加
快,细胞周期缩短。而成熟植株形态表现正常,花的
大小及株高也和正常植株相似。在细胞学上则表现
为细胞分裂速率加快,细胞周期G1期缩短,细胞周
期加快。Chriqui1etal.(2005)发现组成型表达 Cy-
cD2导致茎尖分生组织结构发生变化,CycD2可能
在这些细胞中控制着细胞分化的水平。研究拟南芥
CycD2基因在水稻(单子叶植物)中的作用并与前
农 业 生 物 技 术 学 报 2006年
人在烟草(双子叶植物)上的工作比较,在理论上有
助于了解 CycD2基因在细胞分裂上功能的保守与
进化关系,在实际应用上可以探讨利用CycD2缩短
植物的生育期,提高复种指数,提高生物产量等,具
有十分重要的意义。
1 材料和方法
1.1 水稻材料
水稻采用本实验室保存的粳稻品种日本晴 (O-
ryzasativassp.japonicacv.Nipponbare),以成熟胚盾
片的胚性愈伤组织作为受体材料。
1.2 表达载体及根癌农杆菌菌株
CycD2基因片段根据NCBI网站上公布的拟南
芥 (Arabidopsisthaliana)CycD2mRNA序列(Acces-
sionNumber:X83370)设计引物(为了便于载体构
建,引物中引入了与pCAMBIA1303的单一酶切位
点NcoⅠ和BglⅡ相匹配的核苷酸序列),通过常规
的酶切与连接反应获得由 35S启动子控制的过量
表达载体pCAMBIA-CD2(图 1)。载体质粒携带潮
霉素抗性的潮霉素磷酸转移酶(HPTⅡ)基因(在植
物中的选择标记)和卡那霉素抗性的新霉素磷酸转
移酶(NPTⅡ)基因(在细菌中的选择标记)。根癌农
杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)采用 EHA105超
毒力菌株。对照实验采用仅含pCAMBIA1303空载
体的转基因植株。
图1.质粒pCAMBIA-CD2的T-DNA区结构图
Fig.1.StructureoftheT-DNAregionofplasmid
pCAMBIA-CD2
1.3 根癌农杆菌转化及植株再生
载体质粒 pCAMBIA-CD2电击法转入根癌农
杆菌EHA105中,工程菌接种于含100mg/L卡那霉
素、20mg/L利福平、20mg/L乙酰丁香酮(AS)的AB
固体培养基,20℃培养5~6d。将根癌农杆菌转接入
AAM 液体培养基 (Hieietal.,1994)(含 2mg/L
2,4-D,700mg/L脯氨酸,20mg/LAS)中,27℃下摇
荡培养4h,菌液浓度调节至OD600值0.12左右,浸
泡直径2~3mm的胚性愈伤组织颗粒15~20min,转
移到共培养培养基上进行共培养。抗性愈伤组织的
选择以及转基因植株的再生参考Yangetal.(2004)
的方法。
1.4 转基因植株的PCR检测
CTAB法提取叶片基因组DNA。根据潮霉素磷
酸转移酶(HPTⅡ)基因设计引物,以总DNA为模板
作PCR检测。引物序列为:
正向引物:5-AAGTTCGACAGCGTCTCCGAC-3;
反向引物:5-TCTACACAGCCATCGGTCCAG-3。
1.5 转基因植株的Southernblot分析
用限制性内切酶 NcoⅠ和 BglⅡ将目的基因片
段切下,以 32P标记,作为杂交探针。对PCR阳性转
基因植株基因组 DNA用 HindⅢ酶切,电泳、转膜、
预杂交后与CycD2基因探针杂交。
1.6 转基因植株的RT-PCR分析
选取在生根培养基上生长25d的幼苗,按 Sig-
ma公司说明书,Trizol法提取根部总RNA。以Actin
基因为内参,对 CycD2基因表达水平进行半定量
PCR分析。按 Sigma公司说明书,Trizol法提取总
RNA。取 1μgRNA模板进行反转录得到 cDNA。
RT-PCR按Takara公司实验指南进行操作。CycD2
引物(RP1和RP2)根据NCBI网站上公布的拟南芥
CycD2mRNA序列 (AccessionNumber:X83370)设
计,扩增CycD2编码区内 492bp片断,引物核苷酸
序列为:
RP1:5-GAAAGACAAGGATTGGGCTGC-3;
RP2:5-CTAGTTCCCCGCACATTCTCC-3。
内参 Actin引物(A1和 A2)根据 NCBI网站上
公布的水稻 ActinmRNA序列 (AccessionNumber:
AB047313)设计,扩增 Actin编码区内 459bp的片
段,引物核苷酸序列为:
A1:5-CGCCGGTAGAAGATGGCTGA-3;
A2:5-ACGACCACTGGCATACAGAG-3。
反应体系为:2μLcDNA产物,2μL10×ExTaq
