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笋瓜韧皮部蛋白基因启动子的克隆及其功能初探
蒋 浩 秦红敏 虞红梅
(中科院微生物研究所 , 北京
田颖川
100 08 0 )
摘 要 : 笋瓜韧皮部蛋白 ( p h loe m por iet n) PPZ 是一种独特的结合几丁质的凝集素 , 具有韧皮部组织特
异性 。 为了研究该基因启动子在转基因植物 中的表达特性 , 探索其在植物基因工程中潜在的应用价值 , 根据
发表的序列 , 用 P C R 方法从笋瓜基因组中扩增得到了 P PZ 基因启动子片段 。 经序列分析证明无误后 , 与
C U S 基因融合构建了植物表达载体。 通过农杆菌介导转化烟草 , 经 P C R 分析初步表明嵌合基因已经整合到
烟草基因组中 。 G U S 组织化学检测显示转基因烟草的茎 、 叶柄和根韧皮部以及叶脉都为 G U S 染色阳性 , 这
是首次用转基因植物证明笋瓜 P ZP 基因启动子可驱动外源基因在异源植物韧皮部及分生组织中特异性表达 。
关键词 : 笋瓜 ; 韧皮部特异性启动子 ; G U S 嵌合基因 ; 转基因烟草
植物韧皮部负责植物体内糖等有机营养物质从叶到其它组织器官的运输从而成为许多植物病虫
害的直接侵害目标 。 因此 , 研究韧皮部特异蛋白质基因的启动子介导外源基因进行组织特异表达的
特点 , 对于植物抗病抗虫基因工程的深入研究与应用 , 对于了解植物组织器官分化及基因调控规律
都具有重要的意义 。
韧皮部蛋白含量一般都比较低 , 约为 .0 3一 .2 2 m g/ m L , 但南瓜属植物韧皮部蛋白浓度可高达 Ior
m g/ m L
, 所以该基因启动子可能为研究双子叶植物基因的韧皮部特异表达提供一个有价值的调控元
件 。 1 992 年 , B os tw ick 等从笋瓜幼苗 c D N A 文库中筛选出编码 P ZP 二个亚基的 c D N A , 原位杂交发
现 P ZP m R N A 特异性地定位于韧皮部伴胞中 , 免疫细胞化学定位则表明 P ZP 蛋白分布于伴胞和筛管
分子中。 1994 年 认厄n g 等从西葫芦 c D N A 文库中筛选出一个编码 P P Z c D N A , 该 c D N A 编码的蛋白
与 B o w st w i c k 报道的笋瓜 P PZ 蛋白只有 9 个氨基酸残基的差别 , 二者 c D N A 同源性及由 c D N A 推导
的氨基酸同源性达 %% 。 同年 , B os tw ick 等分析了南瓜属的几个不同品种 , 发现 P PZ 由一个小的基
因家族 ( 2一 8 个基因 ) 编码 , P Z m R N A 高度保守 。 虽然已经获得了笋瓜 P ZP 基因全序列 , 但对其
启动子功能的研究则未见报道 。 本研究是根据已发表的序列 ” ’ , 用 P c R 方法从笋瓜基因组中扩增出
P P Z 基因启动子片段 , 与 G U S 基因融合构建成中间载体 , 并通过转基因烟草对其组织特异表达特点
进行研究的初步结果 。
1 材 料 与 方 法
1
.
1 材料
1
.
1
.
1 菌种和质粒 大肠杆菌 任污动已元力抽 c ojl’ ) D SH 。 , 根癌农杆菌 (A 名1’o ba c纪 ir “ n , 勿切 fae c jen s )
L B A 4 4 o 4 由本实验室保存 ; p B l l 2 1质粒购自 C lo n e t e e h 公司 ; pB lu e s e r ip t s K (+ )购自 S t r at 吧 e n e 公司 。
1
.
1
.
2 植物材料 笋瓜 ( uC c “ br I’at m~ a) 种子由中国林科院林研所李熠提供
; 烟草 了N介。油朋
扭 ab c um ) N c 89 种子由本实验室保存 。
1
.
1
.
3 试剂及仪器 同位素 [a 一 3 551 dAT P, [a 一 3 2P] d C T P 购自 N E N 公司 ; D N A 测序试剂盒购自
hP a mr ac ia 公司和 U SB 公司 ; PC R引物由上海生工生物技术公司合成 ; aT q D N A 聚合酶购自上海生
工公司 ; 其它生化试剂购自其他国内外有关公司 、 厂家 。
1
.
