全 文 ：基因组学与应用生物学，2014年，第 33卷，第 3期，第 487-494页
Genomics and Applied Biology, 2014, Vol.33, No.3, 487-494
研究论文
Research Article
低温胁迫响应的甜杨miR475靶基因的预测及表达
胡惠雯 * 侯欣瑜 * 蔡兼 钮俊 项争 安基永 林善枝 **
北京林业大学生物科学与技术学院,林木育种国家工程实验室,林木花卉遗传育种教育部重点实验室,北京, 100083
*同等贡献第一作者
*通讯作者, linsz2002@163.com
摘 要 MicroRNAs (miRNAs)通过使靶 mRNA降解或翻译参与生物体的转录后调控，并在植物对生物与
非生物胁迫的应答过程中发挥重要作用。本研究基于相关数据库，利用生物信息学方法，通过搜索预测及实
验验证得到甜杨(Populus suaveolens)低温响应 miR475的 12条潜在靶基因，并对其降解位点进行分析；同
时，以低温(0℃)处理不同时间甜杨幼苗为试材，利用荧光定量 PCR对 miR475及其靶基因的表达谱进行检
测分析，结果发现，随着低温诱导时间的延长，miR475表达量呈下调趋势，而其靶 mRNA的表达量则呈现相
反趋势，表明甜杨 miR475可能以降解靶 mRNA的方式在抵御低温中发挥作用。本文研究结果可为甜杨抗
冻机制的后续深入研究提供科学依据。
关键词 甜杨, microRNA靶基因,低温胁迫,荧光定量 PCR,表达谱
Prediction and Expressing Analysis of the Cold Stress-Responsive miR475
Target Genes From Populus suaveolens
Hu Huiwen * Hou Xinyu * Cai Jian Niu Jun Xiang Zheng An Jiyong Lin Shanzhi **
College of Biological Sciences and Biotechnology, National Engineering Laboratory for Tree Breeding, Key Laboratory of Genetics and Breeding in
Forest Trees and Ornamental Plants, Ministry of Education, Beijing Forestry University, Beijing, 100083
* The authors who contribute equally
* Corresponding author, linsz2002@163.com
DOI: 10.13417/j.gab.033.000487
Abstract The miRNA participates in posttranscriptional regulation by regulating degradation or translation of
target mRNAs, and plays a key roles in response of plants to biotic and abiotic stresses. In this paper, based
on the database of mRNA and EST of poplar, the 12 potential target genes of cold-related miR475 were pre-
dicted by using bioinformatics and verified in Populus suaveolens, and the cleavage sites of the miRNA target
genes were analyzed. In addition, the expression profiles of the obtained target mRNAs and mature miRNA
from P. suaveolens seedlings exposed to 0℃ for 0 to 48 hours were analyzed by quantitative realtime PCR.
The results reveal that the expression of miR475 was down-regulated and its target mRNAs show the opposite
trend, suggesting that miR475 may function in low temperature resistance by regulating degradation of the tar-
get mRNAs. The results would provide a theoretical basis to further explore of the molecular mechanism of
cold resistance in P. suaveolens.
