全 文 ：重阳木降解纤维素内生真菌的筛选研究
肖春玲 , 蒙玉娟 , 邹小明 , 李晓红　(井冈山学院生命科学学院 ,江西吉安 343009)
摘要　通过对重阳木茎内皮内生真菌的分离纯化 ,得到 7株内生真菌。采用羧甲基纤维素钠培养基进行纤维素降解能力初步测定 ,并
且结合漆酶酶活测定方法比较其降解力 ,得到 5株具有降解纤维素能力的内生真菌。
关键词　重阳木;内生真菌;漆酶;纤维素降解
中图分类号　Q936　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2007)04-00956-01
Isolation and Purity of Cellulose Decomposition Strains in Bischofia polycarpa
XIAO Chun-ling et al　(Department of Biology Sciences , Jinggangshan University, Jian , Jiangxi 343009)
Abstract　 Seven strainswere obtained by screening the strains from the stem s inner bark of Bischofia polycarpa.TheCMC-Na cellulose agarwas adopt-
ed to study the cellulose decomposition activity in combination with the activity of the laccase.Five strains were isolated from Bischofia polycarpa with the
activity of decomposing the cellulose efficiently.
Key words　 Bischofia polycarpa;Endophytic fungi;Laccase;Cellulose decomposition
　　纤维素是由葡萄糖以 β-1 , 4-糖苷键连接而成的线状大分
子物质。植物纤维素占植物体干重的 33.4%～ 50%,是地球
上最丰富的可再生资源 。但是 ,由于纤维素中存在许多高能
的氢键 ,所以水解 、利用纤维素均很困难。据粗略统计 ,我国
每年产农作物秸秆约 5.8亿 t ,占世界秸秆总产量的 20%～
30%,其中一部分作燃料 ,一部分作填充饲料 ,只有很少的一
部分过腹还田或直接还田[ 1] 。因此 ,造成纤维素自然资源的
巨大浪费。如何科学 、合理的开发利用纤维素资源已成为全
世界范围内的一项重要研究课题。而微生物降解纤维素原
料生产乙醇 、单细胞蛋白 、有机酸 、酚类以及高聚物等 ,有可
能改变传统的生产方式[ 2] 。
秸秆中约有一半为纤维素类物质 ,木质素只占 13%～
25%。木质素的侧链与半纤维素以共价键结合 ,形成一个十
分致密的网络结构 ,将纤维素紧紧包裹在里面 ,以屏蔽效应
阻碍纤维素酶吸附纤维素分子[ 3] 。所以 ,要彻底降解纤维
素 ,首先必须降解木质素。而降解木质素过程中分泌的漆酶
是快速检测木质素分解程度的重要指标[ 4] 。吴元喜等研究
表明 ,纤维素分解菌降解程度在很大程度上依赖于木质素降
解菌的分解能力 ,且利用酶解 、生物发酵往往只能降解木质
纤维素的某一方面[ 5] 。笔者试图从筛选降解纤维素特性的
菌株入手 ,结合 2种功能菌株之间的协同效应 ,筛选出漆酶
活性高且快速降解纤维素的菌株。这对农业生产和利用微
生物转化秸秆为可利用的饲料方面有着重要的意义。
1　材料与方法
1.1　试验材料　重阳木于 2006年 3月采自井冈山学院内 ,
取其 1～ 2年生枝条的茎内皮。
1.2　培养基
1.2.1　分离培养基和斜面培养基。马铃薯 200 g ,蔗糖 20 g ,
