全 文 ：第 33卷第 6期
20 1 0年1 1月
河 北 农 业 大 学 学 报
JOURNA L OF AGRICULT URAL UNIVERS IT Y OF HEBEI
　 　 Vol.33 No.6
Nov .2 0 1 0
文章编号:1000-1573(2010)06-0016-05
拟南芥磷酸肌醇特异性磷脂酶
CAtPLC15亚型基因的组织表达定位
兰敏娟 , 　杜　娟 , 　刘海浩 , 　潘延云
＊ (河北农业大学 生命科学学院 , 河北 保定 071000)
摘要:采用 PCR扩增的方法 , 得到 AtPLC151 380 bp 的启动子片段 , 构建了带动报告基因 GUS 表达的双元载
体 ,转化拟南芥并筛选阳性转基因植株。通过组织化学染色分析 AtPLC15基因在拟南芥中的表达情况 , 结果显
示 AtPLC15基因在拟南芥幼苗的子叶 、下胚轴 、根尖和柱头处有表达 ,在成熟花药中表达量极少 ,而在幼苗子叶
和根尖中有极高的表达量。对该基因的功能有了新的认识 , 为阐述其功能机理提供了重要研究基础。
关　键　词:AtPLC15;转基因;拟南芥;GUS 染色
中图分类号:Q 789 文献标志码:A
Expression and localization of AtPLC15 a gene
encoding a phosphatidylinositol-specific phospholipase
C in Arabidopsis thaliana
LANMin-juan , DU Juan, LIU Hai-hao , PANYan-yun
(Co llege o f Life Science , Agricultur al Unive rsity of H ebei , Baoding 071001 , China)
Abstract:A pair of speci fic primer w as designed acco rding to the published sequence of the 5′up
stream sequence o f the promo ter o f AtPLC15 in Arabidopsis thaliana.A 1 380 bp sequence was
amplified f rom genomic DNA template of Arabidopsis thaliana by PCR.The cloned promoter has
been used in const ruction of g robacterium binary vectors wi th GUS reporter gene , and several trans-
formed plants were obtained through a grobacterium-mediated transformation.GUS activity in various
tissues of t ransformed plants was examined and the results showed that GUS gene directed by the pro-
moter sequence of AtPLC15 was tissue-specifically expressed in cotyledon , hypocotyls , root tip , pol-
lon and chapiter.And in semet its expression level is low while in seed leaf and root tip it has a high
level.This experiment has led to a novel recognition of the said gene , and thereby providing a founda-
tion for further experiment of its functional mechanism.
Key words:AtPLC15;t ransgenes;Arabidopsis thaliana ;GUS staining
　　肌醇磷脂依赖的磷脂酶 C(PI-PLC ,以后简称
为 PLC)是肌醇磷脂信号系统中的一个关键酶 。该
信号系统介导胞外信号的跨膜转导 ,在调节动 、植的
生长发育中发挥着重要的作用[ 1] 。细胞受到外界刺
激时 ,PLC 可被异三聚体 G 蛋白偶联受体或受体激
酶信号途径激活 , 水解 PIP2 产生双信使 IP3 和
＊收稿日期:2010-09-16
基金项目:国家自然科学基金项目(No.30570993);河北省自然基金项目(C2008000292).
作者简介:兰敏娟(1984-),女 , 河北省元氏县人 , 在读硕士生.
