全 文 ：1999-09-06收到 , 2000-01-10接受。
国家(编号 39770075)及河北省(编号 397369)自然科学基金资助项目。
＊联系人 , E-mail:appb@sj-user.he.cninfo.net。
缩写　EGTA:Ethylene glycol-bis(β-amino ethyl ether)-N , N , N , N -te-
traacetic acid;TFP:Trifluoperazine;CPZ:Chlorpromazine。
钙-钙调素与小麦苗中热激蛋白的诱导
樊志和1　周人纲1＊　李晓芝1　白　娟2
(1河北省农林科学院农业物理生理生化研究所 ,石家庄 050051;2河北师范大学生物系分子细胞生物学研究室 ,石家庄 050016)
摘要:在 34℃热激条件下 , 种子经钙预处理的小麦苗
中的钙调素含量随着热激时间的延长而增加 , 热激 90
min时达最大值 , 而种子用钙离子螯合剂 EGTA预处理
的小麦苗中钙调素含量无明显增加。种子用 EGTA 及
钙调素拮抗剂 CPZ 和 TFP 预处理的小麦幼苗在 34℃
热激时 ,热激蛋白的合成量减少。 4 d 的小麦幼苗在
34℃或 37℃热激条件下 , 能诱导耐热性的获得 , 分别
用EGTA、钙离子通道阻断剂易博定 、钙调素拮抗剂
TFP或 CPZ 预处理种子后 , 所得幼苗热诱导的耐热性
的提高程度有所下降。
关键词:钙 , 钙调素 ,热激蛋白 , 耐热性 ,小麦
学科分类号:Q945
　　生物在高温下 ,能合成一套新的蛋白 ,人们称
它们为热激蛋白 (heat shock protein ,HSP),已经证
明热激蛋白的诱导产生是生物界的普遍现象 。大
量的研究表明热激蛋白具有分子伴侣的功能 ,在细
胞生命活动中起重要作用 ,热激蛋白的诱导能使生
物获得耐热性 (Georgopoulos和Welch 1993 , Schoffl
等1998)。因此研究热刺激如何引起热激蛋白的
产生 ,即热激信号转导 ,对于进一步研究热激蛋白
的功能有重要意义 。Ca2+作为植物细胞中被证实
的主要胞内信使受到广泛关注 (孙大业 等 1998)。
热激蛋白的早期研究已表明 Ca2+促进热激蛋白的
合成(Kleinh和 Ferguson 1987), 在热激过程中细胞
质内 Ca2+浓度的提高也已有报告(Gong 等 1998)。
钙调素(calmodulin ,CaM)是 Ca2+的重要受体蛋白 ,
但到目前为止 ,还未见有 CaM 与热激蛋白诱导合
成的关系的报告 。本文报告了Ca2+-CaM信号系统
在热激蛋白诱导合成及耐热性的获得中的作用。
1　材料与方法
1.1　实验材料
小麦(triticum aestivum L.)品系 90-80 ,来自河
北省农林科学院理化所 。带有马铃薯 CaM 基因的
质粒 PCM6来自 Professor B.W.Poovaiah , Laboratory
of Plant Molecular Biology and Physiology , Department
of Horticulture , Washington State University , USA 。兔
抗 CaM 血清由河北师范大学生物系分子细胞实验
室提供。
1.2　生长条件及种子处理
小麦种子在蒸馏水或几种效应剂(CaCl2 , 钙离
子螯合剂 EGTA ,钙离子通道阻断剂易博定 , 钙调
素拮抗剂 TFP 和 CPZ)中浸泡过夜 ,排列于铺有 3
层滤纸的培养皿中 ,在 22℃生长箱中暗培养 。小
麦幼苗的热激(HS)处理在 34℃或37℃生长箱暗中
进行 。小麦的生长及热激处理期间保持生长箱内
空气潮湿 。文中效应剂预处理均指种子经效应剂
预处理 ,生长期间一律用蒸馏水浇水 ,生长一定时
间后的幼苗进行热激处理。
1.3　钙调素含量测定
取小麦幼苗上部 3 cm 的切段 ,称取 1.5 g ,用
蒸馏水洗净后吸干水分 ,在液氮中研磨 ,再加 1.5
ml的提取液[ Tris-HCl 50 mmol/L , pH 8.0 , EGTA 1
