全 文 ：16个高丛越橘品种VcCBF基因的单核苷酸多态性（SNP）分析
王甲威1，林 科2，姜 超2，魏海蓉1，刘庆忠1 *
（ 1.山东省果树研究所，山东省果树生物技术育种重点实验室，山东 泰安 271000；
2.泰山学院生物与酿酒工程学院，山东 泰安 271021）
摘 要：CBF是与植物抗寒、抗旱等抗逆性相关的一种转录因子，在植物抵抗逆境过程中发挥重要作用。以
16个高丛越橘品种为试材，采用直接测序法克隆VcCBF基因，共克隆到94个非重复序列，对这些序列进行单核苷
酸多态性分析，测序总长度63 732 bp，共发现103个SNP，单核苷酸多态性发生频率为1/619 bp，核苷酸多态性值
（Pi）为0.01274。在103个SNP中，单态突变位点为52个，简约信息位点为51个，其中双突变为50个，三态突变为
1个。通过碱基转换方式的分析发现，转换共83个，颠换19个，转换与颠换的发生比率为4.371。通过单倍型分
析发现在16个越橘品种中VcCBF基因存在5种单倍型。
关键词：CBF；单核苷酸多态性（SNP）；越橘
中图分类号：S663.9 文献标志码：A 文章编号：1005-9369（2012）10-0041-04
Single nucleotide polymorphism of VcCBF gene in 16 highbush blue-
berry varieties/WANG Jiawei1, LIN Ke2, JIANG Chao2, WEI Hairong1, LIU Qingzhong1(1.
Shandong Institute of Pomology, Key Laboratory for Fruit Biotechnology Breeding of Shandong,Taian
Shandong 271000, China; 2. Taishan University, School of Biology and Brewing Engineering,Taian
Shandong 271021, China)
Abstract: CBF, an important transcription factor, was proved to be invovled in stress-responsive in plant.
Total 16 highbush blueberry cultivars were used to detect single nucleotide polymorphisms (SNPs) in VcCBF gene
based on sequencing. Totally, 94 non-repetitive sequences were cloned successfully. Among these sequences, 103
SNPs were identified in VcCBF gene, on the average of one SNPs every 619 bp. The nucleotide diversity value
(Pi) in 16 blueberry cultivars was 0.01274. Over the 103 SNPs, 52 of them were singleton variable sites, 50 were
parsimony informative sites (two variants) and one was parsimony informative site (three variants). There were 83
transitions and 19 transversions. The rate of Ti/Tv was 4.37. Five haplotypes were finally identified for the 16
blueberry variants.
Key words: CBF; single nucleotide polymorphism (SNP); blueberry
CBF基因（又称DREB1基因），编码一个具有
AP2-domain的转录激活子，能够结合到DNA上具
有 CRT（C-repeat）或 DRE（Dehydration-responsive
element）调节位点的位置，调节植物冷适应相关基
因表达[1]。CBF基因是植物冷适应及信号传导领域
最有意义的发现之一，在多种重要农作物及蔬菜
中均发现该基因，进一步研究发现，多种与植物
冷适应相关的基因都受其调控 [2-4]。国外学者在高
丛越橘（Highbush blueberry，Vaccinium corymbosum）
和兔眼越橘（Rabbiteye blueberry，Vaccinium virgatum）
收稿日期：2012-05-06
基金项目：公益性行业（农业）科研专项（201103037）
作者简介：王甲威（1981-），男，助理研究员，博士，研究方向为果树生物技术。E-mail: wangjw-sdip@qq.com
*通讯作者：刘庆忠，研究员，研究方向为果树生物技术。E-mail: qzliu001@126. com
Journal of Northeast Agricultural University
