全 文 ：粗毛栓菌漆酶的诱导及其对中性染料
和有机磷农药的降解*
靖德军1 摇 黄剑波2 摇 杨洲平1 摇 胡摇 容1 摇 程子彰1 摇 黄乾明1**
( 1 四川农业大学生命科学与理学院, 四川雅安 625014; 2 四川农业大学动物医学院, 四川雅安 625014)
摘摇 要摇 研究了不同初始培养 pH和培养时间下,不同诱导剂对粗毛栓菌产漆酶诱导特性的
影响及漆酶对中性染料、有机磷农药的降解.结果表明: RB鄄亮蓝、ABTS 和邻联甲苯胺对粗毛
栓菌产漆酶均有不同程度的诱导作用,其中 ABTS的诱导作用最好,其诱导的最适初始 pH为
4. 0,最佳时间为 13 d;所产漆酶的适宜反应温度为 38 益,酶在 40 益保温 20 min 仍可保留
78郾 6%的酶活力,稳定性较好;在 ABTS介导下,漆酶降解 6 种中性染料的最佳温度分别为 30
益(中性黑、中性枣红、中性桃红、甲基橙)和 60 益 (中性深黄、甲酚红),最适 pH 分别为 6. 0
(中性黑)、2. 0(中性枣红、中性桃红)和 4. 0(甲基橙、中性深黄、甲酚红),最佳降解时间分别
为 6 h(甲基橙、中性深黄和甲酚红)、12 h(中性桃红)和 24 h(中性枣红) .而漆酶降解乐果、
毒死蜱、敌百虫、哒嗪硫磷 4 种有机磷农药的最佳温度均为 25 益,最佳降解时间为 9 h,最佳
pH分别为 10. 0(乐果、毒死蜱、哒嗪硫磷)和 8. 0(敌百虫) .
关键词摇 粗毛栓菌摇 漆酶摇 难降解物摇 降解作用
文章编号摇 1001-9332(2011)12-3300-07摇 中图分类号摇 X592摇 文献标识码摇 A
Induce of laccase from Trametes gallica and its degradation on neutral dyes and organophos鄄
phorus pesticides. JING De鄄jun1, HUANG Jian鄄bo2, YANG Zhou鄄ping1, HU Rong1, CHENG Zi鄄
zhang1, HUANG Qian鄄ming1 ( 1College of Biology and Science, Sichuan Agricultural University,
Ya爷an 625014, Sichuan, China; 2College of Verterinary Medicine, Sichuan Agricultural University,
Ya爷an 625014, Sichuan, China) . 鄄Chin. J. Appl. Ecol. ,2011,22(12): 3300-3306.
Abstract: The characteristics of the induction of laccase in Trametes gallica under different initial
cultural pH, incubation time by different inducers were discussed, as well as the effects of tempera鄄
ture, pH and time on laccase degradation of six dyes and four organophosphors. The results showed
that RB鄄bright blue, ABTS and o鄄toluidine affected the production of laccase at different levels, and
ABTS was the best inductive agent in our test conditions, whose optimal initial pH and incubation
time were 4. 0 and 13 days, respectively. The appropriate reaction temperature of the laccase pro鄄
duced was 38 益, and it got a good stability, for it could retain 78. 6% of the enzyme activity after
20 min holding at 40 益 . Mediated by ABTS, the optimal temperature for laccase to degrade the six
types of neutral dyes could be divided into two cases, that was 30 益 (neutral black, neutral bor鄄
deaux, neutral pink, methyl orange) and 60 益 (neutral dark yellow, cresol red), the optimal pH
were 6. 0 (neutral black), 2. 0 (neutral bordeaux, neutral pink) and 4. 0 (methyl orange, neutral
dark yellow, cresol red), respectively, while the optimal times separately were 6 h (methyl or鄄
ange, neutral dark yellow, cresol red), 12 h (neutral pink) and 24 h (neutral bordeaux). And
using the same inductive agent, the best temperature for laccase to degrade dimethoate, chlorpyri鄄
fos, trichlorfon and parathion鄄pyridazine was 25 益, the suitable time was 9 h, and the optimal pH
was 10. 0 for dimethoate, chlorpyrifos and parathion鄄pyridazine, and 8. 0 for trichlorfon.