mmol/L ,PMSF(苯甲基磺酰氟)0.5 mmol/L ,NaHSO3
20mmol/L , NaCl 0.15 mol/L] , 匀浆后超声破碎 。
破碎后的匀浆液在 90℃水浴中处理 3 min ,冷却后
再用 TGL-16G高速台式离心机于7 000×g 离心30
min ,上清液用于 CaM 的测定及可溶性蛋白测定 。
CaM 的定量测定用赵升皓等 (1988)的 ELISA 方
法。可溶性蛋白按 Bradford(1976)的方法测定 。
1.4　热激蛋白的诱导合成
热激蛋白的体内标记按周人纲等(1994)的方
法进行 。电泳参照 Laemmli(1970)的方法 , 在
12.5%的 SDS聚丙烯酰胺凝胶中电泳 ,0.25%考马
斯亮兰 R-250 染色。35S-蛋氨酸掺入蛋白质的分析
依据Mans(1961)的滤纸盘法 ,用 PACKARD公司的
TRI-CARB 2200CA型液闪仪计数 。
1.5　细胞生活力测定
细胞生活力的测定采用 Chen等(1982)的红四
331植物生理学报 , Acta Phytophysiologica Sinica　2000 , 26(4):331 ～ 336
氮唑(triphenyl tetrazolium chloride , TTC)方法 ,略加
改进:4 d的幼苗经 34℃热激 6 h 后在 22℃恢复 1
h 。切去幼苗上部 0.5 cm的顶端部分 ,向下取 1.5
cm 的切段为实验材料。每项实验设 3个重复 ,每
个重复用 10个切段 。切段用蒸馏水冲洗干净吸干
水分 ,放入置于(50±1)℃的恒温水浴中的具塞试
管内 ,试管内含 0.1 ml蒸馏水 ,放置一定时间后 ,
立即从水浴中取出用自来水冲凉至室温 。加 3 ml
TTC溶液(0.08%TTC , 50 mmol/L 的磷酸缓冲液 ,
pH 7.4),在20℃恒温箱中放置 20 h ,切段用蒸馏水
洗去残存的TTC ,加 5 ml 95%乙醇 ,在 20℃恒温下
暗中提取色素 ,提取液用 721分光光度计在 485 nm
处比色。
1.6　细胞膜热稳定性分析
用膜伤害度来衡量细胞膜的热稳定性。4 d的
小麦幼苗经 37℃热激 8 h后在 22℃下恢复 1 h ,该
幼苗作为细胞膜热稳定性的实验材料 ,取样同 1.5
节中细胞生活力测定。切段用无离子水冲洗 3次
后吸干水分 ,放入置于(50±1)℃的恒温水浴中的
小瓶中(内含 5 ml 0.01%吐温-40),放置一定时间
后 ,再加 5ml无离子水 ,于 25℃下震荡1 h ,用DDS-
11A型电导仪测定电解质的渗漏 ,电解质渗漏量的
测定及伤害度的计算按邹琦(1988)的方法进行。
2　结果
2.1　热激过程中细胞 CaM含量的变化
小麦种子分别在 10 mmol/L 的 CaCl2 或 2
mmol/L的 EGTA溶液中浸泡过夜 ,生长 3 d的小麦
幼苗在 34℃经不同时间的热激处理 ,分别测定它
们的CaM含量 ,以了解在热激过程中细胞 CaM 含
量的变化 。结果表明(图 1)小麦幼苗经 34℃热激 ,
起初细胞中CaM的浓度随着热激时间的延长而提
高 ,90 min达到最高值 ,90 min以后 ,细胞内CaM含
量又逐渐降低 。用钙预处理的小麦幼苗热激后
CaM含量有较大幅度提高 ,热激 90 min 时细胞内
CaM的含量是未经热激的 3.2倍 ,而钙离子螯合剂
EGTA预处理的幼苗仅是 1.3倍。对照处理 ,即在
无钙又无 EGTA的情况下 ,细胞内CaM 的含量变化
与EGTA处理的相近(结果未列出)。该结果证明
小麦热激过程也伴随着 CaM 的积累 ,而且这种积
累是依赖钙离子的。
图 1　34℃热激时小麦幼苗中 CaM含量的变化
Fig.1　Change in CaM level in wheat seedlings during heat-shock
at 34℃
The CaM level in seedings grown at 22℃as control(100%).