东 北 农 业 大 学 学 报第43卷 第10期 43(10): 41~44
2012年10月 Oct. 2012
中也克隆到越橘的CBF基因，通过试验验证其功
能，研究发现CBF基因表达量和表达模式的差异
可能与高丛越橘品种蓝丰（Bluecrop）和兔眼越橘品
种梯芙蓝（Tifblue）的抗寒性不同相关[5]。
单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism，
SNP）是指在基因组水平上由单核苷酸变异所引起
的一种序列多态性[6]。在所有可能的DNA序列差异
性中，单核苷酸多态性是发生频率最高的变异。
在人类的DNA序列多态性中，90%序列多态性都
是单核苷酸多态性 [7]。单核苷酸多态性具有数量
大、分布广、稳定性强、易于分型等优点，在人
类疾病诊断及治疗、致病基因的发现、族群演化
研究等方面起重要作用，同时在小麦、玉米、大
豆等作物的物理作图、进化研究、遗传研究中也
是很有效的分子标记[6, 8-13]。
本研究以 16个抗寒性不同的高丛越橘品种为
试材，克隆其 CBF基因，采用直接测序法筛查
VcCBF基因的单核苷酸多态性，以期为研究VcCBF
基因与越橘抗寒性的关系奠定基础。
1 材料与方法
1.1 高丛越橘品种
研究采用的 16个高丛越橘品种采自山东省果
树研究所越橘品种资源圃，分别为北陆（North-
land）、喜来（Sierra）、陶柔（Toro）、都克（Duke）、
日出（Sunrise）、蓝丰（Bluecrop）、埃利奥特（Elliott）、
达柔（Darrow）、蓝塔（Bluetta)、泽西（Jersey）、布里
吉塔（Brigitta）、早蓝（Earliblue）、晚蓝（Lateblue）、
蓝金（Bluegold）、瑞卡（Reka）和普鲁（Puru）。
1.2 VcCBF基因的克隆、测序及单核苷酸多态性
分析
以越橘幼嫩叶片为试材，采用TIANGEN植物
基因组提取试剂盒提取基因组DNA，根据已发表
越橘CBF基因序列设计引物，进行PCR扩增，扩增
所用的上游引物为 5GAATCGTCGATGGAATATA
ACT 3，下游引物为 5TCTAAAATCTAACTCCACA
ACG 3，PCR产物回收后采用pMD18-T Vector载体
（TaKaRa公司）连接，转化DH5a感受态细胞，LB/
Amp平板上培养过夜后挑取菌落进行菌落 PCR筛
选阳性克隆，阳性克隆测序由上海生工生物技术
有限公司完成[14]。每个品种测序8个阳性克隆，所
得序列采用DnaSP v5分析 VcCBF基因的单核苷酸
多态性[15]。
2 结果与分析
2.1 VcCBF基因的克隆
PCR所得目的片段长度为698 bp，PCR产物回
收后连接转化，将阳性克隆进行测序，对测序结果
进行序列比对，除去重复序列，每个越橘品种得到
4~8个序列，共得到94个非重复序列（见表1）。
表1 16个高丛越橘品种测序得到的VcCBF基因非重复序列
Table 1 Non repetitive sequences of VcCBF gene in 16 highbush blueberry cultivars
2.2 VcCBF基因的单核苷酸多态性
将所得 VcCBF基因编码区（全长 681 bp）的 94
个非重复序列利用DnaSP软件进行单核苷酸多态性
分析，共发现103个SNP，全部为单核苷酸的替换，
并没有 InDel情况发生，SNP发生频率为 1/619 bp，
核苷酸多态性值（Pi）为 0.01274。在 103个 SNP中，
单态突变位点（Singleton variable sites）52 个，简
约信息位点（Parsimony informative sites）51个，在
简约信息位点中，双突变为 50个，三突变为 1个
（见表2）。
品种名Name
北陆 Northland
喜来 Sierra
陶柔 Toro
都克 Duke
日出 Sunrise
蓝丰 Bluecrop
埃利奥特 Elliott
达柔 Darrow
非重复序列Non repetitive sequence
6
8
5
6
4
6
6
7
品种名Name
蓝塔 Bluetta
泽西 Jersey
布里吉塔 Brigitta
早蓝 Earliblue
晚蓝 Lateblue
蓝金 Bluegold
瑞卡 Reka
普鲁 Puru
非重复序列Non repetitive sequence
4
7
7
6
6
5
7
4
东 北 农 业 大 学 学 报·42· 第43卷
进一步对 VcCBF基因单核苷酸多态性碱基替
换方式进行分析（见表3），除去三突变的简约信息
位点后，在剩余的 102个 SNP中，转换（A↔G，T
↔C）共有 83个，颠换（G↔T，A↔C，C↔G，A↔
T）共有19个，转换与颠换的比率为4.371。
2.3 VcCBF基因的单倍型分析
对来自同一品种不同克隆的非重复序列进行组
装，得到一致序列。利用DNAStar Megalign软件分
别对来自不同材料的序列进行多序列联配，分析其
单倍型，结果见图1。组装得到一致序列后，通过
序列联配，这 16个越橘品种可分为 5种单倍型
（Haplotype），且不同品种的越橘单倍型差异较大。