Key words: Trametes gallica; laccase; biorefractory compound; degradation.
*四川省教育厅重点科研项目(08ZA053)和四川农业大学科技创新基金项目(00731200)资助.
**通讯作者. E鄄mail: hqming@ sicau. edu. cn
2011鄄03鄄22 收稿,2011鄄08鄄29 接受.
应 用 生 态 学 报摇 2011 年 12 月摇 第 22 卷摇 第 12 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
Chinese Journal of Applied Ecology, Dec. 2011,22(12): 3300-3306
摇 摇 漆酶是一种含铜离子的多酚氧化酶,广泛分布
于高等植物(如漆树)和许多真菌中[1] .漆酶能够催
化氧化多种酚类和非酚类化合物,同时伴随有分子
氧还原成水[2] . 由于漆酶具有广泛的底物特性、催
化效率高,使之在环境治理[3]、纸浆废水处理[4-5]、
新型生物传感器研制[6]、工业纺织染料转化、食品
工业[7]和绿色有机合成[8]等方面有十分广泛的应
用前景[9],尤其是用以对环境中难降解有机污染物
进行降解[10-11]和脱毒[12],实现生物修复[13] .研究漆
酶对中性染料和有机磷农药的降解,对生态环境的
保护与修复具有重大意义.
粗毛栓菌(Trametes gallica)是一种能够分泌漆
酶的白腐真菌.有关该菌的研究已有诸多报道,诸如
发酵产酶条件[14]、启动子的分离鉴定[15]、漆酶的分
离纯化和酶学性质[16]、对考马斯亮蓝的脱色降
解[17]等,但有关漆酶对中性染料,特别是对有机磷
农药的降解研究,国内外尚无报道.本研究运用邻联
甲苯胺、ABTS[2,2鄄联氮鄄二(3鄄乙基鄄苯并噻唑鄄6鄄磺
酸)二铵盐]、RB 亮蓝(乙基鄄间磺基苄基鄄{4忆鄄[4义鄄
(间磺基苄基鄄乙基氨基)苯基鄄邻磺基苯基亚甲基}鄄
2忆5鄄亚苯基}鄄氢氧化铵内盐之二钠盐)3 种诱导剂分
别对粗毛栓菌进行诱导,并用 ABTS 诱导产生的粗
酶液对多种中性染料和有机磷农药进行降解,通过
改变降解条件,初步探究了漆酶降解中性染料和有
机磷农药的效果及其影响因素,为研究粗毛栓菌漆
酶降解中性染料和有机磷农药提供参考.
1摇 材料与方法
1郾 1摇 供试材料
供试粗毛栓菌由四川农业大学生命科学与理学
院化学生物学实验室保存.
供试培养基为 PDA固体培养基,缓冲溶液包括
pH 2郾 0 和 pH 7郾 0 两种 H3PO4 鄄K2HPO4缓冲溶液,种
子液培养基为每 90 mL 培养液中含硫酸铵(30郾 0
g·L-1)10郾 0 mL(氮源),葡萄糖(200 g·L-1)5 mL
(碳源),大量元素溶液 30郾 0 mL,微量元素溶液
30郾 0 mL,吐温鄄80 ( 10% ) 1 mL,维生素 B1 ( 100
mg·L-1)6郾 0 mL,双蒸水 8郾 0 mL.
产酶培养液按常文保等[18]的方法配制;大量元
素溶液、微量元素溶液按文献[19]配制.
1郾 2摇 研究方法
1郾 2郾 1 粗毛栓菌种子液的制备及诱导产酶培养试验
摇 将粗毛栓菌在 28 益下 PDA固体培养基倒置培养
7 d,用无菌生理盐水洗涤平板制成菌液. 血球计数
板计数制成 1伊108 ~ 1伊109个·mL-1的粗毛栓菌种
子液,再按 10%的比例将种子液接入产酶培养液,
150 r·min-1、28 益培养,第 3 天加入不同的诱导剂
诱导[20],连续数天测定漆酶粗酶液的酶活力,每组
数据平行测量 3 次,下同.