Keywords Populus suaveolens, miRNA target genes, Low temperature stress, Quantitative realtime PCR, Ex-
pression profile
基金项目：本研究由国家自然科学基金项目(J1103516)资助
miRNAs是一类长度为 21碱基左右的内源非编
码小分子 RNAs，自从 1993 年 Lee 等(1993)人在秀
丽隐杆线虫中首次发现 miRNA以来，随后在拟南
芥、玉米、小麦及毛果杨等多种植物中也发现其存在
(Sunkar and Zhu, 2004; Mica et al., 2006; Yao et al.,
2007; Klevebring et al., 2009)；目前已在 miRBase数
据库 (r elease 20)公布并验证 miRNA 存在的植物
72种(June, 2013)。miRNA由于其多样性与广泛存在
性、以及在真核生物基因表达中的重要调控作用而
日益引起人们的高度关注。
至今已有大量的 miRNAs被预测并通过实验证
实在植物干旱、冻害、高盐和高温等逆境胁迫反应中
起着重要作用(Zhao et al., 2007; Zhou et al., 2008;
Sunkar et al., 2008; Xin et al., 2010)，但其复杂分子调
控机制至今尚未完全弄清。植物中的 miRNA与靶基
因近乎完全互补，其主要调控机制为介导靶基因降解
(Liu et al., 2004; Meister et al., 2004; Okamura et al.,
2004; Brennecke et al., 2005; Bracken et al., 2011)，而
降解一般由具有核酸内切酶活性的 AGO1 介导
(Baumberger and Baulcombe, 2005; Qi et al., 2005)，其
断裂位点主要是在 miRNA 第 10~11 核苷酸之间
(Llave et al., 2002)。目前，miRNA靶基因的研究主要
通过生物信息学预测及实验鉴定，而实验鉴定miRNA
靶基因主要通过高通量测序、基因芯片技术及实时荧
光定量 PCR (qRT-PCR)等技术(Sunkar et al., 2008)。
甜杨(Populus suaveolens)为杨柳科杨属青杨派
树种，主要分布于我国大兴安岭和内蒙古以及俄罗
斯西伯利亚等地区，能在年平均气温为-3.8℃ (极端
低温-46.9℃)的环境下生存，具有较强的抗冻能力
(林善枝和张志毅, 2004;孙润泽等, 2011)。为了揭示
甜杨抗冻分子机制，本实验室前期已开展该树种的
抗冻生化机制(Lin et al., 2005)、代谢关键调控酶葡萄
糖-6-磷酸脱氢酶基因的克隆及表达分析(林元震
等, 2007; 2009)、抗冻蛋白以及抗冻相关转录因子
ICE1的克隆与分析(林元震等, 2007; 2009)等方面研
究；在此基础上，依据已公布的毛果杨(Populus tri-
chocarpa)基因组序列，利用 miRNA高度保守特点，
从甜杨基因组中克隆获得 12个 miRNA基因序列，
通过研究发现甜杨 miR475与低温响应密切相关(孙
润泽等, 2011)，其表达调控机制值得深入研究。据此，
本文以前期鉴定的甜杨低温响应 miR475为研究对
象，预测并验证了 12条靶向 mRNA的存在，并在低
温胁迫下对 miR475及其靶基因的表达谱进行检测
与分析，进而探讨 miR475及其靶基因在植物低温胁
迫反应中的作用，为揭示 miR475参与甜杨抗冻调控
分子机理奠定基础。
1结果与分析
1.1甜杨 miR475靶 mRNA的预测
为寻找潜在的靶基因，通过搜索已公布的毛果
杨mRNA数据库及杨树 EST数据库，得到 7条靶基因
序列；同时，利用植物miRNA靶基因预测软件 psR-
NATarget (http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/) (Dai
and Zhao, 2011)在毛果杨转录组中进行搜索，得到另
外 5条靶基因，最终得到 12条序列做为潜在靶基因
(表 1)；所有靶基因均为可编码 mRNA，它们对应的
蛋白均为 PPR (pentatricopeptide repeat)蛋白。
1.2甜杨 miR475靶基因的验证
提取正常甜杨及低温胁迫甜杨总 RNA，利用逆
转录 PCR得到靶基因序列(图 1)，测序结果与预测基
本一致，说明所预测的 12条靶基因均存在于甜杨
中；此外，利用 RLM-RACE 方法成功验证 3条靶基
因(2, 5, 6)的降解位点，均发生在 miRNA的第 10位
与第 11位之间(图 2)，表明这 3条靶基因以降解的
方式受到 miR475调控，但其余 9条靶基因未检测到
相应的降解位点。
1.3甜杨 miR475及其靶 mRNA的低温诱导表达
从图 3中可看出，经 0℃低温胁迫处理后，甜杨
幼苗叶片中所预测的 miR475靶 mRNA的转录表达
量均显著高于未处理的对照，且随低温胁迫时间的
增加而呈波动性上升，但不同靶基因表达量的增加
幅度及出现峰值时间有所不同；但对于 miR475而
言，其表达量则随着低温胁迫时间延长而呈明显下
降趋势(图 4)。上述这些结果表明甜杨 miR475靶基
因的表达具有低温胁迫诱导特性，且可能受到
miR475的调控。
2讨论
miRNA主要在转录调控及转录后调控中发挥作
用(Humphreys et al., 2005; Jing et al., 2005; Vaucheret,
2006; Mallory and Vaucheret, 2006)；研究miRNA的靶
图 1甜杨 12条 miR475靶基因的 RT-RCR扩增
注: M: D2000 DNA Marker; 1~12:靶基因 1~12
Figure 1 12 putative miR475 target mRNA genes by RT-RCR
amplified in P. suaveolens
Note: M: D2000 DNA Marker; 1~12: Target gene 1~12
低温胁迫响应的甜杨 miR475靶基因的预测及表达
Prediction and Expressing Analysis of the Cold Stress-Responsive miR475 Target Genes From P. suaveolens 488
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
表 1甜杨 miR475靶基因的预测
Table 1 The prediction of miR475 target genes from P. suaveolens
编号
Number
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
靶基因(登录号)
Target gene (accession No.)