2.2　钙-钙调素与热激蛋白的诱导合成
在 22℃条件下生长 3 d的小麦幼苗在 34℃热
激 2 h ,然后继续在34℃下用35S-蛋氨酸标记2 h ,以
诱导热激蛋白的合成 ,用一直在 22℃下生长的作
为对照。结果见图 2:与对照相比 , 34℃的热激诱
导热激蛋白的合成 ,其中合成量较大的分子量分别
为 94 、80 、70 、26和 15 ～ 17 kD(图 2A列 2)。CaCl2
预处理明显提高了热激蛋白的合成(图 2A列 4),5
mmol/L的 EGTA预处理明显降低了热激蛋白的合
成量(图 2A 列 3)。钙调素拮抗剂 50 μmol/L 的
CPZ或 25μmol/L的 TFP 预处理也减少了热激蛋白
的合成(图 2B列 3 、4),表明钙离子和钙调素可能
参与了热激蛋白的合成 。
这一点还可以在35S-蛋氨酸掺入蛋白质实验中
得到验证:在正常生长条件下(22℃为对照), 用
EGTA或CPZ预处理的小麦的35S-蛋氨酸掺入蛋白
质中的放射活性与水处理的无显著差异(图 3列 1
～ 3),表明在不经热激条件下 , EGTA或 CPZ 的预
处理对35S-蛋氨酸的掺入无明显影响 。而在 34℃
热激时 ,以水处理的小麦幼苗35S-蛋氨酸掺入蛋白
质中的放射活性为 100%;经用 10 mmol/L的 CaCl2
预处理后 , 蛋氨酸掺入提高至 240%, 5 mmol/L 的
EGTA预处理使蛋氨酸的掺入下降 51%,50 μmol/L
的CPZ 及 25 μmol/L 的 TFP 预处理引起氨基酸掺
入下降分别为 42%和 38%(图 3列4 ～ 8)。表明在
钙离子存在时 ,热激时热激蛋白的合成提高 ,而钙
离子螯合剂或钙调素拮抗剂的处理都抑制热激蛋
白的合成 。
332 植　物　生　理　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　26卷
图 2　几种效应剂的预处理对小麦幼苗热激蛋白合成的影响
Fig.2　Effects of pretreatment with CaCl2 , EGTA(A), CPZ or
TFP(B)on the synthesis of heat-shock proteins in wheat seedlings
at 34℃
Wheat seedlings were heat-shocked at 34℃for 2 h.35S-methionine
was then added and after another 2 h at the same temperature pro-
teins were extracted and fractionated on an SDS-PAGE.Approxi-
mately equal amounts of soluble proteins were loaded.
A:1.22℃;2.34℃;3.34℃+EGTA;4.34℃+CaCl2.
B:1.22℃;2.34℃;3.34℃+CPZ;4.34℃+TFP.
Molecular weight markers are on the left.
图 3　几种效应剂的预处理对小麦热激时35S-蛋氨酸掺入
蛋白质的影响
Fig.3　 Effects of pretreatment with CaCl2 , EGTA , CPZ or TFP
on incorporation of 35S-methionine into proteins in wheat seedlings
at 34℃
Lanes 1～ 3 are from wheat seedlings kept at 22℃:1.Distilled
water;2.EGTA;3.CPZ.
Lanes 4 ～ 8 are from heat shocked wheat seedlings:4.Distilled
water;5.EGTA;6.CPZ;7.TFP;8.CaCl2.
