全 文 ：东海原甲藻细胞色素 b基因实时荧光定量
PCR检测体系优化*
王曲圆1 摇 甄摇 毓2 摇 袁摇 健1 摇 米铁柱2**摇 于志刚3
( 1中国海洋大学海洋生命学院, 山东青岛 266003; 2 中国海洋大学环境科学与工程学院海洋环境与生态教育部重点实验室,
山东青岛 266100; 3中国海洋大学化学化工学院海洋化学理论与工程技术教育部重点实验室, 山东青岛 266100)
摘摇 要摇 为定量检测现场样品中东海原甲藻的细胞色素 b(cytochrome b, Cyt b)基因,本研究
设计了该基因的特异性引物,并对现场样品反转录反应体系中加入的模板数量和定量 PCR
反应条件进行了优化.结果表明:设计的引物具有较好的特异性,可有效区分不同的藻类;针
对现场样品,在 20 滋L的反转录体系中,适宜加入的 RNA 模板的量为 50 ~ 200 ng;PCR 模板
稀释 10 倍或向定量 PCR反应体系中加入终浓度为 0. 2 滋g·滋L-1的牛血清蛋白(BSA)均能有
效降低现场样品中抑制物的抑制作用,减小干扰.该方法的建立对从分子水平探讨东海原甲
藻暴发和消亡的内在机制具有重要意义.
关键词摇 东海原甲藻摇 定量 PCR摇 细胞色素 b基因摇 内参基因
文章编号摇 1001-9332(2013)02-0541-08摇 中图分类号摇 Q178. 1, Q7摇 文献标识码摇 A
Optimization of real鄄time quantitative fluorescence PCR system in detecting cytochrome b
gene of Prorocentrum donghaiense Lu. WANG Qu鄄yuan1, ZHEN Yu2, YUAN Jian1, MI Tie鄄
zhu2, YU Zhi鄄gang3 ( 1 College of Marine Life Sciences, Ocean University of China, Qingdao
266003, Shandong, China; 2Ministry of Education Key Laboratory of Marine Environment & Ecolo鄄
gy, College of Environmental Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao
266100, Shandong, China; 3Ministry of Education Key Laboratory of Marine Chemistry Theory &
Technology, College of Chemistry and Chemical Engineering, Ocean University of China, Qingdao
266100, Shandong, China) . 鄄Chin. J. Appl. Ecol. ,2013,24(2): 541-548.
Abstract: To quantitatively detect the cytochrome b (Cyt b) gene of Prorocentrum donghaiense Lu
in the filed samples, a specific primer was designed, and the quantities of the RNA templates added
into the reaction system for reverse transcription as well as the reaction conditions of real鄄time fluo鄄
rescent quantitative PCR (RFQ鄄PCR) were optimized. The results illustrated that the designed
primer had good specificity, being able to be used to differentiate different algal species effectively.
In detecting the filed samples, the suitable qualities of the templates for the 20 滋L reverse transcrip鄄
tion system were 50 -200 ng. 10鄄fold diluting the templates or adding the bovine serum albumin
(BSA) with a final concentration 0. 2 滋g·滋L-1 into the RFQ鄄PCR system could effectively
decrease the inhibitory effect of the inhibitors in the filed samples, and thus, decrease the interfer鄄
ences. The established real鄄time fluorescent quantitative PCR (RFQ鄄PCR) assay would facilitate us
to study the intrinsic mechanisms of P. donghaiense outbreak and extinction at molecular level.
Key words: Prorocentrum donghaiense Lu; real鄄time fluorescent quantitative PCR (RFQ鄄PCR);
cytochrome b; reference gene.
*国家重点基础研究发展计划项目(2011CB403602)和海洋公益性
行业科研专项(201105014鄄03,201205031鄄03)资助.
**通讯作者. E鄄mail: mitiezhu@ ouc. edu. cn
2012鄄05鄄11 收稿,2012鄄11鄄21 接受.
摇 摇 近年来,我国东海海域春夏季频繁发生甲藻赤
潮,给当地的经济和环境均带来极大危害,赤潮面积
大多超过 1000 km2,持续时间常常超过 1 个月[1-3] .
研究表明,其优势种多为东海原甲藻(Prorocentrum
donghaiense Lu) [1] . 东海原甲藻属于甲藻门(Dino鄄
phyta)甲藻纲 ( Dinophyceae)原甲藻属 ( Prorocen鄄
trum),主要分布在我国长江口与浙江沿岸. 东海原
应 用 生 态 学 报摇 2013 年 2 月摇 第 24 卷摇 第 2 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
Chinese Journal of Applied Ecology, Feb. 2013,24(2): 541-548
甲藻赤潮发生时,多分布在表层和次表层,水体厚度
可达 10 m左右,水体颜色为棕褐色,最大细胞密度
可达 3郾 6伊108 cell·L-1 [4] .