表2 16个高丛越橘品种VcCBF基因的单核苷酸多态性类型
Table 2 SNPs type of VcCBF gene in 16 highbush blueberry cultivars
多态性类型Types
单态突变位点Singleton variable sites
简约信息位点（双突变）Parsimony informative sites(Two variants)
简约信息位点（三突变）Parsimony informative sites(Three variants)
数量Number
52
50
1
多态性位点Site positions
15 22 47 80 122 134 149 155 159 164 179 182 192 193 216 218 224 251 255 271 277 287294 317 334 336 340 347 358 426 429 463 474 484 517 518 519 534 561 569 572 585587 594 596 607 613 627 634 641 644 660
36 44 52 69 87 105 111 120 186 236 239 280 288 306 330 348 352 354 381 390 421 423425 433 444 448 459 469 483 486 496 497 499 507 508 511 527 531 537 545 567 571573 576 606 646 648 654 657 667
365
表3 VcCBF基因的碱基替换方式
Table 3 Substitution types of bases in SNPs
替换方式 Types
K
M
R
S
W
Y
合计 Total
Ti/Tv
替换发生数 Number
6
6
49
1
6
34
102
4.37
注：K=G↔T，M=A↔C，R=A↔G，S=C↔G，W=A↔T，Y=C
↔T，Ti=转换，Tv=颠换。
Note: K=G↔T, M=A↔C, R = A↔G, S=C↔G, W=A↔T, Y=C↔T,
Ti=Transitions, Tv=Transversions.
图1 16个高丛越橘品种VcCBF基因的单倍型关系
Fig. 1 VcCBF gene haplotype of 16 highbush blueberry cultivars
3 讨论与结论
检测单核苷酸多态性的方法很多，直接测序
法是筛查 SNP最可靠的方法之一，特别是对基因
组信息较少、分子生物学研究较少的物种而言。
本研究通过对 16个越橘品种VcCBF基因的克隆测
BluettaSunriseSierraBrigittaPuruJerseyDukeLateblueElliottDarrowRekaBluecropBluegoldNorthlandToroEarliblue
haplotype 1
haplotype 2
haplotype 3
haplotype 4
haplotype 5
核苷酸替换 Nucleotide substitutions (×100)
43.2
40 35 30 25 20 15 10 5 0
王甲威等：16个高丛越橘品种VcCBF基因的单核苷酸多态性（SNP）分析第10期 ·43·
序，得到94个非重复序列，测序总长度63 732 bp，
在VcCBF基因的编码区共发现 103个多态性位点，
单核苷酸多态性发生频率为1/619 bp，核苷酸多态
性值（Pi）为 0.01274，相对于其他物种，VcCBF基
因单核苷酸多态性频率较低，这可能与其受到的选
择压力较大相关。通过对 103个 SNP的具体分析，
发现单态突变位点52个，简约信息位点51个（其中
双突变50个，三态突变1个），在碱基转换方式分析
中发现转换共有83个，颠换为19个，转换与颠换的
比率为4.371。通过进一步组装一致序列，进行单
倍型分析，在16个越橘品种中共有5种单倍型。
直接测序法筛查SNP也存在不足，首先在克隆
和测序过程中会造成假阳性，在检测到的 52个单
态突变位点中可能存在克隆或测序错误造成的误
差。此外，高丛越橘品种为四倍体，且多为杂交选
育而来，其本身 VcCBF基因的情况较为复杂，本
研究从每个品种筛选8个阳性克隆进行测序，可能
造成其内源VcCBF基因的缺失，从而对分析其单核
苷酸多态性和单倍型造成不足，这也是多倍体植物
中单核苷酸多态性开发的难点之一[16]。多倍体植物
中单核苷酸多态性开发的另外一个难点就是区分品
种内的多态性和品种间的多态性，如普通小麦（异源
六倍体），以26个品系为材料，采用直接测序法筛
查其21个基因的SNP，结果发现大部分的SNP是品
种内的多态性，品种间的多态性数量较少[17]。
[ 参 考 文 献 ]
[ 1 ] Fowler S, Thomashow M F. Arabidopsis transcriptome profiling
indicates that multiple regulatory pathways are activated during
cold acclimation in addition to the CBF cold response pathway[J].