2.3　钙离子对高温下小麦生活力及膜稳定性的影响
用TTC法测定小麦幼苗生活力作为小麦幼苗
耐热性的研究指标(Krishnan等 1989)。从图 4A 中
可以看到 ,经热激(HS)的幼苗在 50℃处理 40 min
后 ,与未经热激(Non-HS)的幼苗相比 ,仍能保持一
定的生活力 ,表明热激引起小麦幼苗耐热性的提
高。分别用 5 mmol/L的 EGTA 或 0.5 mmol/L 的钙
离子通道阻断剂易博定(Verapamil)预处理的幼苗
经 34℃热激后又在 50℃水浴处理 40 min 后 ,生活
力明显下降 ,接近未经热激的小麦 。这些结果表明
EGTA和易博定的预处理基本上防止了由热激引
起的耐热性的提高 。10 mmol/L 的 CaCl2预处理比
水处理的幼苗耐热性略有提高(+Ca)。对照实验
表明 ,用 EGTA和易博定预处理后生长 4 d的幼苗
高度与水处理的无明显差异 ,各种预处理的幼苗在
50℃热处理前测定的 TTC 生活力与水处理的也无
显著差异(数据未列出)。
图 4　种子经不同预处理以后 50℃热处理对小麦生活力
(A)及膜伤害度(B)的变化的影响
Fig.4　 Effects of pretreatment with Ca2+, Ca2+chelator EGTA ,
Ca2+channel blocker Verapamil on viability loss (A) and change
in membrane injury extent(B)in wheat seedings during heat treat-
ment at 50℃
HS:Heat-shock.
3334 期　　　　　　　　　　　　　樊志和等:钙-钙调素与小麦苗中热激蛋白的诱导
　　用膜的伤害度表示的细胞膜稳定性作为小麦
幼苗耐热性的另一研究指标(邹琦 1988)。结果见
图4B , 未经热激锻炼的小麦幼苗在 50℃处理 60
min后 ,细胞膜的伤害度几乎达 100%(Non-HS),而
37℃热激 8 h后的幼苗经相同处理后 ,膜伤害度仅
为30%左右(HS),表明热激引起小麦幼苗细胞膜
稳定性的提高 。而分别用 EGTA 及易博定预处理
的幼苗在 50℃处理 60 min后 ,膜伤害度接近未经
热激的幼苗。这些数据进一步证明 EGTA及易博
定阻碍了热激引起的耐热性的获得 ,EGTA 是钙离
子螯合剂 ,易博定是钙离子通道阻断剂 ,因此可以
表明钙离子参与热激诱导的耐热性的获得。
2.4　钙调素拮抗剂对高温下小麦生活力及膜稳定
性的影响
TTC法测定小麦幼苗生活力的实验结果表明
(图5A),用钙调素拮抗剂CPZ50μmol/ L或TFP
图 5　种子经 CaM 拮抗剂预处理以后50℃热处理对小麦生
活力(A)及膜伤害度(B)的变化的影响
Fig.5　Effects of pretreatment with CaM antagonist CPZ and TFP
on viability loss(A)and change in membrane injury extent(B)in
wheat seedings during heat treatment at 50℃
25μmol/L 预处理的小麦幼苗在 50℃高温处理 40
min后 ,生活力分别下降了约 70%(+CPZ)或 80%
(+TFP)。用伤害度表示的膜不稳定性实验结果表
明 (图 5B), 分别用 CPZ 50 μmol/L 或 TFP 30
μmol/L 预处理的幼苗在 50℃处理 30 min 前 ,幼苗
的伤害度都接近热激(HS)处理 ,但 50℃处理 30
min后 ,伤害度迅速加大 ,至 60 ～ 75 min ,伤害度接
近 100%,与未热激(Non-HS)的相近 ,而 75 min 时
热激的小麦幼苗伤害度约为 60%(HS)。表明由于
钙调素拮抗剂的处理妨碍了耐热性获得 ,进一步表
明钙调素也可能参与了热激诱导的耐热性的获得 。
3　讨论
Ca
2+像 cAMP一样作为细胞内信使 ,在细胞功
能调节上起重要作用 ,CaM 是 Ca2+的重要受体蛋
白 ,在高等植物中 Ca2+-CaM 信号系统是研究得最
多 、了解比较清楚的一个(孙大业等 1998)。Braam
和 Davis(1990)发现雨 、风 、触摸引起拟南芥CaM 及
CaM相关基因的快速表达 。李卫等(1997)研究表
明柑橘低温锻炼过程中有 CaM积累 ,Ca2+、CaM 浓
度的增加可提高原生质体的抗冻性。Gong 等
(1997)也证明了玉米幼苗在热激过程中 CaM 含量
的提高。我们的实验有同样的结果:在 34℃热激
时 ,小麦幼苗中的 CaM 浓度随之增高 ,而且CaM 含
量的提高都依赖钙离子。这些结果的一致性表明
CaM 的积累可能是植物遭受环境胁迫时的一个普
遍反应 ,表明了 Ca2+-CaM 信号系统在环境信号转
