全 文 ：２０１５年０９月 四川大学学报 （自然科学版） Ｓｅｐｔ．２０１５
第５２卷　第５期 Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｉｃｈｕａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｅｄｉｔｉｏｎ） Ｖｏｌ．５２　Ｎｏ．５
收稿日期：２０１４－０２－２１
基金项目：国家８６３项目 （２０１２ＡＡ０２２２０４），国家自然科学基金 （３１１７１５８６）
作者简介：陈鹏 （１９８７－），男，重庆人，硕士，研究方向为现代生物技术，Ｅ－ｍａｉｌ：ｃｈｅｎｐｅｎｇ＿ｂｉｏ＠１６３．ｃｏｍ．
通讯作者：杨毅．Ｅ－ｍａｉｌ：ｙａｎｇｙｉ５２８＠ｖｉｐ．ｓｉｎａ．ｃｏｍ
ｄｏｉ：１０３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．０４９０－６７５６．２０１５．０９．０３０
拟南芥Ｈｓｐ４０蛋白ＡｔＤｊＡ５在
大肠杆菌中的功能分析
陈　鹏，徐西兵，胡屹玲，杨　毅
（四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室，成都６１００６４）
摘　要：通过分析大肠杆菌ｄｎａＪ 缺失菌株在４３℃下的生长表型，发现ＡｔＤｊＡ５及其Ｊ－Ｄｏ－
ｍａｉｎ能够功能性地替换ＤｎａＪ及其Ｊ－Ｄｏｍａｉｎ．免疫共沉淀实验结果表明ＡｔＤｊＡ５与ＤｎａＫ存
在相互作用．由 Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ检测推测ＡｔＤｊＡ５能够稳定大肠杆菌热激转录因子σ３２并下调热
激蛋白ＤｎａＫ表达量．这些发现说明ＡｔＤｊＡ５在大肠杆菌中具有与ＤｎａＪ相似的功能．
关键词：热激蛋白；Ｈｓｐ４０；ＤｎａＪ；ＡｔＤｊＡ５；免疫共沉淀；Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ
中图分类号：Ｑ７　　　文献标识码：Ａ　　　文章编号：
Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ　Ｈｓｐ４０
ｐｒｏｔｅｉｎ　ＡｔＤｊＡ５ｉｎ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ
ＣＨＥＮ　Ｐｅｎｇ，ＸＵ　Ｘｉ－Ｂｉｎｇ，ＨＵ　Ｙｉ－Ｌｉｎｇ，ＹＡＮＧ　Ｙｉ
（Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｂｉｏ－ｒｅｓｏｕｒｃｅ　ａｎｄ　Ｅｃｏ－ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｍｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，
Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｉｃｈｕａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｅｎｇｄｕ　６１００６４，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｂｙ　ａｎａｌｙｚｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｄｎａＪ　ｍｕｔａｎｔ　ｓｔｒａｉｎ　ａｔ　４３℃，ＡｔＤｊＡ５ａｎｄ　ｉｔｓ　Ｊ－Ｄｏｍａｉｎ