1郾 2郾 2 粗酶液的制备及酶活的测定摇 取少量培养液
于离心管中,在 6000伊g 条件下离心 10 min,上清液
即为粗酶液.
漆酶活的测定参照文献[21-23]进行,并稍加
改进:3 mL 反应总体积中,含 0郾 1 mL 粗酶液,2郾 7
mL 0郾 1 mol·L-1醋酸鄄醋酸钠缓冲液(pH 4郾 5),加
入 0郾 2 mL 0郾 5 mmol·L-1 ABTS后,28 益水浴保温 1
min以启动反应,测定 3 min 内在 420 nm 处的吸光
度的变化(着420 =36000 mol-1·cm-1).如果吸光度太
大,则需要稀释一定倍数以使结果准确.定义每分钟
使 1 滋mol ABTS 转化所需的酶量为 1 个活力单位
(U).
酶活力(U·L-1 ) = [1000 伊0郾 1844 伊(A2 -A1 ) 伊
60伊稀释倍数] / t
式中:A2为反应前体系的吸光度;A1为反应后体系的
吸光度.
1郾 2郾 3 温度对漆酶反应活性和热稳定性的影响试验
摇 取 ABTS诱导的初始培养 pH 4郾 0 条件下培养 13
d 的粗酶液,并在 20 益 ~70 益的温度梯度条件下测
定漆酶的酶活力,以酶活力最高者为 100% ,分别计
算各反应温度下的相对酶活;另取粗酶液在 20 益 ~
70 益保温 20 min后迅速冷至室温,测残余相对酶活
考察漆酶热稳定性 (以未经保温酶液的酶活为
100% ).
1郾 2郾 4 漆酶对中性染料降解的影响因素试验摇 在 50
mL 锥形瓶中加入 1 mL 粗酶液和 250 滋L 50
mg·L-1的 ABTS,加入一定浓度的染料,稀释至 25
mL,使染料终浓度为 20 mg·L-1,分别在不同 pH
(2郾 0 ~ 7郾 0)和不同温度(30 益 ~70 益)条件下降解
24 h,分别测定染料的降解率,以考察 pH 和温度对
漆酶降解染料的影响.
选取上述试验中影响因子的最佳条件进行染料
降解试验,分别在 6、12、18 和 24 h 时测定吸光度,
以考察时间对漆酶降解染料的影响. 漆酶对染料的
降解率计算公式:
按降解率=(A0-A) / Ao伊100%
式中:A0为染料降解前的吸光度;A为降解一段时间
后的吸光度.
1郾 2郾 5 漆酶对有机磷农药降解的影响因素试验摇 向
103312 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 靖德军等: 粗毛栓菌漆酶的诱导及其对中性染料和有机磷农药的降解摇 摇 摇 摇 摇 摇
10 mL浓度为 100 mg·L-1的有机磷农药溶液中加
入 10 mL漆酶粗酶液.分别降解 3、6、9 和 12 h 测定
磷酸根浓度,考察降解时间对漆酶降解有机磷农药
的影响;pH 4郾 5 时分别在 10 益、15 益、20 益、25 益、
30 益和 35 益条件下降解 6 h后测定磷酸根的浓度,
考察温度对降解过程的影响;分别调节溶液 pH 为
5郾 0、6郾 0、7郾 0、8郾 0、9郾 0 和 10郾 0,室温条件下降解 6 h
测定磷酸根浓度,考察 pH 对降解过程的影响.有机
磷农药被漆酶降解所产生的磷酸根采用磷钼蓝分光
光度法测定,有机磷农药降解率的计算参考文献
[24].
1郾 3摇 数据处理
试验数据均采用 Microsoft Excel 2007 和 Origin
8郾 5 分析软件进行处理;用 SPSS 19郾 0 软件分析显著
性差异,Duncan法检验,设定 琢=0郾 05.