目前,对于东海赤潮的研究正朝着两个方面深
入:一方面从气象条件、海洋学过程、生态因子、建立
赤潮模型等几方面开展宏观层面的分析,研究赤潮
发生发展的规律及其发生机制[5-7];另一方面,越来
越多的研究聚焦于赤潮藻类原因种的代谢模式、化
感作用、菌藻关系等微观层面,分析了解赤潮的种群
动力学[8-11] .特别是在分子生态学的研究中,对海洋
微藻与生态适应相关的生理和分子机制的研究以及
利用分子生物学手段了解浮游植物群落组成的多样
性研究得到了迅速发展,研究者可从分子水平深入
探讨不同浮游植物的代谢方式、调控机制,实时了解
种群动态,从而解析赤潮暴发和消亡的内在机
制[9,12-14] .在这些分子机制研究中,通常需要采用一
些在机体内表达稳定的基因(内参基因)作为对目
的基因作为研究时的内部参照,通过使目标基因的
数据归一化,去除不同标本在细胞数量、提取条件和
上样过程等方面存在的差别,从而令结果更可信.
内参基因通常选择在各生理阶段表达量恒定的
基因,它们的表达一般不随外界的变化而变化.常用
的内参基因有甘油醛鄄3鄄磷酸脱氢酶(glyceraldehyde鄄
3鄄phosphate dehydrogenase, GAPDH)基因、茁鄄肌动蛋
白(茁鄄actin, ACTB)基因、茁2 鄄微球蛋白(茁2 鄄microgl鄄
bulin, 茁2 鄄MG)基因、18S rRNA 基因等. 但在目前的
赤潮生物研究中,对上述基因的研究较少,给内参基
因的选择和使用带来较大困难. 在近来一些研究报
道中发现,细胞色素 b(cytochrome b, Cyt b)基因在
不同生理和生长条件下表达稳定,可作为内参基因
使用[4,15-17] . 由于 Cyt b 进化速度适中,且相对于
rRNA 基因有较高的突变率[16,18-20],可以实现对不
同种类分别测量,因此更适合作为处理现场样品中
的内参基因使用. 赵丽媛[4]在东海原甲藻的 Cyt b
基因的保守区域设计了定量 PCR引物,对纯种培养
的东海原甲藻的该基因进行研究,发现 Cyt b 基因
表达量稳定,可作为内参基因使用;但由于设计的引
物位于序列的保守区域,不具有种间特异性,仅适用
于对纯种培养的东海原甲藻进行分析,而实际赤潮
发生海域现场环境复杂,样品中含有其他藻类和未
知物质,容易对检测体系造成干扰,影响试验结果的
准确性.因此,若要对现场样品中的东海原甲藻的
Cyt b基因进行定量分析,需要从引物特异性和反应
体系稳定性两方面进行改进.
本文针对东海原甲藻 Cyt b 基因设计特异性引
物,分析了该基因作为内参基因的可靠性和可行性;
并对现场样品处理方法进行优化,以期为运用相对
定量 PCR方法测定现场样品中东海原甲藻 Cyt b基
因奠定基础.
1摇 材料与方法
1郾 1摇 藻种培养
试验所用的微藻藻种见表 1,其中东海原甲藻
为本研究的目标藻,其余藻用于检验 Cyt b 基因引
物的特异性. 培养条件为: 光照 /黑暗周期为
12 h / 12 h,光照条件为 4000 lx,培养温度为 18 ~
22 益 .
1郾 2摇 样品采集
本研究所用的现场样品由“润江 1 号冶科学考
察船于 2011 年 6 月 2 日在舟山外海赤潮暴发区采
集,采样位点(29毅30爷 30冶 N,122毅37爷 50冶 E)水深
43 m,用网口面积 0郾 03 m2、孔径 20 滋m的浮游生物
网在水域表层进行水平拖网,并通过 20 号筛绢(孔
径 76 滋m)将采集水样中较大的生物个体、泥沙等滤
除后,在不超过 0郾 04 MPa 的压力下,以 10 滋m 的醋
酸纤维滤膜过滤收集样品,滤膜放入冻存管,置于液
氮中冻存.