ｃａｎ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｙ　ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ　ｆｏｒ　ＤｎａＪ　ａｎｄ　ｉｔｓ　Ｊ－Ｄｏｍａｉｎ．Ｃｏ－ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｓｈｏｗ　ｔｈａｔ
ＡｔＤｊＡ５ｃａｎ　ｉｎｔｅｒａｃｔ　ｗｉｔｈ　ＤｎａＫ．Ｉｔ’ｓ　ｓｐｅｃｕｌａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ＡｔＤｊＡ５ｃａｎ　ｓｔａｂｉｌｉｚｅ　ｔｈｅ　ｈｅａｔ　ｓｈｏｃｋ　ｆａｃｔｏｒσ３２　ｏｆ
Ｅ．ｃｏｌｉ　ａｎｄ　ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｅ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｄｎａｋ　ｂｙ　ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ　ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｔｈｅｓｅ　ｆｉｎｄｉｎｇｓ　ｓｕｇｇｅｓｔ　ｔｈａｔ
ＡｔＤｊＡ５ｈａｓ　ａ　ｓｉｍｉｌａｒ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ＤｎａＪ　ｉｎ　Ｅ．ｃｏｌｉ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｈｅａｔ　ｓｈｏｃｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ；Ｈｓｐ４０；ＤｎａＪ；ＡｔＤｊＡ５；Ｃｏ－ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ；Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ
１　引　言
热激 反 应 （Ｈｅａｔ　Ｓｈｏｃｋ　Ｒｅｓｐｏｎｓｅ，简 称
ＨＳＲ）是细胞对高温胁迫的响应．热激反应中细
胞快速上调表达一系列热激蛋白 （Ｈｅａｔ　Ｓｈｏｃｋ
Ｐｒｏｔｅｉｎ，简称 Ｈｓｐ），包括分子伴侣和蛋白酶等，
形成一个适合蛋白质折叠的环境［１］，以此应对高
温对细胞的损害．大肠杆菌ＤｎａＫ （Ｈｓｐ７０）分子
伴侣系统 （ＤｎａＫ／ＤｎａＪ／ＧｒｐＥ）在正常生理条件
和胁迫条件下，都发挥着重要的作用，例如新生
肽链的折叠，多聚蛋白的聚合与解聚，信号转导
以及变性蛋白的复性等［２］．此外，ＤｎａＫ分子伴侣
系具有调控热激反应的功能，ＤｎａＫ／ＤｎａＪ通过与
热激转录因子σ３２的特异结合，并使其被锚定在细
胞膜上的蛋白酶ＦｔｓＨ降解，从而调控整个热激反
应［３］．
Ｈｓｐ４０是ＤｎａＪ及其同源蛋白的总称，因其具
有７０个氨基酸左右的高度保守区域，即Ｊ－Ｄｏ－
　 四川大学学报 （自然科学版） 　 第５２卷
ｍａｉｎ，故又被称为Ｊ蛋白．Ｊ－Ｄｏｍａｉｎ是与ＤｎａＫ结
合并激活其ＡＴＰ酶活力的主要区域．Ｈｓｐ４０可分
为三类，第一类 Ｈｓｐ４０含有４个结构域，除Ｎ端
的Ｊ－Ｄｏｍａｉｎ，还有Ｇ／Ｆ区，锌指结构域和一个不