2摇 结果与分析
2郾 1摇 粗毛栓菌的产漆酶条件
2郾 1郾 1 时间和诱导剂对粗毛栓菌产漆酶的影响摇 诱
导培养粗毛栓菌 20 d,测定不同诱导剂对漆酶活力
的影响,结果如图 1 所示.
摇 摇 诱导后的第 1 天即可测到漆酶活性,可见诱导
剂对漆酶产生具有非常关键的作用. 这可能是因为
漆酶作为一种胞外蛋白,其分泌受诱导物的影响很
大.随着粗毛栓菌的生长,其分泌的漆酶逐渐增多,
漆酶活性也逐渐增强,在第 13 天达到峰值,随后漆
酶活性逐渐降低.
RB鄄亮蓝、ABTS和邻联甲苯胺对粗毛栓菌产漆
酶均有不同程度的诱导作用,但受 ABTS 诱导所产
的粗酶液的活性总体要高于其他两种诱导剂,说明
图 1摇 3 种诱导剂对粗毛栓菌产酶的影响
Fig. 1 摇 Effects of three kinds of inducers on laccase enzyme
production of Tramete gallica.
玉:ABTS; 域:RB亮蓝 RB bright blue; 芋:领联苯胺 o鄄toluidine; CK:
对照 Control.
ABTS 是三者之中最好的诱导剂. 后续试验均以
ABTS诱导产生的粗酶液为研究对象.
2郾 1郾 2 初始培养 pH 对产酶的影响 摇 设置初始培养
pH(2郾 0 ~ 9郾 0)梯度,取第 13 天的粗酶液分别测定
酶活力,考察初始培养 pH 对漆酶活力的影响.结果
表明,在不同初始培养 pH 的种子液培养基中,随着
pH值逐渐增大,漆酶活力先增加,然后逐渐减小,在
pH 4郾 0 时,漆酶活力最大. 说明粗毛栓菌产酶的最
佳初始培养 pH为 4郾 0(图 2).
2郾 1郾 3 温度对漆酶反应活性及热稳定性的影响摇 取
ABTS诱导第 13 天的粗酶液,以 ABTS 为底物,分别
测定酶活力,以酶活力最高者为 100% ,分别计算各
反应温度下的相对酶活,以考察温度对漆酶活力的
影响;设置温度梯度(20 益 ~70 益),保温 20 min后
迅速冷至室温,测定残余相对酶活(以未经保温酶
液的酶活为 100% ),考察温度对漆酶热稳定性的影
响,结果见图 3.
摇 摇 漆酶的活力和稳定性均受温度较大影响,最适
反应温度约为 60 益,而且在约 20 益时最稳定.温度
超过 20 益后,随着温度的升高,漆酶的稳定性逐渐
下降,在最适反应温度60 益 (酶活最高)时漆酶的
图 2摇 初始培养 pH对漆酶活性的影响
Fig. 2摇 Effect of initial cultural pH on the activity of laccase.
图 3摇 温度对漆酶活性及稳定性的影响
Fig. 3摇 Effect of temperature on laccase爷s activity and stability.
a)相对酶活性 Relative enzyme activity; b)相对稳定性 Relative stability.
2033 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 22 卷
稳定性已经很低,可能是由于温度升高使漆酶空间
结构发生改变,导致漆酶不能有效地发挥其催化作
用.综合考虑这两方面因素,取两曲线交点处的温度
(38 益)为漆酶的最适宜反应温度.
2郾 2摇 漆酶对中性染料的降解及其影响因素
2郾 2郾 1 pH 对漆酶降解染料的影响 摇 设置 pH 梯度
2郾 0 ~ 7郾 0,用 ABTS诱导第 13 天的粗酶液分别对各
中性染料溶液降解 24 h,测定其吸光度并计算各染
料的降解率,以考察 pH对漆酶降解染料的影响(图
4).各染料在 pH梯度范围内的变化趋势不尽相同:
中性深黄、中性枣红和中性桃红随着 pH 的增大酶
对染料的降解率呈下降趋势,在pH 2郾 0时降解率
图 4摇 pH、温度和时间对漆酶降解染料的影响
Fig. 4 摇 Effect of pH, temperature and time on degradation of
dyes by laccase.
