全 文 ：几种经济作物根际拮抗细菌的多样性*
徐莹莹1 摇 杜秉海1,2 摇 姚良同1 摇 靳奉理1 摇 王翠翠1 摇 王摇 璇1 摇 丁延芹1**
( 1山东农业大学生命科学学院微生物学系, 山东泰安 271018; 2山东省农业微生物重点实验室, 山东泰安 271018)
摘摇 要摇 采用抗菌谱测定以及 BOXAIR鄄PCR、生理生化特征和 16S rDNA 序列分析等方法对
分离自 10 种作物根际的 55 株拮抗细菌的多样性及主要拮抗菌类群进行了分析.结果表明:
根际拮抗细菌的拮抗作用具有丰富的多样性;BOXAIR鄄PCR分析中供试菌在 72郾 1%相似性水
平上可以聚为 7 个群,85郾 0%相似性水平上聚为 25 个群;所有供试根际拮抗菌分别属于芽孢
杆菌属 ( Bacillus)芽孢杆菌属 ( Paenibacillus)、短芽孢杆菌属 ( Brevibacillus)、假单胞菌属
(Pseudomonas)和产碱菌属(Alcaligenes) .作物根际拮抗菌具有丰富的遗传多样性和拮抗性能
多样性.
关键词摇 根际摇 抗菌谱摇 BOXAIR鄄PCR摇 16S rDNA摇 多样性
文章编号摇 1001-9332(2012)02-0511-08摇 中图分类号摇 Q938. 2摇 文献标识码摇 A
Diversity of antagonistic bacteria isolated from rhizosphere of several cash crops. XU Ying鄄
ying1, DU Bing鄄hai1,2, YAO Liang鄄tong1, JIN Feng鄄li1, WANG Cui鄄cui1, WANG Xuan1, DING
Yan鄄qin1 ( 1Department of Microbiology, College of Life Science, Shandong Agricultural University,
Tai爷an 271018, Shandong, China; 2 Shandong Province Key Laboratory for Agriculture Microbiolo鄄
gy, Tai爷an 271018, Shandong, China) . 鄄Chin. J. Appl. Ecol. ,2012,23(2): 511-518.
Abstract: By adopting antimicrobial spectrum test, BOXAIR鄄PCR, physiological and biochemical,
and 16S rDNA sequencing analysis, this paper analyzed the diversity of 55 antagonistic bacterial
strains isolated from the rhizosphere of 10 cash crops. There was a high diversity of the antagonism
of the strains. Based on BOXAIR鄄PCR, all the strains were clustered into 7 groups at the similarity
level of 72郾 1% , and divided into 25 groups at the similarity level of 85郾 0% . All the strains be鄄
longed to Bacillus, Paenibacillus, Brevibacillus, Pseudomonas and Alcaligenes, respectively. The
antagonistic bacteria isolated from the rhizosphere had high genetic diversity and high diversity in
antagonistic activity.
Key words: rhizosphere; antimicrobial spectrum; BOXAIR鄄PCR; 16S rDNA; diversity.
*国家公益性行业(农业)科研专项(200903018,nyhyzx07鄄024)资助.
**通讯作者. E鄄mail: dingyq6885@ 163. com
2011鄄04鄄28 收稿,2011鄄12鄄01 接受.
摇 摇 土传病害是以土壤为媒介进行传播的植物病害
的统称,常见的种类有青枯病、立枯病、黄萎病以及
根腐病等.植物土传病害病原菌通常侵染植物根部,
引起作物根部乃至全株发病,每年给农业生产造成
的直接经济损失为40% ~60% ,严重地块甚至达
80%以上[1-2] . 土传病害的防治主要是利用抗病品
种和农药,抗病品种的选育周期长,而农药特别是化
学农药因见效快、杀菌谱广、成本低等特点在作物土
传病害的防治上发挥了巨大作用,但是长期、反复和
大量使用化学农药引起一系列的弊病,诸如土壤和
水等环境的污染、农副产品中农药残留的增加造成
食品安全等问题日益加重[3-4] .