太保守的Ｃ端结构域；第二类 Ｈｓｐ４０缺少锌指结
构域；第三类 Ｈｓｐ４０仅含有Ｊ－Ｄｏｍａｉｎ［４］．拟南芥
基因组中含有８个不同基因编码的第一类Ｈｓｐ４０，
分别定位在细胞质、叶绿体、线粒体或内质网中．
拟南芥 ＡｔＤｊＡ５ （基因编号：ＡＴ４Ｇ３９９６０）蛋白
是定位于叶绿体的第一类 Ｈｓｐ４０，其Ｎ端含有一
段疏水的定位信号［５］．而ＡｔＤｊＡ５在拟南芥中的功
能研究未见报道．来源于不同物种的 Ｈｓｐ４０在大
肠杆菌中的功能研究已有报道，例如来自酵母线
粒体的 Ｍｄｊ１ｐ （第一类 Ｈｓｐ４０）能够弥补大肠杆
菌ｄｎａＪ突变菌株的热敏感表型，其Ｊ－Ｄｏｍａｉｎ能
够功能性替换 ＤｎａＪ的Ｊ－Ｄｏｍａｉｎ［６］，而来自高等
植物的 Ｈｓｐ４０鲜有相关研究．
鉴于ＤｎａＪ和植物来源ＡｔＤｊＡ５在氨基酸序列
上的相似性，本研究尝试解答 ＡｔＤｊＡ５能否替代
ＤｎａＪ在大肠杆菌中的作用．
２　材料和方法
２．１　实验材料
菌株：大肠杆菌ｄｎａＪ 缺失菌株 ＭＦ６３４及大
肠杆菌ＤＨ５α、Ｒｏｓｅｔｔａ和 Ｗ３１１０为本实验室保
存．
质粒：ｐＥＴ２８ａ、ｐＢＡＤ２４由本实验室保存；
ｐＭＤ１９－Ｔ购于Ｔａｋａｒａ．
试剂：ＲＮＡ提取试剂盒、ＤＮＡ凝胶回收试
剂盒和质粒提取试剂盒购于 ＴＩＡＮＧＥＮ；反转录
试剂盒购于ＴＯＹＯＢＯ；Ｔ４ＤＮＡ连接酶和限制性
内切酶购于Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ；ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｍａｋｅｒ、ＦａｓｔＰｆｕ
高保真酶购于 Ｔｒａｎｓｇｅｎ；Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ／Ｇ　ＰＬＵＳ－
Ａｇａｒｏｓｅ免疫共沉淀试剂购于ＳＡＮＴＡ　ＣＲＵＺ；二
抗、ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ化学发光试剂和超滤管购于
Ｍｉｌｉｐｏｒｅ；ＤｎａＫ 蛋白购于 Ｅｎｚｏ；ａｎｔｉ－ＤｎａＫ 和
ａｎｔｉ－Ｈｉｓ抗体购于Ａｂｃａｍ；ａｎｔｉ－σ３２抗体购于Ｎｅｏ－
Ｃｌｏｎｅ．
２．２　实验方法
２．２．１　载体构建　ｐＥＴ２８ａ－ＡｔＤｊＡ５和ｐＢＡＤ２４－
ＡｔＤｊＡ５重组载体构建．以反转录合成的拟南芥
ｃＤＮＡ为模板，再以表１中ＡｔＤｊＡ５ （Ｓｅｎｓｅ＋Ａｎ－
ｔｉｓｅｎｓｅ）引物ＰＣＲ扩增ＡｔＤｊＡ５基因片段 （去掉
了Ｎ端信号肽部分）．ＰＣＲ产物与ｐＭＤ１９－Ｔ连接
并转化ＤＨ５α，筛选阳性克隆．提取质粒，进行双
酶切验证后测序鉴定．经 ＮｈｅⅠ和ＳａｌⅠ消化的
ＡｔＤｊＡ５目的片段和ｐＥＴ２８ａ载体片段进行连接，
获得ｐＥＴ２８ａ－ＡｔＤｊＡ５重组载体．再以 ＮｃｏⅠ和
ＳａｌⅠ消化ｐＥＴ２８ａ－ＡｔＤｊＡ５和ｐＢＡＤ２４，分别回
收 ＡｔＤｊＡ５和 ｐＢＡＤ２４片段并进行连接，得到
ｐＢＡＤ２４－ＡｔＤｊＡ５重组载体．
ｐＢＡＤ２４－ＤｎａＪ重组载体构建．利用大肠杆菌
Ｗ３１１０基因组作为模板，以表１中ＤｎａＪ （Ｓｅｎｓｅ
＋Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）引物，ＰＣＲ扩增 ＤｎａＪ并进行 ＴＡ
克隆．利用 ＮｃｏⅠ和ＳａｌⅠ消化ｐＭＤ１９－ＤｎａＪ和
ｐＢＡＤ２４，回收相应目的基因和载体片段并连接，