2 方法
1
.
2
.
1 植物总 D N A 的提取 将叶片在液氮中研磨至粉状 , 迅速转移到预热至 60 ℃提取缓冲液 (2 %
C TA B
,
1
.
4 m o l几 N a C I , 0 . 2% 2一疏基乙醇 , 2 0 m m o l几 E D AT , 10 0 m m o l几 rT i s · C I ( pH S . O ) , 0 . 5%
本研究为国家自然科学基金资助项目 , 并得到国际科学与文化中心 ( IC S C ) 世界实验室的部分资助
收稿日期 : 1 9 9 8一0 6一2 6
农业 生 物技术 学 报 199 9 年
P vP )中 (按每鲜克叶片加 5一7. 5 m L 提取缓冲液 ), 轻轻摇匀 , 60 ℃保温 30 m in 。 稍冷却后加等体
积的氯仿: 异戊醇 ( 24 : l) 抽提 , 1 0 00 r/ m i n 离心 15 m in 。 上清液用平头吸头转移到新的离心管中 ,
加 2 /3 体积的异丙醇于 4℃沉淀数小时 , 5 0 0 0 r加 i n 离心 1 0 m in , 用洗涤液 ( 7 6% 乙醇 ; 1 0 m m o l /L
乙酸按 ) 将沉淀洗 2 次 , 干燥后溶于适量双蒸水中 。
1
.
.2 2 韧皮部特异性启动子片段的克隆
质粒提取 、 限制性内切酶酶解 、 大肠杆菌 D H a5感受态细胞的制备和大肠杆菌转化参照 “ 分子克
隆 ” 一书 2`] 。 笋瓜 P P Z 启动子引物 :
PP Z
一
5
,
: T G T A A G C T T C A A G C G T T C G A A G AT G A G T A
P PZ
一
3’ : C r FA G G A I, C C A G A A G T G A G A I ’A T G A G T I人A T G
取 2 匹 (约 5 0 n g ) 总 D N A 为模板 , 在 5 0 林L CP R 反应体系中以 9 4℃ 1 m i n , 5 5 oC I m i n , 7 2℃
1m in 进行 30 个循环反应 。 P C R 扩增产物的纯化 , 酶解及向大肠杆菌克隆参照文献 `2] 进行 。 对筛选
到的重组子利用 p lB ue sc ir tP S K (+) 上的 T 。 、 T 7引物 , 按测序盒厂家推荐的方法对全长启动子进行
测序 。
1
.
.2 3 中间载体的构建及根癌农杆菌的转化
( l) 中间载体的构建 将刀朋 ZH I仔劲 l d l 酶切的启动子片段 , 以 1:0 1 的摩尔比与石触川 H l厅iI 了
d l 双酶切的 pBI 121 载体进行连接反应 , 转化大肠杆菌 D H ;sa 从 K an 平板上挑取单菌落进行酶切
鉴定 。
( 2 ) 根癌农杆菌的转化 参照文献 `月 进行 。
1
.
2 .4 烟草的转化及再生 参照文献 }3j 进行 。
1
.
.2 5 转化再生植株的 P C R 检测
( l) 烟草 D N A 的小规模提取 取 1 0一20 m g 叶片 , 用液氮在 1 . s m L E P 管中研碎后 , 按 1 . 2 . 1 中
所述加入 50 林L l 2/ 提取缓冲液 , 提取 D N A , 最后将 D N A 溶于 50 林L 双蒸水 。
( 2) 转基因烟草的 P C R 检测 取 1 匹 小规模提取的烟草 D N A 为模板 , 在 20 林L P C R 反应体
系 , 按 1 . 2 . 2 所述条件进行反应 , 反应产物于 1% 琼脂糖凝胶电泳进行检查 。
1
.
2
.
6 转基因烟草 G U S 活性的组织化学定位
取转基因烟草及对照烟草的根 、 茎 、 叶组织 , 用解剖刀切出横截面或纵切面切片置 1 . 5 m L E P 管
中 , 参照 eJ fe r so n 砰,的方法进行组织切片的 G U S 反应 。 用 70 %乙醇脱色后 , 用解剖镜观察并照相 。
2 结 果 与 讨 论
2
.