玉:中性黑 Neutral black; 域:中性枣红 Neutral bordeaux; 芋:中性桃
红 Neutral pink; 郁:甲基橙 Methyl orange; 吁:中性深黄 Neutral dark
yellow; 遇:甲酚红 Cresol red.
最高,但考虑到 pH低于 2郾 0 酶容易失活,故确定其
降解的最适 pH 为 2郾 0.甲基橙、甲酚红的曲线呈抛
物线,其降解率的最高点出现在 pH 4郾 0,而中性黑
的最适 pH为 6郾 0.
2郾 2郾 2 温度对漆酶降解染料的影响摇 设置温度梯度
30 益 ~70 益,用 ABTS 诱导第 13 天的粗酶液分别
对各中性染料溶液降解 24 h,测定其吸光度并计算
各染料的降解率,以考察温度对漆酶降解染料的影
响(图 4). 6 种中性染料中,中性深黄和甲酚红在 60
益时降解率最大,最适温度为 60 益;其他染料降解
则在 30 益达到最大,最适温度为 30 益 .
2郾 2郾 3 时间对漆酶降解染料的影响摇 在各种染料降
解的最适 pH 和温度下,用 ABTS 诱导第 13 天的粗
酶液分别对各中性染料溶液降解 24 h,测定其吸光
度并计算各染料的降解率,以考察时间对漆酶降解
染料的影响(图 4).漆酶降解中性深黄、甲基橙和甲
酚红的降解率随着降解时间的延长而缓慢增加,从
经济角度考虑,这 3 种染料的最佳降解时间选择在
6 h;中性桃红的降解率在 12 h 前增加较快,12 h 后
降解率的增速减缓,因此,选择 12 h 作为其最佳降
解时间;中性枣红的降解率在 24 h内呈“J冶型增长,
在 24 h时的降解率最高,故选择 24 h作为其最佳降
解时间.漆酶对中性黑的降解率曲线呈抛物线,目前
尚未见到类似现象的报道,其原因有待进一步研究.
2郾 3摇 漆酶对有机磷农药的降解及其影响因素
2郾 3郾 1 温度对漆酶降解有机磷农药的影响摇 pH 4郾 5
时分别在 10 益、15 益、20 益、25 益、30 益和 35 益条
件下,用 ABTS诱导第 13 天的粗酶液对 4 种有机磷
农药溶液降解 6 h, 测定磷酸根的浓度并计算有机
磷农药的降解率,以考察温度对其降解过程的影响
(图 5).随着温度的升高,磷酸根的生成量逐渐增
加,说明漆酶对 4 种有机磷农药的降解率逐渐增加,
但增加的趋势平缓,在 25 益时达到峰值,温度再升
高,降解率则呈缓慢降低的趋势,说明最佳降解温度
为 25 益 .
2郾 3郾 2 pH对漆酶降解有机磷农药的影响 摇 分别调
节各有机磷农药溶液的 pH 为 5郾 0、6郾 0、7郾 0、8郾 0、
9郾 0 和 10郾 0,用 ABTS诱导第 13 天的粗酶液室温条
件下降解 6 h,测定磷酸根浓度并计算各有机磷农药
的降解率,以考察 pH对降解过程的影响(图 5).在
pH 5郾 0 ~ 10郾 0 范围内,pH 值越高,漆酶对乐果、毒
死蜱和哒硫磷嗪 3 种农药的降解率越高;而漆酶对
敌百虫的降解率则先升高再下降,当 pH 为 8郾 0 时
降解率最高.
303312 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 靖德军等: 粗毛栓菌漆酶的诱导及其对中性染料和有机磷农药的降解摇 摇 摇 摇 摇 摇
图 5摇 pH、温度和时间对漆酶降解 4 种有机磷农药的影响
Fig. 5摇 Effect of pH, temperature and time on degradation rate
of four kinds of organic phosphorus pesticide degraded by lacca鄄
se.