通讯作者:潘延云(1963-),女 , 河北省保定市人 , 博士 ,教授 , 从事植物细胞信号转导研究.E-mail:pyycell@163.com
　第 6期　 兰敏娟等:拟南芥磷酸肌醇特异性磷脂酶 CA tPLC15亚型基因的组织表达定位
DAG ,调节细胞中 Ca2+的浓度和一系列蛋白激酶 ,
从而参与细胞生长 、增殖 、代谢 、分泌 、收缩等发育过
程和生理过程的调节[ 2-3] 。
植物 PLC 的研究起步于上个世纪 80 年代 ,多
年的研究发现 , PLC 在植物细胞中普遍存在。研究
表明 ,植物 PLC 基因在植物体对外界刺激如渗透胁
迫 、ABA 、光 、重力 、病原侵染 、授粉以及缺氧等的应
答反应和生理过程中起作用 ,而其作用的分子机制
已经成为目前生物学的研究热点之一[ 4-5] 。PLC 在
大多数植物组织中表达 ,但不同亚型的 PLC在不同
组织中的表达水平是不同的 ,因此可能承担着不同
的生理功能。本试验利用GUS报告基因 ,用遗传转
化和化学染色的方法研究了拟南芥 PLC中第 15号
基因(AtPLC15 ,本实验室命名)植株生长发育各个
时期的表达特征 。
1　材料和方法
1.1　植物材料和菌株
拟南芥(Arabidopsis thal iana , Columbia eco-
ty pe)于 23 ℃,光照 130 lx ,16 h/8 h光暗条件下培
养。DH5α菌株和 pUC18质粒 ,农杆菌 GV3101和
pCAMBIA1300 双 元 载 体 为 本 实 验室 保 存 ,
pMD19-T Simple vecto r 载体购于日本 TaKaRa
公司 。
1.2　酶和化学试剂
高保真 PfuDNA聚合酶和 Taq DNA聚合酶购
自上海生工生物工程技术服务有限公司 ,各种限制
性内切酶为 TaKaRa公司产品;T 4 连接酶试剂盒为
北京天为时代产品;其他生化试剂均为进口分装或
国产分析纯试剂 。
1.3　相关质粒图谱与目的片段酶切位点分析及其
载体构建
转基因所用的双元载体为 pCAMBIA1300 ,该
质粒左右臂之间有潮霉素抗性基因(Hyp),为便于
外源基因的插入还引入了一个 pUC18的多克隆位
点如图 1。双元载体 pCAMBIA1300 上有 GUS 报
告基因如图 2所示 。
图 1　pCAMBIA1300 质粒图谱
Fig.1　Plasmid map of pCAMBIA1300
图 2　pCAMBIA1300-35S::GUS的酶切图谱
Fig.2　Restriction map of pCAMBIA1300-35S::GUS
根据GenBank上 AtPLC15基因序列 ,用 PCR
的方法从拟南芥的基因组中扩增出 AtPLC15起始
密码子前启动子序列 1 380 个碱基 , 根据图 3
ProP15酶切图谱上下游引物分别引入了 BamH Ⅰ
和 Pst Ⅰ的酶切位点。PCR产物连接到 pMD19-T
Simple vecto r载体上 ,测序测定启动子序列的正确
性 ,连有正确启动子序列的 pMD19-T 质粒与
pCAMBIA1300双元载体质粒重组 ,双酶切鉴定正
确后进行农杆菌转化和拟南芥遗传转化。
图 3　ProP15 酶切图谱(1 380 bp)
Fig.3　Restriction sites of ProP15
1.4　拟南芥遗传转化及转基因植株的培养与鉴定
采用冻融法 ,将构建成功的重组植物表达载体
质粒转化农杆菌 GV3101 ,筛选出正确的转化子通
过小量滴花转化法侵染野生型拟南芥花蕾 ,获得转
基因种子。种子播种于含潮霉素(25 μg/mL)的平
板上筛选 ,获得转基因植株。取阳性植株不同时期
17
　　　　　 河 北 农 业 大 学 学 报 第 33卷
的各种组织进行组织染色 ,检测 GUS 融合蛋白表
达定位情况。
1.5　转基因拟南芥植株 GUS基因表达活性的组织
化学染色
将合适大小的转基因幼苗或成熟植株的组织浸
入配制好的 GUS 染色液(0.1 mol/L 磷酸缓冲液 ,
5 mmol/L高铁氰化钾 , 5 mmol/ L 亚铁氰化钾 , 10
mmo l/L Na2EDTA ,50 mg/ml X-Gluc)中 ,于37 ℃
染色 1 ～ 24 h ,吸去染色液 ,依次用 70%、80%、90%
和 100%的乙醇梯度脱色 ,解剖镜观察并拍照。
2　结果与分析
2.1　AtPLC15启动子的扩增和载体构建
以拟南芥基因组为模板 , PCR 扩增得到 At-
PLC15的启动子片段(图4),连接pMD19-T 载体经
测序正确后 , 用 T 4DNA 连接酶连接到双元载体
pCAMBIA1300上 ,并转化感受态农杆菌 GV3101。
图 5为 pCAMBIA1300 重组载体的双酶切验证结
果。图 6所示为最终构建的启动子与 GUS 报告基
因的融合载体。
M:200 bp DNA marker
图 4　AtPLC15 基因启动子的 PCR扩增结果
Fig.4　The PCR fragments of promoter of AtPLC15 gene
M :为 2 000 bp ladder marker , 1:为 pCAM BIA1300-ProP15::GUS
阳性克隆经 PstⅠ +B amHⅠ双酶切后启动子片段 1 380 bp.