得到ｐＢＡＤ２４－ＤｎａＪ重组载体．
ｐＢＡＤ２４－ＡｔＤｊＡ５－Ｊ嵌合蛋白重组载体构建．
以 ｐＭＤ１９－ＡｔＤｊＡ５ 为 模 板， 表 １ 中 ＡｔＤｊＡ５
（Ｓｅｎｓｅ）和 ＡｔＤｊＡ５ＪＤ （Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）为 引 物，
ＰＣＲ扩增ＡｔＤｊＡ５的Ｊ－Ｄｏｍａｉｎ片段，经ＴＡ克隆
获得ｐＭＤ１９－ＡｔＤｊＡ５ＪＤ．以ｐＭＤ１９－ＤｎａＪ为模板，
表１中ＤｎａＪ７０－３７６ （Ｓｅｎｓｅ）和ＤｎａＪ（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）
为引物，ＰＣＲ扩增ＤｎａＪ去掉Ｊ－Ｄｏｍａｉｎ剩下的部
分 （ＤｎａＪ的７０到３７６位氨基酸残基），ＴＡ克隆
获得ｐＭＤ１９－ＤｎａＪ７０－３７６．利用ＢａｍＨⅠ和ＳａｌⅠ
消化ｐＭＤ１９－ＤｎａＪ７０－３７６和ｐＥＴ２８ａ，回收相应目
的基因和载体片段并连接，获得ｐＥＴ２８ａ－ＤｎａＪ７０－
３７６．再利用ＮｈｅⅠ和ＢａｍＨⅠ消化ｐＭＤ１９－ＡｔＤ－
ｊＡ５ＪＤ和ｐＥＴ２８ａ－ＤｎａＪ７０－３７６，回收相应目的基
因和载体片段并连接，获得ｐＥＴ２８ａ－ＡｔＤｊＡ５－Ｊ重
组质粒．最后利用 ＮｃｏⅠ和ＳａｌⅠ消化ｐＥＴ２８ａ－
ＡｔＤｊＡ５－Ｊ和ｐＢＡＤ２４，回收相应目的基因和载体
片段并连接，获得ｐＢＡＤ２４－ＡｔＤｊＡ５－Ｊ重组质粒．
２．２．２　细菌生长表型试验　将构建的ｐＢＡＤ２４－
ＡｔＤｊＡ５、ｐＢＡＤ２４－ＡｔＤｊＡ５－Ｊ、ｐＢＡＤ２４－ＤｎａＪ 和
ｐＢＡＤ２４分别转化大肠杆菌ｄｎａＪ缺失菌株．分别
挑取新转化平板上的单菌落，３７℃过夜培养，按
１∶１００转接至新鲜 ＬＢ培养基 （含５０μｇ／ｍＬ
Ａｍｐ）中，培养至 ＯＤ６００为０．６时，各收集１ｍＬ
菌液，用无菌水梯度稀释 （１００～１０－４），每个梯度
各取５μＬ滴于含５０μｇ／ｍＬ　Ａｍｐ和０．５％Ｌ－阿拉
伯糖的２个ＬＢ固体培养基上，分别置于３７℃和
４３℃培养约１６ｈ，照相记录菌落生长情况．实验
重复３次．
８１１１
第５期 　　 陈　鹏，等：拟南芥 Ｈｓｐ４０蛋白ＡｔＤｊＡ５在大肠杆菌中的功能分析 　
表１　本研究使用的引物
Ｔａｂ．１　Ｔｈｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ
Ｐｒｉｍｅｒ　Ｎａｍｅ　 Ｐｒｉｍｅｒ
Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　Ｅｎｚｙｍｅ
Ｃｕｔｔｉｎｇ　Ｓｉｔｅ
ＡｔＤｊＡ５ Ｓｅｎｓｅ　 ５′－ＣＴＡＧＣＴＡＧＣＧＡＴＴＴＣＴＡＴＴＣＴＧＴＣＣＴＴＧＧＡＧＴＣＴ－３′ ＮｈｅⅠ
Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　 ５′－ＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＴＡＴＣＴＣＣＴＧＣＴＡＴＴＡＧＣＴＡＣＣＴＴＧ－３′ ＳａｌⅠ
ＡｔＤｊＡ５ＪＤ　 Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　 ５′－ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＴＡＴＣＴＧＴＣＧＴＡＴＡＧＡＧＡＴＣＴＴＴＴＣ－３′ ＢａｍＨⅠ