Bufer,1μLdNTP,0.5μL+0.5μLCycD2引物,0.3
μLExTaq酶,终体积为20μL。反应条件为:94℃预
变性 3min,94℃变性 30s,退火 30s(CycD2和
Actin退火温度分别为55℃和54℃),72℃延伸60
s,共30个循环。
1.7 植株的表型分析
分别选取相同时期的5棵组织培养阶段转基因
幼苗,统计根数和根长,5棵温室中的转基因幼苗,
统计株高及表型状态,各以 4棵仅含 pCAMBI-
A1303空载体的转基因植株参数的平均值做对照,
统计结果与半定量分析做比较。同时对20棵转基因
对照植株和10棵对照植株进行成组数据分析,计算
植株根长、株高的平均值,采用 SPSS8.0软件进行
差异显著性测定。
2 结果
534
第4期 韩国辉等:拟南芥CycD2基因在水稻中的表达及初步分析
2.1 转基因植株的PCR检测
随机抽取 20个独立转化植株进行 PCR检测。
以总DNA为模板进行PCR扩增,获得大小为917
bp的特异性条带,而野生型对照植株无此条带(图
2)。说明我们获得的转基因植株是阳性。
图2.转基因植株的PCR检测
Fig.2.PCRanalysisoftransgenicplants
1,对照;2~8,转基因植株;9,DNAmarker。
1,control;2~8,transgenicplants;9,DNAmarker.
2.2 转基因植株的Southernblot检测
以限制性内切酶NcoⅠ和BglⅡ从载体pCAM-
BIA-CD2将目的基因片段切下作为杂交探针,对
PCR阳性的转基因植株进行 Southernblot检测,在
被检测的 PCR阳性植株中,Southernblot均检测到
相应杂交条带(图3)。
图3.转基因植株Southernblot检测
Fig.3.Southernblotinganalysisoftransgenicplants
1~5,CycD2转基因植株;6,阴性对照。
1~5,CycD2transgenicseedlings;6,negativecontrol.
2.3 CycD2在植株根部表达的半定量分析及根的
生长发育鉴定
RT-PCR半定量分析,与内源性Actin基因表达
比较,1、2、5号转基因植株CycD2表达相对较强,而
3、4号植株CycD2表达相对较弱,而对照植株没有检
测到CycD2的表达(图3)。1、2、5号植株根长度在6
cm以上的比例分别达到 64.8%,67.5%和 73.9%,而
3、4号植株则分别为 60%和 51%,而对照(含有
pCAMBIA1303空载体的转基因植株)平均仅为16%
左右,根据半定量RT-PCR结果,显示CycD2表达水
平的高低与根的长短一致。说明CycD2的表达影响
根长,并且表达量与根长成正相关(图4,5)。
CycD2转基因植株在组织培养阶段表现为根
系发达,根长(图6)。分别随机选取20棵转基因植
株和10棵对照植株(生根培养基上生长 25d)的组
培苗测量根长,转基因与对照相比平均值相差6.420
cm(转基因苗平均值 12.76cm,对照平均值为 6.34
cm)。转基因植株与对照中根最长的幼苗做 t检验
P<0.001,表明超量表达CycD2基因植株的根长要
明显长于同一时期的对照。
图4.转基因幼苗根部CycD2基因表达半定量RT-PCR
Fig.4.Semi-quantityRT-PCRoftherootsof
transgenicseedlings
A.CycD2扩增产物;B.Actin扩增产物。
1~5,CycD2转基因植株;CK,对照。
A.CycD2;B.actin.1~5,CycD2transgenicseedlings;CK,control.
图5.生根壮苗阶段(生根培养基25d)不同长度根的比例
Fig.5.Rootslengthofseedlingsonrootingmediumfor15d
2.4 CycD2在叶片表达的半定量分析及生长发育
鉴定
25号转化体植株CycD2表达相对较强,而38
号植株 CycD2表达相对较弱,与株型一致,其它转
化体株系CycD2的表达量也与表型一致,而对照植
株CK没有检测到CycD2基因的表达(表1,图 6)。
组织培养苗移栽到温室后的初期,CycD2转基因植
株与对照相比生长状况差异明显。移栽温室中20d
后,CycD2相对于对照植株,表现生长迅速,新生叶
长势旺盛(图8)。
图6.转基因组织培养苗(生根培养基25d)根部发育情况
Fig.6.Rootsoftransgenicseedlingsonrootingmediumfor25d
CycD2,transgenicseedlings;CK,seedlingtransformedwith
non-recombinantvector.