琼脂 20 g ,水 1000ml , pH 自然。
1.2.2　筛选培养基。羧甲基纤维素钠(CMC-Na)20 g ,蛋白胨
10.1g ,酵母粉 5g ,NaCl 5g ,KH2PO4 1.0g ,MgSO4·7H2O 0.2g ,
琼脂 20 g ,蒸馏水 1000ml ,pH自然。
1.2.3　PDA+α-萘酚培养基。在 PDA培养基中加α-萘酚 ,使
其在培养基中的浓度为 0.0005mol/L , pH 自然。
作者简介　肖春玲(1962-),女 , 江西吉安人 ,教授 ,从事微生物学的教学与科研工作。收稿日期　2006-10-28
1.3　分类鉴定　根据《真菌鉴定手册》[ 6] ,对内生真菌进行
初步鉴定。
1.4　内生真菌分离纯化　用自来水冲洗植物材料 ,再用
90%酒精浸泡材料 1min ,无菌水冲洗 ,消毒后的茎材料用刀
片削去外皮 ,取内皮层 ,放在 PDA培养基上 , 28 ℃条件下培
养 48～ 96 h后 ,不断转接 、分离 ,直至纯化。
用无菌的直径为 0.5 cm 的打孔器将内生真菌平皿培养
物打成小圆饼块状 ,获得均一大小的琼脂块 ,然后将其接种
于以 CMC-Na为惟一碳源的筛选培养基上 ,25 ℃培养48 h后
根据其透明圈大小 ,筛选出降解纤维素优良菌株。
1.5　漆酶活性比较　用无菌的直径为 0.5 cm的打孔器将内
生真菌平皿培养物打成小圆饼块状 ,贴到PDA+α-萘酚培养
基上 。当其周围出现明显紫色圈时 ,说明有漆酶分泌 ,记录
菌落从贴上到开始变色的时间。
2　结果与分析
2.1　菌株分离纯化及筛选结果　从采集的样品中共分离纯
化得到 7株内生真菌 ,有 5株具有降解纤维素的能力 ,而菌
株 2和菌株 3无降解能力 。
　　由表 1可知 ,菌株 6和菌株 7降解纤维素的能力较强 ,但
漆酶活性偏低;菌株 4和菌株 5具有较高的降解纤维素的能
力和漆酶活性;菌株 1降解纤维素的能力不强 ,但漆酶活性
居中;菌株 2和菌株 3不表现降解纤维素的能力 ,且产漆酶
量少。研究表明 ,重阳木内生真菌的漆酶活性在第 2天出
现 ,第 4天出现活性高峰 ,之后酶水平缓慢下降。
　　表1 重阳木内生真菌透明圈及漆酶变色圈大小 cm
菌株编号 透明圈直径 变色圈直径
1 0.9 1.2
2 - 0.7
3 - -
4 1.4 1.4
5 1.6 1.5
6 2.0 1.0
7 1.8 1.1
2.2　内生真菌的初步鉴定　据初步鉴定 ,这 5株菌株分属
于球拟酵母属(Torulopsis sp)、黑曲霉属(Asper gillus sp)和毕赤
酵母属(Pichia sp),结果见表 2。
(下转第 959页)
安徽农业科学 , Journal of Anhui Agri.Sci.2007 , 35(4):956, 959　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　责任编辑　刘月娟　责任校对　胡先祥
cAMP和 xenobiotics转录调控区。在Cs-mnp3中也发现了上
述调节区域。Cs-mnp2A 、Cs-mnp2B受到Mn的激活 ,Cs-mnp3
则没有[ 17] 。C.subvermispora MnP3的 cDNA和 Cs-mnp1基因
编码MnP为一种同工酶 , cDNA从文库Lambda载体 ZIPLOX
中鉴别到除去 polyA含有 1285个核苷酸 ,G+C含量 63%,
成熟蛋白有 364 aa ,前端 24aa导肽 ,与MnP过氧化物酶机制
相一致 。Cs-mnp1基因有 7个小的插入序列(内含子),遵循
GT-AG核 CTRAY法则 。在启动密码子 5端发现 TATAA ,也
鉴定到了CCAAT元件 、SP-1 AP-2区域和一些热激蛋白和金
属反应元件[ 18] 。Elfvingia applanata 中编码MnP的基因 Ea.