ＤｎａＪ　 Ｓｅｎｓｅ　 ５′－ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＣＴＡＡＧＣＡＡＧＡＴＴＡＴＴＡＣＧＡＧＡ－３′ ＮｃｏⅠ
Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　 ５′－ＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＴＡＧＣＧＧＧＴＣＡＧＧＴＣＧＴＣＡＡＡＡＡＡＣ－３′ ＳａｌⅠ
ＤｎａＪ７０－３７６ Ｓｅｎｓｅ　 ５′－ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＧＴＣＡＴＧＣＴＧＣＧＴＴＴＧＡＧＣＡＡＧＧＴＧ－３′ ＢａｍＨⅠ
２．２．３　蛋白纯化　将构建的ｐＥＴ２８ａ－ＡｔＤｊＡ５重
组载体转化大肠杆菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）．活化后的菌
株３７℃培养至 ＯＤ６００为０．６时，加ＩＰＴＧ至终浓
度为０．２ｍＭ，１６℃诱导培养１２ｈ．离心收集菌
体，超声破碎后离心收集上清，用０．２２μｍ滤膜
过滤．按照Ｎｉ－ＮＴＡ树脂纯化手册进行蛋白纯化．
２．２．４　免疫共沉淀　将纯化的１．２５μＭ　ＡｔＤｊＡ５
与０．５μｇ的ＤｎａＫ加入到预冷的３００μＬ　ｂｕｆｆｅｒ　Ｋ
（３０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ／ＫＯＨ，ｐＨ　７．６，４０ｍＭ　ＫＣｌ，５０
ｍＭ　ＮａＣｌ，１ｍＭ　ＤＴＴ，７ｍＭ 醋酸镁），冰上孵
育３０ｍｉｎ；加入１μｇ　ａｎｔｉ－Ｈｉｓ抗体，冰上孵育１
ｈ；之后加入２０μＬ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ／Ｇ　ｐｌｕｓ－ａｇａｒｏｓｅ　ｉｍ－
ｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ　ｒｅａｇｅｎｔ，冰上孵育２ｈ；将孵育
后的混合液于４℃下１０００ｇ离心５ｍｉｎ，弃去上
清，然后用１ｍＬ　ＰＢＳ　ｂｕｆｆｅｒ清洗４次．将沉淀重
悬于１×ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上样缓冲液中，利用ａｎｔｉ－
ＤｎａＫ的一抗，按照分子克隆指南 （第三版）的方
法进行蛋白质免疫印迹［７］．
２．２．５　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ检测σ３２和ＤｎａＫ蛋白表达
量　将构建的 ｐＢＡＤ２４－ＡｔＤｊＡ５、ｐＢＡＤ２４－ＤｎａＪ
和ＰＢＡＤ２４转化大肠杆菌ｄｎａＪ 缺失菌株，分别
挑取新转化平板上的单菌落，３７℃过夜培养后按
１∶１００转接至新鲜 ＬＢ 培养基 （含 ５０μｇ／ｍＬ
Ａｍｐ）中，培养ＯＤ６００至０．６时，添加Ｌ－阿拉伯糖
至终浓度为０．５％ ，３０℃诱导培养１ｈ，测ＯＤ６００
值，将上述三个菌液ＯＤ６００值调为一致，４℃收集
等量菌体．加等量上样缓冲液，并分别上样５μＬ
（检测 ＤｎａＫ 时，样品均稀释２０倍）进行ＳＤＳ－
ＰＡＧＥ电泳，分别利用ａｎｔｉ－σ３２和ａｎｔｉ－ＤｎａＫ抗体，
按照分子克隆指南 （第三版）的方法进行蛋白质
免疫印迹［７］．
３　结果与分析
３．１　ＡｔＤｊＡ５对大肠杆菌ｄｎａＪ 缺失菌株的热敏
感表型补偿
本研究选用对温度敏感的大肠杆菌ｄｎａＪ 缺