图 5　转基因表达载体的酶切鉴定
Fig.5　Identification of transgenic expression
vectors by restriction digestion
图 6　AtPLC15 基因启动子与 GUS的复合载体
Fig.6　AtPLC15 gene promoter and GUS fusion vector
2.2　转基因植株的筛选
按照方法 1.4得到转基因拟南芥种子 。图 7所
示为转基因 T1 代种子在含有 25 μg/ml 潮霉素
(Hyg)的 MS培养基平板上生长情况 。转基因呈阳
性的幼苗具有 Hyg 抗性 ,在筛选平板上能够正常生
长 ,播种 8 d后 ,即可长出真叶和正常的根 ,而未能
转化的幼苗 ,只能长出 2片子叶 ,不能继续生长 。用
这种方法筛选出了 T1代转基因阳性植株 ,得到转
化率为 0.4%左右。
实心箭头为转基因植株 ,空心箭头为未转基因植株
图 7　转基因植株在平板上的生长情况
Fig.7　Phenotype of transgenic plant on petri dish
2.3　拟南芥 AtPLC15基因不同时期的表达情况
按照 1.5 的方法对 pCAMBIA1300-ProP15::
GUS 转化野生型拟南芥得到的转基因植株的各组
织部位进行 GUS 染色 。图 8 显示 , AtPLC15在萌
发 2周龄的幼苗中在莲座叶 、茎和根中都有表达 ,其
中子叶和根尖中表达量极高 。成熟叶片在叶脉细胞
中有较高表达量;成熟植株的花器官的花柄 、花托 、
花萼 、花丝和柱头中均有表达 ,但在成熟花药中表达
量较少;种荚的柱头前端有表达 。AtPLC15在幼苗
期根尖中高量表达与前期试验结果一致 , AtPLC15
亚型基因可能参与了盐胁迫反应 。但对盐胁迫后的
转基因植株幼苗进行 GUS 染色 ,染色结果与对照
相比没有明显变化(图片未再显示)。因此 At-
PLC15是否参与盐胁迫反应应得到进一步证实 。
18
　第 6期　 兰敏娟等:拟南芥磷酸肌醇特异性磷脂酶 CA tPLC15亚型基因的组织表达定位
A:野生型对照;B:1周龄幼苗;C:2周龄幼苗;D:2周龄幼苗根尖 E:
6周龄植株花;F:成熟植株叶片 G:8周龄植株长角果
图 8　pCAMBIA1300-ProP15::GUS
转基因植株 GUS染色结果
Fig.8　GUS staining of pCAMBIA1300-ProP15::
GUS transformed plants
3　讨论
GUS基因存在于某些细菌体内 ,编码 β-葡糖苷
酸酶(β-g lucuronidase;GUS),该酶是一种水解酶 ,
能催化 5-溴-4-氯-3-吲哚葡萄糖苷酸 (5-bromo-4-
chlo ro-3-indoly l g lucuronide , 简 称 X-Gluc)。 X-
Gluc经该酶的作用形成靛蓝色不溶解的 5 , 5′-二
溴-4 , 4′-二氯 ,在酶活性位点沉积 ,故常做为组织化
学定位的酶。在转基因研究中 ,GUS 基因作为一种
常用的指示基因 ,具有灵敏度高 、易于定量及定位分
析 、可以与其他蛋白质融合等优点 ,因此在检测外源
基因的转化上 ,主要是在研究基因表达调控上具有
重要作用 。由于绝大多数的植物细胞内不存在内源
的GUS 活性 ,许多细菌及真菌也缺乏内源 GUS 活