1郾 3摇 RNA的提取和反转录
对表 1 中的微藻进行对数生长期的准确计数,
收集约 5伊106个细胞,7270 伊g离心 20 min(Z36HK,
表 1摇 藻种来源及培养条件
Table 1摇 Microalgal source and culture mediums
藻种名
Algal name
培养基
Culture
medium
来源
Source
东海原甲藻 Prorocentrum donghaiense f / 2鄄Si 玉
微小原甲藻 Prorocentrum minimum f / 2鄄Si 玉
三角棘原甲藻 Prorocentrum triestinum f / 2鄄Si 玉
利玛原甲藻 Prorocentrum lima f / 2鄄Si 域
塔玛亚历山大藻 Alexandrium tamarense f / 2鄄Si 玉
锥状斯氏藻 Scrippsiella trochoidea f / 2鄄Si 玉
强壮前沟藻 Amphidinium carterae f / 2鄄Si 域
链状裸甲藻 Gymnodinium catenatum f / 2鄄Si 域
中肋骨条藻 Skeletonema costatum f / 2 芋
尖刺拟菱形藻 Pseudo鄄nitzshia pungens f / 2 域
三角褐指藻 Phaeodactylum tricornutum f / 2 芋
丹麦细柱藻 Leptocylindrus danicus f / 2 域
洛氏角毛藻 Chaetoceros lorenzianus f / 2 域
球形棕囊藻 Phaeocystis globosa f / 2鄄Si 域
赤潮异弯藻 Heterosigma akashiwo f / 2鄄Si 域
玉:东海海域 East China Sea; 域:南海海域 South China Sea; 芋:青岛
胶州湾 Jiaozhou Bay, Qingdao.
245 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 24 卷
HERMLE),将沉淀的藻细胞放入研钵中,加入液氮
研磨至粉末后再加入 1 mL TRIZOL( Invitrogen,美
国),剧烈震荡 15 s,室温下放置 10 min.加入200 滋L
氯仿剧烈振荡 15 s,室温下温浴 3 min. 4 益、
10460伊g离心 15 min;吸取上清液,加入 500 滋L异丙
醇,上下颠倒混合后于室温沉淀 10 min;再以4 益、
10460 伊g 离心 10 min. 去除上清液后用 1 mL 75%
乙醇进行冲洗,离心除上清后,再加入 75%乙醇洗
涤 1 次,去除上清液,空气干燥后,加入无 RNase 水
溶解沉淀,置于-80 益保存.反转录反应:取 500 ng
总 RNA进行反转录.具体操作按照 SuperScriptTM Kit
(Invitrogen,美国)说明书进行.
1郾 4摇 引物的特异性验证及标准曲线的建立
1郾 4郾 1 引物的种间特异性 摇 1) RFQ鄄PCR 引物的验
证.用 DNAman软件对获得的东海原甲藻 Cyt b 基
因序列(NCBI收录号为 FJ418633)及从 GenBank 上
获得的其他海洋微藻序列进行对比分析,用 Primer
Premier 5郾 0 设计一对用于荧光定量 PCR的引物,上
游 引 物 DH鄄FQ鄄Cytb2F: 5 爷鄄TTCATCTTCTACTTG鄄
GTTTTCAGGA,下游引物 DH鄄FQ鄄Cytb2R: 5 爷鄄TC鄄
CAAAAGGTAAGACATAACCCATA,扩增产物片段长
度为 85 bp,引物由上海博尚生物有限公司合成.
用上述引物和 FastStart Universal SYBR Green
Master(Rox)试剂盒(Roche,德国)对东海原甲藻的
cDNA和制备好的 Cyt b 基因质粒标准品进行荧光
定量 PCR扩增(ABI7500,美国),每个样品做 3 个平
行样,并加阴性对照. 反应体系为: SYBR Green
Master(Rox) 试 剂 15 滋L、 正 反 向 引 物 ( 10
滋mol·L-1)各 0郾 9 滋L、模板 3 滋L,加灭菌的超纯水
至 30 滋L; PCR 反应条件为:50 益 2 min; 95 益
10 min;95 益 15 s,60 益 1 min,40 个循环. 扩增完
毕后,进行熔解曲线分析并用电泳进行检测,以确定
有无非特异性扩增和引物二聚体产生.
2) 纯种藻样品的检测.按 1郾 3 的方法分别收集
和处理表 1 中的微藻,将设计的引物分别加入等量
的 cDNA中,进行定量 PCR反应.反应条件同上.
3) 混合样品的检测.将表 1 中除东海原甲藻以
外的其余微藻等细胞数配制成混合藻液,并将东海
原甲藻与混合藻液按细胞数比为 100 颐 1、10 颐 1、
1 颐 1、1 颐 10、1 颐 100 的比例进行混合,每份混合液
中东海原甲藻的细胞数均为 2伊106个,同时取 2伊106
个东海原甲藻做平行试验.反应条件同上.
1郾 4郾 2 东海原甲藻 Cyt b 基因质粒标准品的制备 摇
用 Cyt b 基因的简并引物[21](上游引物 Dinocob1F:
5 爷鄄ATGAAATCTCATTTACAWWCATATCCTTGTCC,
下游引物 DinocobR:5爷鄄TCTCTTGAGGKAATTGWK鄄
MACCTATCC A)扩增东海原甲藻 RNA 反转录所得
的 cDNA. 反应体系为: 10 伊 Trans Taq鄄T 缓冲液
2郾 5 滋L,2郾 5 mmol · L-1 dNTP 2 滋L,正反向引物
(10 滋mol·L-1)各 1 滋L,模板 1 滋L, Trans Taq鄄T
DNA聚合酶(全式金,北京)1 滋L,用水补足至25 滋L;
PCR反应条件为:94 益 5 min;94 益 30 s,58郾 5 益
45 min,72 益 1 min,35个循环;72 益延伸10 min.