失菌株 （该菌株在４３℃下存活率低），以分别转化
ｐＢＡＤ２４和ｐＢＡＤ２４－ＤｎａＪ的ｄｎａＪ 缺失菌株作为
阴性和阳性对照，用 ＡｔＤｊＡ５回补ｄｎａＪ 缺失菌
株，进行生长表型试验．结果显示：４３℃热处理条
件下，重组 ｐＢＡＤ２４－ＡｔＤｊＡ５菌株与阳性对照
（含有ｐＢＡＤ２４－ＤｎａＪ的菌株）的生存能力没有明
显差异，其克隆子形成率均高出阴性对照 （含有
ｐＢＡＤ２４的菌株）两个数量级 （图１）．表明ＡｔＤ－
ｊＡ５能够功能性替代ＤｎａＪ补偿大肠杆菌ｄｎａＪ 缺
失菌株对高温的敏感，使大肠杆菌ｄｎａＪ 缺失株
在４３℃下能正常生长．
图１　表达 ＡｔＤｊＡ５的大肠杆菌ｄｎａＪ 缺失菌株在
４３℃下的生长表型分析
Ｆｉｇ．１　Ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｅ．ｃｏｌｉ
ｄｎａＪ　ｍｕｔａｎｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ　ＡｔＤｊＡ５ａｔ　４３℃
３．２　ＡｔＤｊＡ５的Ｊ－Ｄｏｍａｉｎ功能
通过对 ＡｔＤｊＡ５与ＤｎａＪ的Ｊ－Ｄｏｍａｉｎ进行比
对发现，二者一致性为５５％，且ＡｔＤｊＡ５的Ｊ－Ｄｏ－
ｍａｉｎ序列中具有标识性的 ＨＰＤ三联体氨基酸序
９１１１
　 四川大学学报 （自然科学版） 　 第５２卷
列 （图２Ａ）．用ＡｔＤｊＡ５的Ｊ－Ｄｏｍａｉｎ替换ＤｎａＪ的
Ｊ－Ｄｏｍａｉｎ，构建了ｐＢＡＤ２４－ＡｔＤｊＡ５－Ｊ嵌合蛋白重
组载体．利用ｄｎａＪ 缺失菌株，进行生长表型试
验，结果显示重组ｐＢＡＤ２４－ＡｔＤｊＡ５－Ｊ菌株与阳性
对照 （含有ｐＢＡＤ２４－ＤｎａＪ的菌株）生存率一致，
并且均高出阴性对照 （含有ｐＢＡＤ２４的菌株）至
少两个数量级 （图２Ｂ）．表明ＡｔＤｊＡ５的Ｊ－Ｄｏｍａｉｎ
能够功能性替换大肠杆菌ＤｎａＪ的Ｊ－Ｄｏｍａｉｎ，使大
肠杆菌ｄｎａＪ缺失菌株在４３℃下能正常生长．
图２　表达 ＡｔＤｊＡ５－Ｊ嵌合蛋白的大肠杆菌ｄｎａＪ 缺
失菌株在４３℃下的生长表型分析
Ａ：ＤｎａＪ和ＡｔＤｊＡ５的Ｊ－Ｄｏｍａｉｎ序氨基酸列比对；Ｂ：表达
ＡｔＤｊＡ５－Ｊ嵌合蛋白的大肠杆菌ｄｎａＪ 缺失菌株在４３℃下的
生长情况分析．
Ｆｉｇ．２　Ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ｄｎａＪ
ｍｕｔａｎｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ　ＡｔＤｊＡ５－Ｊ　ｃｈｉｍｅｒａ　ａｔ　４３℃
Ａ：Ａｎ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｊ－Ｄｏｍａｉｎ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｂｅｔｗｅｅｎ
ＤｎａＪ　ａｎｄ　ＡｔＤｊＡ５；Ｂ：Ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｅ．
ｃｏｌｉ　ｄｎａＪ　ｍｕｔａｎｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ　ＡｔＤｊＡ５－Ｊ　ｃｈｉｍｅｒａ　ａｔ　４３℃
３．３　ＡｔＤｊＡ５与ＤｎａＫ相互作用
ＡｔＤｊＡ５蛋白纯化结果如图３Ａ，目的条带大
小约４５ｋＤ与预测一致．为了检测ＡｔＤｊＡ５能否与