mnp1包含有 1 095 bp 开放阅读框 ,编码 364 个 aa 残基 。
Northern blot分析表明 ,Mn2+可增加该基因转录[ 19] 。
7　展望
由于底物专一性较弱 ,MnP可氧化各类芳香族化合物
及一些难被生物降解的物质 ,可在生物制浆 、纸浆的酶法漂
白 、有机污染物的降解和环境的生物修复等方面得到有效
的应用 ,因而具有极高的工业应用潜力。但由于其底物的
多样性及酶本身结构 、基因编码 、调控表达的复杂性 ,所以
国内的研究尚处于初期阶段;国外在MnP的分子生物学 、高
效表达体系的构建等研究尚有待深入[ 1] 。因此 ,加快对
MnP遗传学和生理学机理的研究 ,构建高效表达载体 ,实现
MnP的工业化生产 ,不但对实现生物能的绿色转化具有重
要意义 ,而且为治理环境污染开辟了新途径 。
参考文献
[ 1] 陈文新.陈文新论文集[M] .北京:中国农业大学出版社, 2006.
[ 2] SUNDARAMOORTHYM , KISHIK , GOLDM H , et al.The crystal structure of
manganese peroxidase fron Phanerochaete chrysosporium at 2.06 resolution
[ J] .J Biol Chem ,1994, 269:32759-32767.
[ 3] 刘尚旭,赖寒.木质素降解酶的分子生物学研究进展[ J] .重庆教育学院学报, 2001,14(3):64-67.
[ 4] IMAMURA CM , OOHIRAL K , KITAGAWA R , et al.Improvement of H2O2
stability of manganese peroxidase by combinatorial mutagenesis and high-
throughput screening using in vitroexpression with protein disulfide isomerase
[ J] .Protein Engineering , 2003 ,16(6):423-428.
[ 5] READING N S , AUST S D.Effect of modified hemes on the spectral properties
and activity of manganese peroxidase[ J] .Archives of Biochemistry and Bio-
physics , 1998, 359(2):291-296.
[ 6] 陈立祥 , 章怀云.木质素生物降解及其应用研究进展[ J] .中南林学院
学报 ,2003,23(1):79-85.
[ 7] MESTER T , FIELD J A.Characterization of a novel manganese peroxidase-
lignin peroxidase hybrid isozyme produced by bjerkandera speciesstrain BOS55
in the absence of manganese[ J] .The Journal of Biological Chemistry ,1998, 25
(19):15412-15417.
[ 8] HAH C, HONDA Y , WATANABE T , et al.Production of manganese peroxi-
dase by pellet cultureof the lignin-degrading basidiomycete , Pleurotus ostreatus
[ J] .Appl Microbiol Biotechnol ,2001,55:704-711.
[ 9] LANKINEN V P , BONNEN AM.ANTON LH , et al.Characteristics and N-
terminal amino acid sequence of manganese peroxidase from solid substrate cul-
tures of Agaricus bisporus[ J] .Appl Microbiol Biotechnol ,2001, 55:170-176.
[ 10] GIARDINA P , PALMIERIG , FONTANELLA B, et al.Manganese peroxidase
isoenzymes produced by Pleurotus ostreatus grown on wood sawdust [ J] .
Archives of Biochemistry and Biophysics ,2000, 376(1):171-179.
[ 11] STEFFEN K T , HOFRICHTER M , HATAKKA A , et al.Purification and
characterization of manganese peroxidases from the litter-decomposing basid-
iomycetes Agrocybe praecox and Stropharia coronilla[ J] .Enzyme and Micro-
bial Technology , 2002 ,30:550-555.
[ 12] P RI F H, SHENG D , GOLDM H.Purification and characterization of two
manganese peroxidase isozymes from tile white-rot basidiomycete Dichomitus
squalens[ J] .Biochimica et Biophysica Acta , 1996, 1297:139-148.
[ 13] REK R , KA N , PAZARLIOGLU S.Purification and partial characteriza-
tion of manganese peroxidase from immobilized Phanerochaete chrysosporium
[ J] .Process Biochemistry , 2004 ,39:2061-2068.