PCR产物经切胶回收后,进行连接、转化和培
养,经蓝白斑筛选得到 Cyt b 基因的阳性克隆,将阳
性克隆在 LB 液体培养基中进行过夜培养. 用质粒
提取纯化试剂盒 ( TaKaRa,大连)提取质粒,加入
50 滋L TE缓冲液溶解,并经双酶切后送华大基因测
序鉴定.以超微量紫外分光光度计(Picodrop,英国)
测得其浓度,取 3 次检测平均值.
将测得的浓度值按下列公式换算成质粒的拷贝
数:拷贝浓度 ( copy·滋L-1 ) = ( Con 伊 10-9 伊 6郾 02 伊
1023) / (碱基数伊660). 将重组质粒标准品原液做 7
个 10 倍的梯度稀释,作为定量 PCR 的标准梯度样
品,-80 益保存.
1郾 4郾 3 标准曲线的建立摇 以上述 7 个浓度梯度的质
粒标准品为模板, 进行荧光定量 PCR 反 应
(ABI7500,美国).每个浓度做 3 个平行样,并加阴
性对照. 定量反应体系为 2 组,一组反应体系与
1郾 4郾 1 中定量 PCR 体系相同,另一组向体系中加入
终浓度为 0郾 2 滋g·滋L-1的牛血清蛋白(bovine serum
albumin, BSA),其余反应条件同上. 以质粒拷贝数
的对数值为横坐标,以实时荧光定量 PCR反应中相
应的平均 C t值为纵坐标,绘制标准曲线.
1郾 5摇 定量 PCR反应体系的优化
1郾 5郾 1 添加 BSA 对体系进行优化 摇 取 200 ng RNA
做反转录,以得到的 cDNA作为模板,按 1郾 4郾 1 中的
定量 PCR 方法,分两组进行试验. 一组反应体系与
1郾 4郾 1 中定量 PCR 体系相同,另一组向体系中加入
终浓度为0郾 2 滋g·滋L-1的 BSA,其余反应条件与
1郾 4郾 1 中定量 PCR体系相同.经标准曲线换算,计算
样品中的拷贝数. 观测低浓度 BSA 对定量 PCR 的
影响.
1郾 5郾 2 现场样品 cDNA浓度的优化摇 取 200 ng RNA
进行反转录,对得到的 cDNA 做 10、100 倍梯度稀
释,将原浓度溶液、10 倍稀释溶液和 100 倍稀释溶
液作为定量 PCR 模板,按 1郾 4郾 1 中的定量 PCR 方
3452 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 王曲圆等: 东海原甲藻细胞色素 b基因实时荧光定量 PCR检测体系优化摇 摇 摇 摇 摇
法,分两组进行试验.一组反应体系与 1郾 4郾 1 中定量
PCR 体系相同,另一组向体系中加入终浓度为
0郾 2 滋g·滋L-1的 BSA,其余反应条件与 1郾 4郾 1 中定
量 PCR 体系相同. 经稀释倍数校正和标准曲线换
算,计算样品中的拷贝数. 观测稀释对定量 PCR 的
影响.
1郾 5郾 3 反转录所用模板量的优化 摇 按照 Super鄄
ScriptTM Kit 说明书建立 20 滋L 反转录反应体系,向
体系中分别加入 50、100、200、400 ng的 RNA模板进
行反转录.以得到的 cDNA 为模板进行定量 PCR 反
应.按 1郾 4郾 3 中加入终浓度为 0郾 2 滋g·滋L-1的 BSA
的定量 PCR 体系进行试验. 经标准曲线换算,计算
样品中的拷贝数.观测反转录模板量对定量 PCR 的
影响.
2摇 结果与分析
2郾 1摇 Cyt b基因引物的特异性分析及标准曲线的建
立
2郾 1郾 1 东海原甲藻 Cyt b 基因重组质粒结果 摇 将提
取得到的质粒进行双酶切检测验证,酶切图谱(图
1)中出现了 3 条大小不同的条带. 其中 1000 bp 处
出现的条带为从重组质粒中切除的载入片段大小.
说明该次克隆试验成功建立了重组质粒. 华大基因
测序得知插入片段大小为 985 bp,碱基序列与实验
室测得的东海原甲藻 Cyt b 相同,从而成功制得东
海原甲藻 Cyt b 重组质粒,可用于后续试验中建立
Cyt b的标准曲线.