ＤｎａＫ相互作用，本研究使用纯化的 ＡｔＤｊＡ５和
ＤｎａＫ与ａｎｔｉ－Ｈｉｓ抗体进行免疫共沉淀实验 （表
达的ＡｔＤｊＡ５目的蛋白带有６×Ｈｉｓ标签，而购买
的ＤｎａＫ蛋白不含 Ｈｉｓ标签），并利用ａｎｔｉ－ＤｎａＫ
抗体进行 Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ检测．结果显示在经ａｎｔｉ－
Ｈｉｓ抗体共沉淀的蛋白中，能够检测到ＤｎａＫ条带
（图３Ｂ箭头所指处），表明ＡｔＤｊＡ５与ＤｎａＫ之间
存在相互作用．
图３　免疫共沉淀分析ＡｔＤｊＡ５与ＤｎａＫ之间的相互作用
Ａ：带 Ｈｉｓ标签ＡｔＤｊＡ５的纯化；Ｂ：免疫共沉淀分析 ＡｔＤ－
ｊＡ５与ＤｎａＫ的相互作用
Ｆｉｇ．３　Ｃｏ－ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｉｎｔｅｒａｃ－
ｔｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ＡｔＤｊＡ５ａｎｄ　ＤｎａＫ
Ａ：Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｈｉｓ　ｔａｇｅｄ　ＡｔＤｊＡ５；Ｂ：Ｃｏ－ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉ－
ｔａｔｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ＡｔＤｊＡ５ａｎｄ　ＤｎａＫ
３．４　ＡｔＤｊＡ５的表达对大肠杆菌内源蛋白σ３２和
ＤｎａＫ的影响
将分别转化了 ｐＢＡＤ２４－ＡｔＤｊＡ５、ｐＢＡＤ２４－
ＤｎａＪ和 ｐＢＡＤ２４的大肠杆菌ｄｎａＪ 缺失菌株，
３０℃诱导培养１ｈ，分别收集等量菌体，分别利用
ａｎｔｉ－σ３２和ａｎｔｉ－ＤｎａＫ抗体进行ｗｅｓｔｅｒｈ　ｂｌｏｔ检测．
结果显示诱导表达 ＡｔＤｊＡ５明显提高了热休克转
录因子σ３２蛋白的表达量 （利用 Ｂｉｏ－Ｒａｄ　Ｉｍａｇｅ
Ｌａｂ　４．１软件计算条带灰度值，与ｐＢＡＤ２４对照相
比，σ３２蛋白的表达量提高了１２倍），甚至高于诱
导表 达 ＤｎａＪ 提 高 的 σ３２ 蛋 白 的 表 达 量 （与
ｐＢＡＤ２４对照相比，σ３２蛋白的表达量提高了５
倍）；而表达 ＡｔＤｊＡ５ 和 ＤｎａＪ蛋白的菌株与
ｐＢＡＤ２４对照菌株相比，内源蛋白 ＤｎａＫ的蛋白
量均下降 （二者与ｐＢＡＤ２４对照的ＤｎａＫ蛋白量
比值分别为０．５５和０．４２） （图４）．推测 ＡｔＤｊＡ５
具有与ＤｎａＪ相似的功能，可以稳定热休克转录因
子σ３２，并使热激蛋白ＤｎａＫ的表达量下调．
图４　 Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ分 析 分 别 转 化 了 ｐＢＡＤ２４、
ｐＢＡＤ２４－ＤｎａＪ或ｐＢＡＤ２４－ＡｔＤｊＡ５的大肠杆
菌ｄｎａＪ缺失菌株的σ３２和ＤｎａＫ蛋白
Ｆｉｇ．４　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆσ３２　ａｎｄ　Ｄｎａｋ　ｏｆ　Ｅ．
ｃｏｌｉ　ｄｎａＪ　ｍｕｔａｎｔ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｗｉｔｈ　ｐＢＡＤ２４，
ｐＢＡＤ２４－ＤｎａＪ　ｏｒ　ｐＢＡＤ２４－ＡｔＤｊＡ５
０２１１
第５期 　　 陈　鹏，等：拟南芥 Ｈｓｐ４０蛋白ＡｔＤｊＡ５在大肠杆菌中的功能分析 　