生物防治与化学防治相比具有不易使病原菌产
生耐药性、对人畜安全无毒、不污染环境、无残留和
具有对作物的促生作用等优点,越来越受到人们的
重视[5] .植物根际促生细菌( plant growth鄄promoting
rhizobacteria,PGPR)可以通过产生拮抗物质、铁载
体、HCN(氰化氢)等直接或间接抑制病原菌生长,
是生物防治的理想方法之一[6-7] . 已经报道的具有
拮抗能力的细菌有假单胞菌属 ( Pseudomonas
spp. )、芽孢杆菌属 ( Bacillus spp. )、土壤杆菌属
(Agrobacterium spp. )、产碱菌属(Alcaligenes spp. )、
无定型胞囊属(Amorphosporangium spp. )、固氮菌属
(Azotobacter spp. )和溶杆菌属(Lysobacter spp. )等,
其中研究和应用较多的是假单胞菌属和芽孢杆菌属
应 用 生 态 学 报摇 2012 年 2 月摇 第 23 卷摇 第 2 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
Chinese Journal of Applied Ecology, Feb. 2012,23(2): 511-518
[8-11] .目前,国内外关于根际拮抗细菌多样性的研究
较少.德国学者 Berg 等[12]对油菜、草莓和马铃薯 3
种作物的黄萎病根际拮抗细菌进行了多样性分析,
结果表明恶臭假单胞菌 A 菌株(Pseudomonas putida
A)为油菜、草莓和马铃薯等作物根际的优势拮抗菌
群,恶臭假单胞菌 B 菌株为草莓和马铃薯根际的优
势拮抗菌群;杨波[13]对分离自云南 14 个地区烟草
根际的 136 株烟草赤星病拮抗菌的系统发育进行了
分析,靳奉理等[14]对贵州地区烟草根际的 267 株烟
草黑胫病拮抗菌的多样性和系统发育进行了分析,
但由于样品来源和采样地点比较单一,反映的拮抗
菌的拮抗性能具有一定的局限性.
为进一步了解作物根际拮抗菌的生物多样性以
及根际主要的拮抗菌群的种类,本研究以分离自棉
花、烟草、番茄等 10 种作物根际的 55 株具有较强拮
抗作用的细菌为研究对象,采用抗菌谱测定以及
BOXAIR鄄PCR、生理生化特征和 16S rDNA 序列分析
等方法对其生物多样性进行分析,以期为作物土传
病害的生物防治提供理论依据.
1摇 材料与方法
1郾 1摇 研究材料
1郾 1郾 1 供试菌株摇 以相应作物病害的病原真菌为指
示菌,从 10 种经济作物根际土壤中筛选出来的 55
株拮抗细菌,其基本性状见表 1. 菌株的 16S rDNA
序列提交 GenBank,获得的登录号分别为 HQ317144鄄
HQ317149、 HQ317151鄄HQ317153、 HQ317155鄄HQ317157
和 HQ317159鄄HQ317201.
1郾 1郾 2 供试病原菌摇 烟草赤星病菌(Alternaria alter鄄
nate)、番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)、芹菜灰霉病
菌(Botrytis cinerea)、苹果炭疽病菌 (Colletotrichum
gloeosporioides)、烟草炭疽病菌(Colletotrichum nicoti鄄
anae )、 黄 瓜 枯 萎 病 菌 ( Fusarium oxysporium
f郾 sp郾 cucumeris)、西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum
f郾 sp郾 niveum)、辣椒根腐病菌(Fusarium solani)、黄
瓜霜霉病菌(Pseudoperonospora cubensis)、辣椒疫霉
病菌(Phytophthora capsici)、苹果叶枯病菌(Rhizocto鄄
nia solani)和茄子黄萎病菌(Verticillium dahliae)等
12 种病原菌为本实验室保存.
1郾 1郾 3 主要试剂摇 分子生物学试剂购于宝生物工程
(大连)有限公司,DNA 小量快速纯化试剂盒(3S
Spin Agarose Gel DNA purification kit)购于上海申能
博彩生物科技有限公司.
1郾 2摇 研究方法
1郾 2郾 1 抗菌谱及拮抗性能测定 摇 在 PDA 平板中央
接种病原真菌或卵菌(疫霉为卵菌),四周接种供试
细菌,采用平板对峙试验[15]测定供试菌的抗菌谱,3
次重复,依据文献[16]的方法,按照菌落半径与抑
菌带宽度比值测定供试菌的拮抗能力.
1郾 2郾 2 生理生化特征分析摇 采用参考文献[17]的方
法进行生理生化性状测定及分析,包含硝酸盐、苯丙
氨酸、唯一碳源(己酸钠、琥珀酸钠、葡萄糖等)、抗
生素(氯霉素、庆大霉素、四环素、氨苄青霉素等)、
唯一氮源(L鄄谷氨酸、L鄄精氨酸、L鄄赖氨酸等)、耐酸
碱性(pH 4郾 0、5郾 0、9郾 0、10郾 0)以及耐盐性等 70 项性
状.