[ 14] BABOROV P , M DERM , BALDRIAN P , et al.Purification of a new man-
ganese peroxidase of the white-rot fungus Irpex lacteus , and degradation of
polycyclic aromatic hydrocarbons by the enzyme[ J] .Research inMicrobiology ,
2006, 157:248-253.[ 15] WANG Y, DUHALT R V , PICKARDM A.Purification , characterization, and
chemical modificationof manganese peroxidase from Bjerkanderaadusta UAMH
8258[ J] .Current Microbiology , 2002 ,45:77-87.
[ 16] ZIEGENHAGEN D , HOFRICHTER M.A simple and rapid method to gain
high amounts of manganese peroxidase with immobilizedmycelium of the agaric
white-rot fungus Clitocybula dusenii[ J] .ApplMicrobiol Biotechnol , 2000 ,53:
553-557.
[ 17] TELLO M , CORSINII G , LARRONDO L F , et al.Characterization of three
new manganese peroxidase genes from the ligninolytic basidiomycete Ceripori-
opsis subvermispora[ J] .Biochimica et Biophysica Acta , 2000 ,1490:137-144.[ 18] LOBOS S , LARRONDO L , SALAS L , et al.Cloning and molecular analysis of
a cDNA and the Cs-mnp1 gene encoding a manganese peroxidase isoenzyme
from the lignin-degradingbasidiomycete Ceriporiopsis subvermispora[ J] .Gene ,
1998, 206:185-193.
[ 19] MAEDA Y , KAJIWARA S , OHTAGUCHI K.Manganese peroxidase gene of
the perennial mushroom Elfvingia applanata:cloning and evaluation of its re-
lationship with lignin degradation[ J] .Biotechnology Letters , 2001, 23:103-
109.
(上接第 956页)
　　表2 内生真菌的初步鉴定结果
菌株编号 初步鉴定
1 球拟酵母属
2 -
3 -
4 黑曲霉属
5 黑曲霉属
6 毕赤酵母属
7 毕赤酵母属
　注:“ -”代表该菌无降解能力 ,未进行鉴定。
3　讨论
研究表明 ,与霉菌相比 ,酵母菌的漆酶活性普遍偏低 ,
与它们产生的透明圈大小不成正比。菌株 6的透明圈直径
2.0 cm , 但其漆酶变色圈直径只有 1.0 cm。这可能与酵母
菌降解木质素的机理有关。霉菌降解木质素是依靠分泌大
量的胞外酶进行的 ,而大多数酵母菌对木质素的降解并非
是依靠胞外酶进行的 。有些酵母菌可以附着在纤维上缓慢
降解纤维素 。在自然状态下 ,纤维素的彻底降解是多种微
生物长时间相互作用的结果。这一过程仅依靠一种微生物
是无法实现的 。由于分解纤维素的酶体系是由多种组分组
成的 ,因此在进行纤维素大分子降解的研究过程中应考虑
微生物的产酶体系之间的协同效应。
参考文献
[ 1] 曹玉凤 ,李建国.生物技术在处理农作物秸杆饲料中的应用[ J] .饲料
研究, 1999 ,22(1):25-26.
[ 2] 丰绪霞 ,徐艳玲.单一菌种微生物对植物纤维素降解的研究[ J] .林业
科技情报 ,2004(1):57.
[ 3] 史央,蒋爰芹 ,戴传超 ,等.秸秆降解的微生物学机理研究及应用进展
[ J] .微生物学杂志, 2002 ,22(1):47-50.
[ 4] 姜笑梅 ,刘晓丽,朱家琪 ,等.漆酶处理对木质纤维和纤维板微细结构
的影响[ J] .电子显微学报 , 2005 ,24(5):484.
[ 5] 吴元喜 ,张晓昱,胡佳华 ,等.木质纤维素分解菌筛选及木质素纤维素降解[ J] .华中农业大学学报, 1997, 16(6):614-616.
[ 6] 魏景超.真菌鉴定手册[M] .上海:上海科学技术出版社 , 1979.
95935卷 4期　　　　　　　　　　　　　　　　　赵士豪等　锰依赖过氧化物酶研究进展