４　讨　论
Ｊ－Ｄｏｍａｉｎ是 Ｈｓｐ４０与 Ｈｓｐ７０相互作用的主
要区域，替换Ｊ－Ｄｏｍａｉｎ中 ＨＰＤ三联体中任一残
基将丧失激活 Ｈｓｐ７０ＡＴＰ酶活力能力［９］，替换
ＤｎａＪ的Ｊ－Ｄｏｍａｉｎ螺旋Ⅱ和螺旋Ⅲ上的一些残基
（例如：Ｙ２５Ａ，Ｋ２６Ａ和Ｆ４７Ａ）也导致完全丧失
Ｊ－Ｄｏｍａｉｎ功能［１０］．体外实验显示单独的Ｊ－Ｄｏｍａｉｎ
不能激活 ＤｎａＫ的 ＡＴＰ酶活力；Ｊ－Ｄｏｍａｉｎ连同
Ｇ／Ｆ区域 （ＤｎａＪ１２）能够行使部分ＤｎａＪ在体内
的功能，体外实验显示ＤｎａＪ１２能够激活ＤｎａＫ的
ＡＴＰ酶活力，表明这一区段是ＤｎａＪ分子伴侣功
能最小决定区［１１］．酵母线粒体 Ｈｓｐ４０Ｍｄｊ１ｐ能够
抑制大肠杆菌ｄｎａＪ 缺失菌株的高温生长缺陷，
能够与大肠杆菌ＤｎａＫ相互作用，并且在体外实
验中能够替代ＤｎａＪ在ＤｎａＫ系统中重折叠变性的
荧光素酶［１２，１３］．Ｊ－Ｄｏｍａｉｎ替换实验表明，不仅酵
母线粒体 Ｈｓｐ４０蛋白 Ｍｄｊ１ｐ，还包括人类 Ｈｓｐ４０
蛋白 Ｈｄｊ１以及噬菌体Ｊ蛋白Ｒｋｉ等的Ｊ－Ｄｏｍａｉｎ
都能功能性替换大肠杆菌ＤｎａＪ的Ｊ－Ｄｏｍａｉｎ［４，１４］．
本研究中，ＡｔＤｊＡ５是定位于拟南芥叶绿体的
第一类 Ｈｓｐ４０，与大肠杆菌 ＤｎａＪ序列相似度为
３４．４％，其中Ｊ－Ｄｏｍａｉｎ序列相似度达到５５％，并
且ＡｔＤｊＡ５的Ｊ－Ｄｏｍａｉｎ包含保守的 ＨＰＤ三联体．
Ｊ－Ｄｏｍａｉｎ替换实验表明 ＡｔＤｊＡ５的Ｊ－Ｄｏｍａｉｎ能
够功能性替代ＤｎａＪ的Ｊ－Ｄｏｍａｉｎ，并且细菌生长
表型试验表明 ＡｔＤｊＡ５能够替代 ＤｎａＪ，使ｄｎａＪ
缺失菌株在４３℃下恢复正常生长．暗示 ＡｔＤｊＡ５
在大肠杆菌中可能行使与ＤｎａＪ类似的生理功能．
接下来通过免疫共沉淀实验表明ＡｔＤｊＡ５和ＤｎａＫ
存在相互作用，进一步说明了 ＡｔＤｊＡ５可能通过
与ＤｎａＫ相互作用，实现其在大肠杆菌中的生物
学功能．
ＤｎａＫ分子伴侣系统的一个重要作用是调控
依赖σ３２的大肠杆菌热激反应．正常情况下，ＤｎａＫ
和ＤｎａＪ能够结合σ３２并使其被细胞膜锚定的蛋白
酶ＦｔｓＨ降解，从而调节自身以及其他受σ３２调控
的热激蛋白的合成．热胁迫条件下，未折叠蛋白与
聚集体蛋白招募ＤｎａＫ等分子伴侣，σ３２与ＤｎａＫ／
ＤｎａＪ分离，从而稳定了σ３２，导致σ３２结合到ＲＮＡ
聚合酶，从而引起下游热激蛋白的表达［１］．研究表
明大肠杆菌ＤｎａＫ、ＤｎａＪ 或ＧｒｐＥ 任一基因突
变，甚至在非热激条件下也会导致热激基因上调
表达［１５，１６］．Ｗａｌ等发现在ｄｎａＪ突变株中ＤｎａＪ１２
能够下调热激报告基因的表达［１１］；Ｄｅｌｏｃｈｅ等发
现利用同样的报告菌株，酵母线粒体 Ｍｄｊ１ｐ
（Ｈｓｐ４０）不能下调热激报告基因的表达［１３］．
本研究发现，在３０℃非胁迫条件下，ｄｎａＪ缺
失株中过表达 ＡｔＤｊＡ５能够有效下调热激蛋白
ＤｎａＫ表达量．值得注意的是回补ＤｎａＪ不但没有
导致σ３２量的下降反而提高了５倍左右，又由于下
游ＤｎａＫ的表达量明显下降，暗示σ３２与ＲＮＡ聚
合酶的结合受到了抑制．推测过量的ＤｎａＪ与σ３２结
合，导致ＤｎａＫ蛋白量相对降低，致使σ３２降解速
率降低，从而稳定了σ３２．值得注意的是 ＡｔＤｊＡ５
甚至高于ＤｎａＪ提高σ３２的表达量．如何解释导致这
一现象的原因，需要进行进一步的研究．
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