性 ,因而 GUS基因广泛用作转基因植物 、细菌和真
菌的报告基因[ 6-9] ,尤其是在研究外源基因瞬时表达
的转化试验中 ,GUS基因应用最多 。孙健等在研究
拟南芥非特异性磷脂酶 C2基因时 ,利用 GUS 融合
蛋白染色得出 NPC2基因的表达受吲哚乙酸(IAA)
的诱导[ 10] 。段瑞君等在研究类似钙调素蛋白的基
因时 ,通过 Promo to r::GUS 转基因拟南芥植株的
建立和 RT -PCR 检测研究该基因的表达情况 ,结
果表明 A tPsiCaM 基因是全株表达 ,表达丰度因部
位而异 ,推测该基因是作用于特定部位 ,而不是组成
型表达的[ 11] 。这些结果都说明了 GUS 在研究基因
工程的研究中起到很重要的作用。
很多药理学等试验证明植物中的 PLC 参与了
多种刺激应答反应 ,如盐胁迫 ,干旱胁迫 ,冷胁迫 、
ABA 处理 、重力等过程产生的生理反应均涉及肌醇
磷脂系统组分的变化 ,故近年来植物 PLC 的生物学
功能及其作用的分子机制成为生物学的研究热点之
一[ 4-5 , 12] 。植物中的 PLC在各植物物种中分为多种
亚型 ,拟南芥中的 PLC 的多种亚型在基因组计划完
成前后均曾被研究报道[ 13] 。不同的亚型可能在不
同的生理过程中分别起到不同的生理作用 ,所以弄
清各亚型的表达特征 ,是澄清不同亚型生理功能的
必要前提之一[ 14-15] 。
本室前期工作表明 , AtPLC15亚型基因可能参
与了盐胁迫反应。很多药理学和初步的分子生物学
试验结果都显示了 PLC 可能参与了植物耐盐性调
节的生理过程。1995年在克隆拟南芥 PLC基因时
发现 , AtPLC1s在正常生长条件下表达量非常低 ,
干旱或盐处理时表达量急剧增加[ 16] 。用拟南芥
T87培养细胞进行渗透胁迫时发现 ,甘露醇 、NaCl
或脱水引起的高渗刺激后 ,细胞中的 IP3水平就短
促上升 ,U-73122(PLC 专一抑制剂)处理可以抑制
IP3的增高[ 17] 。PIP2在高渗刺激后也迅速增加 ,但
其上升速率远远低于 IP3 ,表明 IP3 的增加是由于
胁迫刺激诱导的 PLC 活力增强 。PLC 的抑制剂还
可抑制高渗胁迫反应中一些干旱诱导基因的表达。
Lin等[ 18] 利用基因芯片的方法对肌醇磷脂系统的信
号组分的各种亚型做了高通量分析 ,分析的 PLC 和
PLC 样基因有 21种 ,其中一些 PLC 亚型在不同逆
境条件下表达量有了明显的变化。Made Tasma
等[ 1 9] 用实时定量 PCR方法分析拟南芥 9种 PLC亚
型基因在非生物胁迫条件下的诱导情况 ,发现 At-
PLC1 、A tPLC5 2个亚型基因对盐胁迫条件反应敏
感 ,大约诱导水对照条件下的 2 ～ 6倍 。这些结果都
暗示了 PLC 在盐胁迫信号的传递中起一定作用。
本试验通过 GUS 组织染色显示 A tPLC15 基因在
拟南芥幼苗的子叶 、下胚轴 、根尖及花粉和柱头处有
表达 ,上述实验结果为进一步研究 AtPLC15 参与
盐胁迫应答反应的功能及作用机制的研究提供了基
础 。
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(编辑:梁　虹)
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