535
农 业 生 物 技 术 学 报 2006年
表1温室中植株的生长状态
Table1Phenotypeofseedlingsgrowingingreenhouse
图7.转基因植株幼嫩叶片半定量RT-PCR
Fig.7.Semi-quantityRT-PCRoftheleaves
oftransgenicseedlings
A.CycD2扩增产物;B.Actin扩增产物。CK,对照;30、10、29、25和
38,CycD2转基因植株。
A.CycD2amplificationproduct;B.Actinamplificationproduct.CK,
control;30,10,29,25and38,CycD2transgenicseedlings,respectively.
图8.转基因植株在温室中
的生长情况
Fig.8.Seedlingsgrowingin
greenhouse
左,CycD2转基因植株;右,对照。
Left,CycD2transgenicseedling;Right,
control.
3 讨论
CycD2作为重要的细胞周期调控因子,由
Murayetal.(1995),在拟南芥中克隆并鉴定,2000
年 5月在《 自然》杂志上报道了 CycD2在烟草中的
作用之后,受到学术界的广泛重视,并将其克隆后引
入不同的生物体研究。
近年对其功能的研究显示,CycD2主要在细胞
周期的G1期发挥作用,并对蔗糖分子信号产生应
答反应。G1期是细胞周期起始期,控制着细胞接受
外界信号后产生什么样的应答。G1期在酵母、动物
和植物中是细胞周期的主要控制点。这种控制主要
是通过 Cyclin/CDK异源二聚体复合物的调控来实
现的。在哺乳动物中,G1期的主要反应机制是血清
生长因子的出现并导致CyclinD在转录水平上迅速
增加,CyclinD与 Cdk4、Cdk6结合形成 Cyclin/CDK
复合物,并将 RB(retinoblastomaprotein)磷酸化,磷
酸化的RB激活E2F转录因子,再由 E2F调控一系
列与细胞进入S期相关基因的表达。
在CycD2转基因烟草中,植株的形态和分生组
织结构都很正常,花的大小及株高和对照也都相似,
但从幼苗到成熟的各个时期,转基因植株生长速率
都比对照快,新叶起始的间隔期缩短,开花期提前
(Claireetal.,2000)。
本实验将 CycD2基因转入到水稻胚性愈伤组
织中,并获得了转基因再生植株,发现 CycD2对水
稻幼苗的根部以及生长速率有明显影响。生物信息
学分析表明,通过BLAST,只得到一条得分为42.1,
E值为5.2的短片段,因此可以认为在水稻中不存
在与拟南芥CycD2同源性很高的序列。CycD2是通
过与CDK结合形成CycD2-Cdc2a激酶复合物作用
于细胞周期的G1期,从而控制茎和根分生组织内
的细胞分裂速率(Claireetal.,2000),说明水稻中可
能存在与 CycD2结合的 CDK同源基因,CycD2有
可能在植株发育的一定阶段调节控制生长速率。总
之,CycD2基因对水稻的生理表型有重要作用,通
过CycD2基因作用机理的研究,有可能挖掘出其潜
在的应用价值。CycD2基因对水稻生长其它时期,
包括开花期、育性的影响还有待通过大田试验和性
状分离进行深入的分析研究。
致谢:感谢北京师范大学硕士研究生散丹对前期工作的
大力帮助。
参 考 文 献
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meristem(J).JournalofExperimentalBotany,2005,56(409):
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CelularBiology,2000,20(13):4513~4521
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YangYongzhi,PengHao,HuangHongmei,WuJinxia,JiaShi-
rong,HuangDafangandLuTiegang.Large-scaleproduction
ofenhancertrappinglinesforricefunctionalgenomics(J).
PlantScience,2004,167:281~288
株系
Line
CK
10
29
25
38
30
表型
Phenotype
中高,5叶Heightmiddling,5leaves
高,6叶,叶宽High,leafbroad,6leaves
中高,4叶Heightmiddling,4leaves
高壮,7叶Highandstrong,7leaves
矮弱,3叶Lowandpuny,3leaves
中高,12叶Heightmiddling,12leaves
株高/cm
Height
25
34
28
35
22
31
536