XM_002319013.1
XM_002325743.1
XM_002336177.1
XM_002329199.1
DB891597.1
XM_002309526.1
XM_002301639.1
XM_002326793.1
XM_006377350.1
XM_002310640.2
XM_006389244.1
XM_006389560.1
序列比对
Sequence alignment
21 AAUUAGUUACCCGUGACAUU 1
: : : : : : : : : : : : : : : : : : : :
1069 CUAAUCAAUGGGCACUGUAA 1088
21 GAAUUAGUUACCCGUGACAUU 1
: : : : : : : : : : : : : : : : : : : :
498 CUUAAUCAAUGGGCUCUGUAA 518
21 GAAUUAGUUACCCGUGACAUU 1
: : : : : : : : : : : : : : : : : : : :
740 CUUAAUCAAUGGGCUCUGUAA 760
21 GAAUUAGUUACCCGUGACAUU 1
: : : : : : : : : : : : : : : : : : : :
480 CUUAAUCAAUGGGCUCUGUAA 500
21 GAAUUAGUUACCCGUGACAUU 1
: : : : : : : : : : : : : : : : : : : :
232 CUUAAUCAAUGGGCUCUGUAA 252
21 GAAUUAGUUACCCGUGACAUU 1
: : : : : : : : : : : : : : : : : : : :
510 CUUAAUCAAUGGGCUCUGUAA 530
21 GAAUUAGUUACCCGUGACAUU 1
: : : . : : : : : : : : : : . : : : : :
581 CUUGAUCAAUGGCCAUUGUAA 601
21 GAAUUAGUUACCCGUGACAUU 1
: : : . : : : : : : : : : : : : : : : :
52 CUUGAUCAUUGGGCACUGUAA 72
21 GAAUUAGUUACCCGUGACAUU 1
: : : : : : : : : : : : . : : : : : :
1048 GUUAAUUAAUGGGCUCUGUAA 1068
21 GAAUUAGUUACCCGUGACAUU 1
: : : : : : : : : : : : . : : : : : :
675 CUUCAUCAAUGGGUACUGCAA 695
21 GAAUUAGUUACCCGUGACAUU 1
: : . : : : : : : : : : : : : : : : : :
675 AUUGAUCAAGGGGCACUGUAA 695
21 GAAUUAGUUACCCGUGACAUU 1
. : : . : : : . : : : : : : : : : : : :
1103 UUUGAUCGAUGGGCACUGCAA 1123
功能
Function
PPR
基因对于揭示 miRNA的作用机制以及阐述 miRNA
功能具有重要意义，但 miRNA靶基因的研究目前主
要局限于模式植物，在甜杨中鲜有报道。甜杨作为一
种抗冻能力极强的树木，是研究 miRNA抗冻机理的
理想材料，根据毛果杨与甜杨的亲缘性，以及植物中
miRNA与靶基因特殊的作用方式(近似完全互补)，
本文预测了甜杨低温响应 miR475的靶基因并分析
其在不同低温胁迫下的表达变化，结果显示甜杨幼
苗在低温下 miR475的表达与其预测靶基因的表达
呈相反趋势(miR475下调,靶基因上调) (图 3;图 4)，
这与毛果杨 miR475在低温诱导后呈下调趋势的研
究结果相一致(Sunkar and Zhu, 2004; Lu et al., 2005;
2008)，表明 miR475在两个物种间是保守的，在低温
环境下可能发挥着相似作用。
PPR属于植物中最大的蛋白家族之一，主要通
过转录后调控参与 RNA 加工及细胞器基因表达
(Lurin et al., 2004)。已有研究发现，PPR 为拟南芥
miR400 及毛果杨 miR474、miR475、miR476 的靶基
因，这些 miRNA与抗旱或抗冻密切相关(Small and
Peeters, 2000; Lu et al., 2005)；而且在毒麦及水稻中
也发现 PPR 在抗逆过程中发挥作用 (Baldwin and
Dombrowski, 2006; Ma et al., 2006)。本文中，通过对