玉:乐果 Dimethoate; 域:Chlorpyrifos; 芋: Parathlon鄄pyrldazlne; 郁:
Trichlorphon. 下同 The same below.
2郾 3郾 3 降解时间对有机磷农药降解率的影响 摇 pH
4郾 5、室温条件下,用 ABTS诱导第 13 天的粗酶液分
别对各有机磷农药溶液降解 3、6、9 和 12 h 后,测定
磷酸根浓度并计算各有机磷农药的降解率,以考察
时间对降解过程的影响(图 5). 漆酶对各有机磷农
药的降解率随时间变化的趋势比较一致,随着降解
时间的延长,各有机磷农药的降解率逐渐增加,9 h
的降解率增加最快,随后增速逐渐趋于缓和.各有机
磷农药的最佳降解时间均在 9 h左右.
2郾 3郾 4 优化条件下有机磷农药的降解率摇 在各有机
磷农药的最佳降解条件下,用 ABTS 诱导第 13 天的
粗酶液分别对有机磷农药溶液降解 3、6、9 和 12 h
后 ,测定磷酸根浓度并计算其降解率(图6) .在4种
图 6摇 最佳条件下漆酶对 4 种有机磷农药的降解
Fig. 6摇 Degradation of four kinds of organophosphorus pesticides
under optimum conditions by laccase.
有机磷农药的相应最佳条件下,漆酶对各有机磷农
药的降解率都有较大幅度的提高;且以 9 h 的降解
率增加最快,而后渐趋缓慢.其中乐果的降解效果最
明显,达到 19郾 6% ;其他 3 种农药的降解率分别达
到 12郾 5% 、8郾 5%和 16郾 5% .
3摇 讨摇 摇 论
漆酶是微生物生长代谢过程中合成的具有特殊
功能的蛋白质,漆酶合成的时间和水平取决于产酶
菌株生长特性和代谢状况,凡是能影响菌株生长和
代谢过程的各种理化因素都能影响真菌漆酶的合
成[19] .漆酶也是一种胞外木质素降解酶,其合成在
很大程度上需要诱导物的诱导作用. 凡是与木质素
单体结构相似的小分子芳香化合物都可以作为漆酶
的诱导剂,向培养基中加入适量的诱导剂能提高所
产漆酶的活性[19] . 本试验表明,ABTS、RB 亮蓝、邻
联苯胺对产漆酶均有比较明显的诱导作用,支持文
献[25]报道的结果.
试验结果还显示,在 20 益 ~ 70 益范围内,随着
温度的升高,漆酶的活性先升高后下降(60 益时最
高),稳定性在 20 益时最高而后逐渐下降,所以在
应用漆酶进行科学研究或生产实践时应综合考虑这
些因素的影响.
丁莉[26]在漆酶对染料的降解研究中发现,漆酶
的反应温度在 20 益 ~60 益,当温度达到 70 益时酶
开始失活,90 益酶已完全失活,本试验与其基本相
符.试验中发现,大多数染料的降解率都随时间的延
长而增大,后随时间的延长降解率缓慢增加,符合
Michaelis鄄Menten假说[27] .
本试验结果还表明,漆酶对乐果等 4 种有机磷
农药的降解率达到一定的水平,这与其他研究[28-30]
结果有一定差距,说明不同催化降解方法对有机磷
4033 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 22 卷
农药的降解作用有很大的差异. 其原因可能是不同
的催化物质与有机磷分子结合以及发挥催化降解作
用的机制不同.在 20 益 ~ 30 益范围内漆酶对 4 种
有机磷农药的降解率最大,且受温度的影响较小,更
适合自然环境下的降解;其最佳降解时间约为 9 h,
比 TiO2和过氧化氢的降解时间缩短 30%左右[28],
体现了漆酶的快速、高效.
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作者简介摇 靖德军, 男,1986 年生,硕士研究生.主要从事生
物化学与分子生物学研究. E鄄mail: jingdejun001@ 163. com
责任编辑摇 肖摇 红
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