2郾 1郾 2 东海原甲藻 Cyt b 基因引物特异性验证摇 1)
RFQ鄄PCR引物的验证.用 DH鄄FQ鄄Cytb2 引物扩增东
海原甲藻cDNA模板和制备的质粒标准品,得到的
图 1摇 重组质粒 BamHI和 PstI双酶切图谱
Fig. 1 摇 Restriction enzyme digestion of plasmid DNA with
BamHI and PstI郾
M: Trans 2000 DNA marker郾 下同 The same below郾 1 ~ 4:Cyt b基因重
组质粒双酶切结果 The double restriction enzyme digestion result of
plasmid DNA.
图 2摇 DH鄄FQ鄄Cytb2 引物验证结果
Fig. 2摇 Results of the test of the DH鄄FQ鄄Cytb2 primer郾
A: RFQ鄄PCR产物电泳图 Gel analysis of RFQ鄄PCR product; 1)东海原
甲藻 cDNA模板定量 PCR 产物电泳结果 RFQ鄄PCR product of Cyt b
from Prorocentrum donghaiense; B: Cyt b 基因熔解曲线 The melting
curves for Cyt b of Prorocentrum donghaiense郾
定量 PCR产物经电泳后可见一条约 100 bp 的特异
性目的条带,是预期扩增的目的片段大小,无引物二
聚体和其他非特异性条带产生(图 2A),表明该引
物仅能扩增出东海原甲藻 Cyt b 基因的片段,对东
海原甲藻不存在其他基因的非特异性扩增,且无引
物二聚体产生;分析熔解曲线发现,质粒标准品和
cDNA的 PCR产物均呈现为单一峰(图 2B),Tm为
70 益左右,说明该对引物只扩增预期的目的条带,
可以用于 SYBR Green I染料法的定量 PCR反应.
摇 摇 2) 纯种藻样品的特异性检验. 以不同藻种的
cDNA为模板,在模板量相同的情况下进行定量
PCR扩增,扩增结果见表 2.该对引物对试验所用的
甲藻都能进行扩增,对非甲藻类的微藻扩增效率极
低.其中对东海原甲藻的扩增效率最高 (C t值最
小),C t = 19郾 67,其次是同为甲藻类的微小原甲藻
(Prorocentrum minimum),其 C t = 24郾 13.根据相对扩
增效率公式:相对扩增效率 = 2-驻 Ct 伊100% ,驻C t =目
的藻的 C t值-东海原甲藻的 C t值,计算得到微小原
甲藻的扩增效率仅为东海原甲藻的 4郾 5% ;甲藻中
的其他微藻以及非甲藻类微藻的 C t值均大于 26,扩
增效率更低,均不足东海原甲藻的 1% .
摇 摇 3) 混合藻样品的特异性检验. 对混合样品扩
增结果(表3)可知,在东海原甲藻与混合藻的比例
445 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 24 卷
表 2 摇 引物 DH鄄FQ鄄Cyt b2 扩增不同微藻 cDNA 的定量
PCR扩增结果
Table 2 摇 RFQ鄄PCR products of different microalgae with
DH鄄FQ鄄Cyt b2
藻种名
Algal name
C t值
C t value
相对扩增效率
Relative amplification
efficiency (% )
东海原甲藻 Prorocentrum donghaiense 19郾 67 100
微小原甲藻 Prorocentrum minimum 24郾 13 4郾 5
三角棘原甲藻 Prorocentrum triestinum 26郾 39 0郾 94
利玛原甲藻 Prorocentrum lima 26郾 49 0郾 88
塔玛亚历山大藻 Alexandrium tamarense 27郾 95 0郾 32
锥状斯氏藻 Scrippsiella trochoidea 31郾 17 0郾 03
强壮前沟藻 Amphidinium carterae 31郾 40 0郾 03
链状裸甲藻 Gymnodinium catenatum 32郾 20 0郾 02
中肋骨条藻 Skeletonema costatum 32郾 92 0郾 01
尖刺拟菱形藻 Pseudo鄄nitzshia pungens >34 -
三角褐指藻 Phaeodactylum tricornutum >34 -
丹麦细柱藻 Leptocylindrus danicus >34 -
洛氏角毛藻 Chaetoceros lorenzianus - -
球形棕囊藻 Phaeocystis globosa - -
赤潮异弯藻 Heterosigma akashiwo - -
-未检出 No detected郾
表 3摇 混合藻样品的定量 PCR扩增结果
Table 3摇 RFQ鄄PCR results of mixed microalgae samples
样品
Sample
平均 C t值
Average
C t value
纯种培养的东海原甲藻
Cultured single Prorocentrum donghaiense
23郾 36
东海原甲藻和混合藻细胞数为 100 颐 1
Proportion of Prorocentrum donghaiense and mixed microalgae was
100 颐 1
23郾 43
东海原甲藻和混合藻细胞数为 10 颐 1
Proportion of Prorocentrum donghaiense and mixed microalgae was
10 颐 1
23郾 27
东海原甲藻和混合藻细胞数为 1 颐 1
Proportion of Prorocentrum donghaiense and mixed microalgae was
1 颐 1
23郾 39
东海原甲藻和混合藻细胞数为 1 颐 10
Proportion of Prorocentrum donghaiense and mixed microalgae was
1 颐 10
25郾 23
东海原甲藻和混合藻细胞数为 1 颐 100
Proportion of Prorocentrum donghaiense and mixed microalgae was
1 颐 100
25郾 97
为 100 颐 1、10 颐 1、1 颐 1 时,检测到的基因拷贝数与
未混合的等量的东海原甲藻检测到的基因拷贝数相
差较小,表明在混合样品中当东海原甲藻细胞数占
细胞总数的 50%以上时,其他微藻对试验的干扰较
小.但当东海原甲藻和其他藻混合比例为 1 颐 10、
1 颐 100时,C t值开始变大,此时其他微藻的干扰
较大.