489
图 3 0℃低温处理不同时间后甜杨幼苗叶片中 miR475靶基因表达的实时荧光定量 RT-PCR检测
注:以 Actin为内参,对照组表达量设为 1;图中所有数据为 3次 PCR重复的平均值; A~L:预测靶基因 1~12
Figure 3 The expression of miR475 target genes detected by real time quantitative RT-PCR in leaves of cold stress-treated P. suave-
olens seedlings
Note: Actin was used as reference gene and the normalized miR475 target mRNA in not-treated P. suaveolens seedlings was defined to
1; The presented data are means with standard deviations obtained from three independent PCR replicates; A~L: Predicated target
genes 1~12
低温胁迫响应的甜杨 miR475靶基因的预测及表达
Prediction and Expressing Analysis of the Cold Stress-Responsive miR475 Target Genes From P. suaveolens 490
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
图 2甜杨 miR475靶 mRNA降解位点的验证
注: mRNA的降解位点由 5 RLM- RACE验证,依次为靶基因
2, 5, 6;上面的序列为靶基因,下面的序列为 miR475,其互补
原则遵循Watson-Crick配对及 G: U摆动配对;图中用“↓”标
注出靶基因的降解位点
Figure 2 Experimental validation of the cleavage sites of miR475
target mRNAs from P. suaveolens
Note: The mRNA cleavage sites of target genes 2, 5 and 6 were
determined by modified 5 RNA ligase-mediated RACE; The
above lines represent target genes; The following lines represent
miRNA sequence.Watson-Crick pairing and G: U wobble pairing
(circles) are indicated; The mRNA cleavage sites of target gene
was marked by“↓”
图 4 0℃低温处理不同时间后甜杨幼苗叶片中 miR475表达的
实时荧光定量 RT-PCR检测
注:以 5.8S rRNA为内参,对照组表达量设为 1;图中所有数据
为 3次 PCR重复的平均值
Figure 4 Real time quantitative RT-PCR detected the expression
of miR475 in leaves of cold stress-treated P. suaveolens seedlings
Note: 5.8S rRNA was used as reference gene and the normalized
miR475 in not-treated P. suaveolens seedlings was defined to 1;
The presented data are means with standard deviations obtained
from three independent PCR replicates
甜杨 miR475相关的 12条靶基因序列分析后发现，
这些靶基因功能均集中于 PPR，且部分预测的靶基
因还含有 2个 miR475的结合位点(表 1)。有些研究
者认为，转录因子是 miRNA 靶基因的主要组成
(Sunkar and Zhu, 2004; Eckardt, 2004)，但可能作为植
物特有的抗逆调节蛋白 PPR并非是转录因子、且目
前动物中未见有关 PPR报道。由此可见，miRNA调
控靶基因表达的分子机制值得深入研究。
分析 miRNA靶基因降解位点可为研究 miRNA