Plant Cell, 2002, 14(8): 1675-1690.
[ 2 ] Thomashow M F. Plant cold acclimation: Freezing tolerance genes
and regulatory mechanisms[J]. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol
Biol, 1999, 50: 571-599.
[ 3 ] Hsieh T H, Lee J T, Yang P T, et al. Heterology expression of the
Arabidopsis C-repeat/dehydration response element binding factor 1
gene confers elevated tolerance to chilling and oxidative stresses
in transgenic tomato[J]. Plant Physiol, 2002, 129(3): 1086-1094.
[ 4 ] Sanghera G S, Wani S H, Hussain W, et al. Engineering cold
stress tolerance in crop plants[J]. Curr Genomics, 2011, 12(1): 30-
43.
[ 5 ] Polashock J J, Arora R, Peng Y, et al. Functional identification of
a C-repeat binding factor transcriptional activator from blueberry
associated with cold acclimation and freezing tolerance[J]. Journal
of the American Society for Horticultural Science, 2010, 135(1):
40-48.
[ 6 ] Brookes A J. The essence of SNPs[J]. Gene, 1999, 234(2): 177-186.
[ 7 ] Collins F S, Brooks L D, Chakravarti A. A DNA polymorphism
discovery resource for research on human genetic variation[J].
Genome Res, 1998, 8(12):1229-1231.
[ 8 ] Rafalski J A. Novel genetic mapping tools in plants: SNPs and
LD-based approaches[J]. Plant Science, 2002, 162(3): 329-333.
[ 9 ] Chagne D, Gasic K, Crowhurst R N, et al. Development of a set of
SNP markers present in expressed genes of the apple[J].
Genomics, 2008, 92(5): 353-358.
[10] Ganal M, Altmann T, Roder M S. SNP identification in crop plants
[J]. Curr Opin Plant Biol, 2009, 12(2): 211-217.
[11] Shu Y J, Li Y N, Wu L H, et al. Mining and Identification of SNPs
from EST sequences in soybean and converting SNP markers into
CAPS[J]. Acta Agronomica Sinica, 2010, 36(4): 574-579.
[12] 李亚玲, 李景富, 康立功, 等. 番茄Mi-1基因的 SNP分型[J]. 东
北农业大学学报, 2010, 41(10): 42-44.
[13] 张育垚,李景富,谢立波,等.番茄Cf-5基因的SNP分子标记开
发[J].东北农业大学学报, 2012, 43(4): 99-104.
[14] 臧建磊,李亚东,刘庆忠,等.笃斯越橘CBF基因的克隆及序列
分析[J].吉林农业大学学报, 2011, 33(5): 532-535.
[15] Librado P, Rozas J. DnaSP v5: A software for comprehensive
analysis of DNA polymorphism data[J]. Bioinformatics, 2009, 25
(11): 1451-1452.
[16] 贺道华, 邢宏宜, 赵俊兴, 等. 多倍体植物中单核苷酸多态性
（SNPs）的开发[J].浙江大学学报:农业与生命科学版, 2011, 37
(5): 485-492.
[17] Ravel C, Praud S, Murigneux A, et al. Single-nucleotide polymor-
phism frequency in a set of selected lines of bread wheat (Triticum
aestivum L.)[J]. Genome, 2006, 49(9): 1131-1139.
东 北 农 业 大 学 学 报·44· 第43卷