2郾 1郾 3 东海原甲藻 Cyt b基因 RFQ鄄PCR标准曲线的
建立 摇 通过紫外法测得质粒标准品的浓度为
170郾 0 ng·滋L-1,换算成质粒的拷贝浓度为 2郾 11 伊
1010copy·滋L-1 .将重组质粒标准品原液梯度稀释成
2郾 11伊 107、2郾 11 伊 106、2郾 11 伊 105、2郾 11 伊 104、2郾 11 伊
103、2郾 11伊102、2郾 11伊101 copy·滋L-1 .稀释的质粒和
DH鄄FQ鄄Cytb2 引物进行定量 PCR 扩增检测. 由图 3
可以看出. Cyt b 重组质粒拷贝数从 101到 107,均得
到了很好的扩增,且每个稀释度的 3 个平行样有很
好的重复性. 以 C t值为纵坐标,质粒拷贝数的对数
值为横坐标,做标准曲线,未加 BSA 试验组所得的
标准曲线为:C t = -3郾 37 lg[质粒拷贝数] +35郾 42,
r= -0郾 999,C t值的检测范围为 11 ~ 32;加入终浓度
为 0郾 2 滋g·滋L-1 BSA 的试验组所得标准曲线为:
C t = -3郾 44 lg[质粒拷贝数] +36郾 53,r= -0郾 999,C t值
检测范围为 11 ~ 33.两条标准曲线将分别用于在不
同的定量 PCR 体系中对 Cyt b 基因拷贝数的定量
计算.
2郾 2摇 定量 PCR体系的优化
2郾 2郾 1 添加 BSA 对体系进行优化 摇 取 200 ng RNA
现场样品进行反转录,将得到的 cDNA 分别加入有
BSA和没有 BSA的定量 PCR反应体系中.在模板量
相同的情况下,向反应体系中加入终浓度为
0郾 2 滋g·滋L-1BSA后 C t 值有所减小,测得的基因拷
贝数明显增加,相对偏差也有所减小(图 4).说明现
场样品中存在大量的抑制物能抑制定量PCR反
图 3摇 东海原甲藻 Cyt b基因定量标准曲线
Fig. 3 摇 Calibration curves for Prorocentrum donghaiense Cyt b
gene郾
A: 未加 BSA Without BSA; B: 加入终浓度为 0郾 2 滋g·滋L-1的 BSA
With 0郾 2 滋g·滋L-1 BSA郾 下同 The same below.
5452 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 王曲圆等: 东海原甲藻细胞色素 b基因实时荧光定量 PCR检测体系优化摇 摇 摇 摇 摇
图 4摇 BSA对 Cyt b基因拷贝数定量的影响
Fig. 4摇 Effects of BSA on RFQ鄄PCR detection copies of Cyt b
gene郾
应中 Taq酶的活力,且这种抑制属于可逆抑制,BSA
能很好地减小这种抑制作用,加入 BSA后,结果的准
确度有所提高.所以在对现场样品进行定量 PCR时,
为了提高酶活力,减少样品中抑制物的抑制作用,可
向反应体系中加入终浓度为0郾 2 滋g·滋L-1的 BSA.
2郾 2郾 2 cDNA浓度的优化摇 将 200 ng 现场样品 RNA
反转录得到的 cDNA 稀释后,进行定量 PCR 反应.
当反应效率为 100%时,模板量增加 10 倍,C t 值应
减小 3郾 3 左右.两组试验结果显示:cDNA 溶液进行
10 倍稀释后,测得的基因拷贝数明显大于未稀释时
测得的基因拷贝数,标准差也偏大,C t值在标准曲线
的检测范围中;稀释 100 倍后,测得的拷贝数比稀释
10 倍时测得的拷贝数稍有降低,但比未稀释时高,
标准差有所减小,C t值虽位于检测范围中,但接近检
测下限. 相同稀释倍数下,在定量 PCR 体系中加入
BSA的试验组所测得的基因拷贝数明显高于未在体
系中加入 BSA试验组(图 5).