及其靶基因功能奠定重要基础。Lu等(2005)利用 5
RLM-RACR方法对毛果杨 miR475的预测靶基因进
行验证，结果显示仅在 21%的靶基因成功检测到降
解位点；该研究结果也在本文中得到证实，在甜杨
miR475的 12条预测靶基因中仅有 3条靶基因(2, 5,
6)存在降解位点(图 2)，由此可推测这些靶基因可能
被其他 miRNA所降解、或者受到其它机制调控而并
非被降解。我们前期研究发现，除miR475外，甜杨中低
温响应的其它 miRNA (如 miR160, miR168b, miR164,
miR390和 miR393等)，在低温胁迫下存在着不同的
表达模式(孙润泽等, 2011)，由此推测甜杨在响应低
温后可能涉及诸多 miRNA构成的复杂调控机制，进
而调控靶基因 mRNA表达，最终引起代谢及信号转
导途径的变化实现对低温逆境的响应。
3材料与方法
3.1植物材料与处理
甜杨枝条经过水培后，选取生长良好的嫩芽进
行灭菌处理，依据林元震等(2004)方法建立甜杨无
菌组培体系(培养温度 25℃, 光照 16 h/d, 光照强度
2 200 lx)；甜杨生根无菌苗作为提取 DNA及 RNA
的材料；同时，选取生长期为 45 d的甜杨生根无菌苗
作为 0℃低温处理实验材料，按照孙润泽等(2011)方
法进行低温胁迫处理，分别收集叶片经液氮速冻后
保存于-80℃。
3.2 miR475靶基因预测
研究表明大部分已知植物 miRNA与靶 mRNA
蛋白编码区域的结合方式是近乎完美的互补配对
(Aukerman and Sakai, 2003; Chen, 2004)。为寻找潜在
的靶基因，根据已有方法(张磊等, 2011; Pani et al.,
2011)，采用同源性搜索方法预测 miRNA靶基因。首
先获得与 miR475 成熟序列(UUACAGUGCCCAUU
GAUUAAG)反向互补序列CTTAATCAATGGGCACT
GTAA；在 NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)上利用
BLASTn搜索毛果杨蛋白质编码 mRNA与 EST数据
库；同时，利用植物 miRNA靶基因预测软件 psR-
491
低温胁迫响应的甜杨 miR475靶基因的预测及表达
Prediction and Expressing Analysis of the Cold Stress-Responsive miR475 Target Genes From P. suaveolens
NATarget (http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/) (Dai
and Zhao, 2011)在毛果杨转录组中进行搜索，并去除
重复及无意义序列；所有序列通过 plant miRNA tar-
get alignment (http://www.leonxie.com/targetAlign.php)
(Xie and Zhang, 2010)验证与 miR475的互补结合。同
源性搜索遵循法则是错配数小于 4个碱基、在第 10
及 11位不能出现错配、不能出现连续 3个错配、不
能出现 gap。在 InterPro (http://www.ebi.ac.uk/inter-
pro/)中搜索最终得到的靶基因对应蛋白序列，并注
释其功能。
3.3甜杨总 RNA的提取
采用北京艾德莱生物科技有限公司的 EASYspin
plus植物 RNA快速提取试剂盒，依照使用说明提取
上述样品的总 RNA。
3.4甜杨 miR475的实时荧光定量
第一链 cDNA使用 miRcute miRNA cDNA第一
链合成试剂盒(Tiangen)合成，其操作步骤具体如下：
采用 Poly (A) Polymerase (1 U/μL)对低温处理不同时
间后的甜杨叶片总 RNA分别进行 3端加尾反应，然
后取加尾反应液 2 μL，利用反转录酶(quant reverse
transcriptase, 1 U/μL)合成第一链 cDNA，引物来自试
剂盒中所配套的 oligo d(T)；所得产物采用 miRcute
miRNA SYBR检测试剂盒(Tiangen)，通过 7500 Real-
Time PCR System 进行实时荧光定量 PCR 分析，重
复 3次；miR475的上游引物为 5-CGCTTACAGTG
CCCATTGATTAAGA-3，下游引物采用试剂盒中给
定引物；内参为 5.8s rRNA (上游引物: 5-CGATGAA
GAACGTAGCGAAATGC-3,下游引物采用试剂盒
中给定引物)。
表 2靶基因克隆引物