导过程中的可能作用。
当前有关热胁迫的信号通过什么途径激活热
激蛋白基因的表达是热激蛋白研究领域中的热点 。
Mosser等(1990)的实验表明高温引起热激转录因
子(HSF)构象的改变而激活 HSF 、启动热激蛋白基
因的转录 ,钙离子也能引起 HSF 的激活。Kiang 等
(1994)的工作也提出钙离子参与热激蛋白基因的
表达。Kim 等(1995)提出在未热激细胞中 ,由于
HSF 与HSP70结合而处于失活状态;热激后 ,由热
引起的失活蛋白与 HSP70结合而释放 HSF ,使HSF
激活 。Zou等(1998)的研究提出了 HSP90在热激
因子激活中的作用的证据。我们前面的工作(孙旭
彤等 1998)证明了玉米细胞质 HSP70 在钙离子存
在下能与 CaM 结合;由于 HSP70在热激基因转录
调节中的作用 ,提示 Ca2+-CaM介导的信号转导途
径可能参与了热激基因的表达和调节。本文的结
334 植　物　生　理　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　26卷
果表明 Ca2+的螯合剂及 CaM的拮抗剂在抑制热激
蛋白的诱导的同时 ,也妨碍热诱导的耐热性的获
得。这为Ca2+-CaM 信号系统参与热激蛋白的诱导
及热激引起的耐热性提供初步证据 。
致谢:本研究工作得到孙大业教授的指导。
参 考 文 献
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3354 期　　　　　　　　　　　　　樊志和等:钙-钙调素与小麦苗中热激蛋白的诱导
Calcium-Calmodulin and the Inducement of Heat Shock Proteins in
Wheat Seedling
FAN Zhi-He1　ZHOU Ren-Gang1＊　LI Xiao-Zhi1　BAI Juan2
(1 Institute of Agro-physics , physiology and Biochemistry , Hebei Academy of Agricultural and Forestry Sciences , Shijiazhuang 050051;2 Laboratory of Molecular
Cell Biology , Hebei Normal University , Shijiazhuang 050016)
Abstract:The calmodulin(CaM)level in wheat
seedlings was found to increase remarkably during
heat shock at 34℃ in the presence of Ca2+ ,
reaching its maximum after 90 min of heat shock.
The Ca
2+
chelator EGTA prevented CaM accumu-
lation at 34℃(Fig.1).Pretreatment of wheat
seeds with EGTA or CaM antagonist CPZ , TFP
decreased the synthesis of heat shock proteins in
seedlings formed from them kept at 34℃(Figs.
2 , 3).Wheat seedlings subjected to heat shock
at 34℃or 37℃developed acquired thermotoler-
ance , but the pretreatment of seeds with EGTA ,
the Ca2+ channel blocker Verapamil , the CaM
antagonist TFP or CPZ eliminated the heat-shock-
induced thermotolerance(Figs.4 , 5).These re-
sults suggest that Ca2+-calmodulin may be in-
volved in the synthesis of heat shock proteins and
acquisition of the heat-shock-induced thermotoler-
ance.
Key words:Ca2+ , calmodulin , heat shock proteins , thermotoler-
ance , wheat
＊ Auther for correspondence.
336 Acta Phytophysiologica Sinica　2000 , 26(4):331～ 336