2郾 2郾 3 模板量的优化 摇 用不同量的 RNA 为模板进
行反转录,结果如图 6 所示.随着 RNA质量的增加,
检测到的 Cyt b 基因拷贝数呈先增加后减少的趋
势.在理想状态下,当反应效率为 100%时,模板量
增加1倍,C t值应减小1,所检测到的基因拷贝数则
图 5摇 cDNA稀释倍数对 Cyt b基因拷贝数定量的影响
Fig. 5摇 Effects of cDNA dilution multiple on RFQ鄄PCR detec鄄
tion copies of Cyt b gene郾
图 6摇 不同反转录 RNA模板量的 Cyt b基因测定结果
Fig. 6摇 RFQ鄄PCR results of Cyt b gene with different quantities
of RNA郾
应提高 1 倍.但本试验发现,分别加入质量为 100 和
50 ng RNA时,前者得到的基因拷贝数是后者的 4郾 7
倍,但标准偏差有所加大;分别加入质量为 200 和
100 ng RNA 时,前者得到的基因拷贝数是后者的
1郾 3 倍,但后者的标准偏差较小;分别加入质量为
400 和 100 ng RNA时,前者得到的基因拷贝数明显
小于后者,但标准偏差加大.表明在 20 滋L的反转录
体系中,适宜的现场样品 RNA 模板量在 50 ~
200 ng.
3摇 讨摇 摇 论
前人的研究已经证实,Cyt b基因的表达量在不
同生长阶段变化不大,表达相对稳定,可作为内参基
因使用[20] .同时,由于 Cyt b 进化速度适中,相对于
核糖体 RNA 基因具有较高的突变率(即物种特异
性更高) [18-20],因此在对现场样品的检测中更具实
用价值.赵丽媛[4]对东海原甲藻的 Cyt b 基因进行
研究,证明了其作为内参基因的可行性,并在对纯种
培养的东海原甲藻生长率的测定中获得了很好的结
果;但由于设计的引物不具有种间特异性,因此仅适
用于纯种培养的藻种分析,若要测定现场样品中的
东海原甲藻 Cyt b 基因,则需进一步设计出具有种
间特异性的引物.
本研究将东海原甲藻与其他生物的 Cyt b 基因
序列比较发现,Cyt b 基因在同属中的保守性较高,
它与微小原甲藻(Prorocentrum minimum)的相似性
最高(96% ),而与其他甲藻的相似度稍低[如与链
状裸甲藻 ( Gymnodinium catenatum) 的相似度为
93% ,塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)的相
似度为 90% ],但都在 75%以上;与非甲藻类微藻之
间的相似度则较低[如与中肋骨条藻( Skeletonema
costatum)的相似度只有 55% ].虽然 Cyt b基因在属
间存在较大差异,能设计出具有属间特异性的引物,
645 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 24 卷
但在同属物种间的保守性较高,尤其是与微小原甲
藻的相似度最高,仅有 19 个碱基的差异,且有差异
的碱基相对分散,所以要设计出具有种间特异性的
引物还存在一定难度,但本试验所设计的引物与东
海原甲藻结合的区域具有良好的属间特异性. 在用
15 种微藻对引物的特异性检验的试验中也发现,该
对引物对试验所用的甲藻都能进行扩增,其中对东
海原甲藻的扩增效率最高,其次是微小原甲藻,但对
微小原甲藻的扩增效率仅为东海原甲藻的 4郾 5% ,
对甲藻中的其他微藻扩增效率也很低,扩增效率不
足东海原甲藻的 1% ;而对非甲藻类的微藻扩增效
率则极低或不进行扩增反应.因此在实际应用中,具
有较好的种特异性.需要指出的是,由于 Cyt b 基因
在同属种间具有较强的保守性,且目前在藻类中关
于 Cyt b基因已知的序列较少,因此设计高度种间
特异性的引物存在困难.今后的研究可以采用 Taq鄄
man探针方法来提高检测的灵敏度和准确性,这是
一个可行的改进方向.
在对混合样品的检测中发现,当东海原甲藻的
细胞数占细胞总数的一半以上时,能对东海原甲藻
Cyt b基因进行准确的定量检测,但当细胞数量只有
总细胞数的十分之一或更低时,C t值开始变大,在对
现场样品的 Cyt b基因检测时容易使测得的基因拷
贝数偏低.产生这种现象的原因有两种可能:其一,
由于混合比例为 1 颐 10 和 1 颐 100 时,细胞数量级达
到了 108和 109,样品的细胞数量过大,超出了1 mL
TRIZOL裂解液的裂解范围,降低了 RNA 的提取效
率,使样品中所含有的目的基因拷贝数偏少;另一种
可能是因为混合藻的种类和数目较多,不同藻细胞
中含有的物质不同,有些藻细胞中含有大量的多酚
等次级代谢产物,处理不当会与蛋白质和核酸发生
不可逆的结合,并严重抑制 DNA 聚合酶的作
用[22-23],从而降低反应效率,使得到的 C t值偏大.