1 P ZP 基因启动子片段的克隆
根据已发表的笋瓜 P P Z 基因 5 ’端非编码区序列 ` , ’合成了引物 , 为方便以后的克隆和中间载体的
构建 , 在启动子 夕端引物上设计了 刀介Zd 川 位点 , 3’ 端引物上设计了 刀刁用 H l 位点 。 从笋瓜基因组
D N A 中通过 P C R 扩增得到了约 I kb 的 P ZP 启动子片段 (资料略 ) , 与预期大小相符 。 通过粘性末端
连接 (召刁功H l序了加 d 111 ) 将 p p Z 启动子片段插入至 p B l u e s e r ip t s K ( + ) 多克隆位点中 , 转化大肠杆
菌后 , 分别随机挑选了 12 个白色菌落 , 提取质粒后经酶切和 P C R 鉴定 (电泳结果的照片略 ) , 基本
上都是阳性克隆 。 重组质粒命名为 sP K P ZP 一 P 。
2
.
2 韧皮部特异性启动子片段的序列分析
随机挑选一个阳性克隆 , 利用 p lB ue sc irP t SK (+) 上的 T 3 、 T 7引物 , 对全长启动子进行了测序 。
克隆的笋瓜 P ZP 基因启动子全序列及其与报导序列的比较如图 1 所示 。
笋瓜 P ZP 启动子的序列与发表序列基本一致 ` , ’ , 同源性达 98 . 6% 。 其间微小的差别可能属于栽
培品种间的差别 。
从图 1 可以看出 , P ZP 基因启动子区有富含 A/ T 的区域和富含 A/ T 的重复序列 , 如一个 14 bP
的 A A I人A A I’A A A I人A A , 位于 748 和 760 (这里有连续 6 个 AT A A ;) 一个 13 bP 的 A毛划阱汀 TT TAT A
在 149 和 276 处重复 ; 此外还有多处富含 A/ T 重复序列 , 在大多数已研究过的植物启动子中 A/ T 富
第 l期 蒋 浩等: 笋瓜韧皮部蛋白基因启动子的克隆及其功能初探
含序列都和基因转录活性的正调控有关 , 法国菜豆的p一菜豆蛋白 ( p一p h as eo lin ) 基因启动子中的 A/ T
富含序列融合到 C a M V 35 S 一90 启动子上游能使 G U S 基因在转基因烟草中表达量提高 伙 豌豆 G sZ
基因启动子中一个 3 3bP A T/ 富含序列的缺失可导致转基因烟草中 G U S 活性下降 10 倍 6` , 。 类似的例
子也存在于豌豆 r be s一 3 A 基因 `刀、 C on A 基因 『盯 和大豆热激蛋白基因 G m h s p 17 . SE 启动子的 A/ T 富
含序列中 `9 ,。 也有关于 A T/ 富含序列作为负调控因子存在的报道 , 如 iN co it an a p ut m b ag ion fol ia 中叶
绿体确 结合蛋白 ( C ab 一 )E 基因 ` , 0] 和植物凝集素 P H A 一 L 基因启动子 `” , 。 P ZP 基因启动子中这些 A/
T 富含序列与基因表达调控的关系 , 还有待进一步的探讨 。
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▲
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图 l 笋瓜 P P Z基因启动子 ( 1) 和发表序列 (2) 的比较
F ig
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1 C o m Par i s o n o f t h e s e q u e n e e s b e wt e e n the P P 2 g e n e P or m o t e r er g io n fr o m C m a 军声不门a
o bat i n e d ( l ) an d th
e Pu b lis h e d o n e (2 )
CP R 引物以下划线标出 ; 1户n 诱 b ox 以双下划线标出 ; 在对应启动子中不存在的序列用长下线标出 ; 短线表示碱基相同 ; ▲
表示转录起始位点 T h e p e R p r ime sr a er u n d e r lin e d ; T IA 人 比 x 15 u n de r l in e d w ith d o u b le 一in e s ; T h e s e q u e n e a b s e n t in t he
c o u n et pr
a rt Por m o et r 15 u n d e ir in e d w i th lo n g li n e : S ho rt lin e s er P r e s e n t id e n t ie a l b a s e s
. ▲ er P er s e n t s th e t r a n s e r i P t io n s at rt s iet


6 8 农业 生 物技 术 学 报 1 99 9 年
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