Table 2 Primers used for target genes cloning
靶基因
Target gene
XM_002319013.1
XM_002325743.1
XM_002336177.1
XM_002329199.1
DB891597.1
XM_002309526.1
XM_002301639.1
XM_006377350.1
XM_002310640.2
XM_006389244.1
XM_006389560.1
上游引物序列(5-3)
Forward primer (5-3)
TACAGTGCTTTGATGGACGGATAC
CTACGATGCTGTGATTTCCCTT
CAACGTGTTGATCTTGGGTTC
GACGATGCCCTTGCTTCTTTCA
ACCCACTATTGTCACATTTACC
GGTCTTCAACCCGATGCTGT
TGGGCAGCAAAGGTTACTCT
CCTTCCTTACAGTGCCCAATGAT
GCATCAATGGGTACTGCAAGGT
CCTGTAAGAGTGGAGGGATTGATG
GTGTATGTACGTGGCTTGGTTCC
下游引物序列(5-3)
Reverse primer (5-3)
TCGGGAGTCAAATCTCTGTCATAC
CAGGTTGACACCCTCTTGCTAC
AGCCTCATTCACCCGCCTATCTT
GAGTTGTAACCTCTTTCCACCG
ATCCAGCAGCCGCAGCAGTTTC
GACAGTAGGTTGACACCCGCTTG
TGTAAGAGTGAAATACCAGGAG
GCTTCCTTCTTTACAGAGCCCATT
CGCATCCCGAGGTCTCAAAG
CAATTCGGAAGCAGGCCATA
CGCACTTTCAATGTTCCCTTCC
产物长度(bp)
Length (bp)
200
266
333
368
179
123
157
273
146
181
87
3.5甜杨 miR475靶基因引物设计及验证
根据检索 NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)
所得到的预测靶基因序列，设计上下游引物(表 2)，
所设计引物位于 miRNA与靶基因结合位置的两侧，
便于荧光定量反应检测未被 miR475降解的靶基因；
以甜杨 cDNA为模板克隆靶基因并测序；分析靶基
因降解位点采用 5 RLM-RACR (Invitrogen)试剂盒，
5 RNA接头连接至 2 μg甜杨总 RNA后利用随机引
物进行反转录得到第一链 cDNA，最后进行 PCR扩
增，引物使用试剂盒中的 5 primer (5-CGACTGGAG
CACGAGGACACTGA-3)与 GSP (gene specific pri-
mer) (表 3)，扩增产物进行测序。
3.6甜杨 miR475靶基因的实时荧光定量
第一链 cDNA 由 iScript reverse transcriptase
(BIO-RAD)合成，方法参照说明书。以低温诱导不同
时间的甜杨 cDNA 为模板，利用 SYBR Premix Ex
Taq (TaKaRa)进行实时荧光定量 PCR分析；内参基
因为 actin，进行 3次重复；反应使用 20 μL体系，加
入 1 μL稀释后的 cDNA；引物设计见表 3，同步进
行反应，引物 Tm值均为 60℃左右；反应条件参照说
明书，实验结果由 7500 Real-Time PCR System soft-
ware分析。
表 3 RLM-RACE引物
Table 3 Primers used for RLM-RACE
编号
No.
2
5
6
登录号
Accession No.
XM_002325743.1
DB891597.1
XM_002309526.1
引物
Primer
GCAGGCTCCACGCCCATTTCAG
CGCAGCAAAGCCGAAGCCTCCT
CGCAGCAATGCCGAAGCCTCCT
492
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
作者贡献
通讯作者林善枝负责实验指导；第一作者胡惠
雯负责整个实验的具体实施及论文撰写、侯欣瑜负
责甜杨再生体系建立及低温处理；钮俊负责 miR475
靶基因部分数据分析；其他作者均参与了本实验具
体研究工作。
致谢
感谢大兴安岭塔河林业局赠送甜杨枝条、国家
自然科学基金项目(J1103516)对本研究的大力支持！
参考文献
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