在现场样品检测试验中,将样品加入未优化的
反应体系时,反应不能顺利进行,推测现场样品中存
在大量的抑制物影响了反转录效率和定量 PCR 反
应.针对这一问题,本试验从定量 PCR 反应体系和
反转录体系两个方面逐步进行优化,选出合适的体
系对现场样品进行检测.实际上,得到准确可靠的定
量 PCR数据的前提是具有一个稳定的 PCR 反应体
系,因此先对定量 PCR 反应体系进行优化,为减小
现场样品中抑制物对反应造成的干扰,向体系中加
入酶稳定剂并对反应模板进行稀释.
多项研究表明,在 PCR反应中加入 BSA可以减
少抑制物对反应的干扰作用[24] . 由于 BSA 分子含
有大量的赖氨酸,其阳离子可与多酚化合物的阴离
子相互作用,也可通过疏水力和离子键与脂类化合
物结合,防止酶的分解和非特异性吸附,从而起到阻
止它们与 Taq 酶结合的作用[25] . 向 PCR 反应体系
中加入 BSA以提高酶活的方法已广泛应用于植物
和土壤微生物的 PCR 反应中[26-27] . 本研究结果表
明,在定量 PCR体系中加入 BSA 后,得到的 C t值的
标准偏差有所减小,结果的准确度提高,得到的基因
拷贝数比未添加 BSA的反应体系提高 1 倍左右.说
明向定量 PCR 反应体系中加入 0郾 2 滋g·滋L-1的
BSA即可有效减轻抑制物对反应的干扰作用.
对定量 PCR反应体系进行优化,除了向体系中
加入酶稳定剂之外,还可通过稀释 cDNA 来降低其
中抑制物浓度以提高反应效率. 本研究取 200 ng
RNA反转录所得的 cDNA 进行 10 倍稀释后所测得
的基因拷贝数明显增加,说明稀释 10 倍后能降低反
应体系中抑制物浓度,很好地减小这种抑制作用.在
稀释 100 倍后,虽能明显降低反应中的抑制物浓度,
但也减小了反应模板量,反而降低了反应效率,容易
造成测得的拷贝数偏低.
由于加入 BSA 和对模板进行稀释都能提高反
应效率,减小抑制作用,所以在以后的试验中,可根
据取用的 cDNA量来酌情优化定量 PCR 体系.当取
用 cDNA量较少时,带入体系的抑制物较少,仅通过
向反应体系中加入 BSA便可消除抑制物的干扰;当
取用 cDNA量较多时,可将模板稀释 10 倍后并向反
应体系中加入 BSA,来减小抑制作用,从而提高定量
PCR的反应效率.
在对反转录体系进行优化时,可采用改变不同
模板量进行反转录优化试验. 虽然本试验所用的反
转录试剂盒能反转录总 RNA的量为 5 ng ~ 5 滋g,但
现场样品中存在大量抑制物,会降低反转录效率,能
进行反转录 RNA的量较少.从反转录模板量优化的
试验可知,若 RNA 用量不足,且样品中存在大量的
抑制物,反应效率偏低;适当地增加反转录 RNA 的
模板量能提高反应效率;但若用量过多,在增加
RNA模板量的同时会引入大量的抑制物,阻碍反转
录和定量 PCR 反应的顺利进行. 本试验结果表明,
对现场收集的微藻提取 RNA 时,20 滋L 反转录体系
的适宜模板量在 50 ~ 200 ng.
4摇 结摇 摇 论
本试验通过对多种微藻细胞色素 b(Cyt b)基
7452 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 王曲圆等: 东海原甲藻细胞色素 b基因实时荧光定量 PCR检测体系优化摇 摇 摇 摇 摇
因进行序列比对,设计了针对东海原甲藻的实时荧
光定量 PCR 引物,并以 15 种微藻验证了该引物的
特异性,发现该引物能有效区分不同的藻类.通过优
化反应体系,得到 20 滋L反转录体系中,现场样品反
转录 RNA的最适模板量范围为 50 ~ 200 ng;在进行
定量 PCR时,可以通过稀释法或向定量 PCR 体系
中加入 BSA的方法来减小干扰,提高反应效率. 本
试验所得的检测现场样品中东海原甲藻 Cyt b 基因
的实时荧光定量 PCR方法具有很好的特异性、实用
性,可以应用于东海原甲藻的分子生态学研究.
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(in Chinese)
作者简介摇 王曲圆,女,1987 年生,硕士研究生.主要从事赤
潮生物的分子生态学研究. E鄄mail: ice_5885327@ 163. com
责任编辑摇 肖摇 红
845 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 24 卷