1郾 2郾 3 DNA提取 摇 按照文献[18]的方法提取基因
组总 DNA.
1郾 2郾 4 BOXAIR鄄PCR 摇 BOXAIR鄄PCR 引物[19] 为 5爷鄄
CATCGGCAAGGCGACGCTGACG鄄3爷. 反应体系 ( 25
滋L)为 5 U·滋L-1Taq 酶 0郾 5 滋L,10伊缓冲液(Buffer,
Mg2+)2郾 5 滋L,10 mmol·L-1 dNTPs 0郾 5 滋L,10 滋mol·
L-1引物 1 滋L,100% DMSO2郾 5 滋L,模板 1 滋L,超纯
水(ddH2O)18郾 5 滋L. PCR 反应条件为 95 益 5 min,
94 益变性 1 min,53 益退火 1 min,65 益延伸8 min,
共 34 个循环,72 益延伸 16 min. PCR 产物10 滋L在
2%琼脂糖凝胶上水平电泳 2 h,用凝胶成像系统拍
照记录.
1郾 2郾 5 16S rDNA序列分析摇 采用上游引物 27F(5爷鄄
AGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGAACGCT鄄3爷)和下
游引物 1495R ( 5 爷鄄TACGGGTACCTTGTTACGACT鄄
TCACCCC鄄3爷)对供试菌株进行 16S rDNA 扩增,
PCR反应体系(25 滋L)为:5 U·滋L-1 Taq DNA聚合
酶 0郾 5 滋L, 10 伊 缓冲液 ( Buffer, Mg2+ ) 2郾 5 滋L,
10 mmol·L-1 dNTPs 0郾 5 滋L,引物各 1 滋L,模板 1
滋L,超纯水( ddH2 O)18郾 5 滋L. PCR 反应条件为 95
益5 min,94 益变性 1 min,56 益退火 1 min,72 益延
伸 1郾 5 min,共 30 个循环,72 益延伸 10 min. PCR产
物用 1%的琼脂糖凝胶电泳检测.
扩增产物用 DNA 小量快速纯化试剂盒 (3S
Spin Agarose Gel DNA purification kit)纯化后连接
pMD 18鄄T载体,转化大肠杆菌 DH 5琢,由上海生工
生物工程技术服务有限公司测序.
1郾 3摇 数据处理
参照文献[20]将 BOXAIR鄄PCR 遗传图谱中相
同电泳谱带合并后,将在同一位置上有谱带的记为
“1冶、无谱带的记为“0冶,输入计算机,用平均连锁法
聚类最后得到供试菌株的 UPGMA树状图.
215 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 23 卷
表 1摇 供试菌株
Table 1摇 Strains tested
供试菌株
Strain tested
来源作物摇 摇 摇
Origin crop摇 摇 摇
来源地点摇 摇 摇
Site摇 摇 摇
指示病原菌摇 摇 摇 摇 摇
Indicator pathogen摇 摇 摇 摇 摇 摇
DYJL21 柚子 Grapefruit 福州 Fuzhou 柚子炭疽病菌 Colletotrichum gloeosporioides
DYJL8 柚子 Grapefruit 福州 Fuzhou 柚子炭疽病菌 Colletotrichum gloeosporioides
DYJL24 柚子 Grapefruit 福州 Fuzhou 柚子炭疽病菌 Colletotrichum gloeosporioides
DYJL5 大蒜 Garlic 济宁 Jining 大蒜白腐病菌 Sclerotium cepivorum
DYJL10 大蒜 Garlic 济宁 Jining 大蒜白腐病菌 Sclerotium cepivorum
DYJL鄄A 番茄 Tomato 济宁 Jining 番茄灰霉病菌 Botrytis cinerea
DYJL鄄B 番茄 Tomato 济宁 Jining 番茄灰霉病菌 Botrytis cinerea
DYJL鄄C 番茄 Tomato 济宁 Jining 番茄灰霉病菌 Botrytis cinerea
DYJL鄄H 番茄 Melon 济宁 Jining 甜瓜根腐病菌 Fusarium solani
DYJL鄄I 番茄 Melon 济宁 Jining 甜瓜根腐病菌 Fusarium solani
DYJL鄄J 番茄 Melon 济宁 Jining 甜瓜根腐病菌 Fusarium solani
DYJL16 姜 Ginger 莱芜 Laiwu 姜瘟病病原菌 Ralstonia solanacearum
DYJL17 姜 Ginger 莱芜 Laiwu 姜瘟病病原菌 Ralstonia solanacearum
DYJL18 姜 Ginger 莱芜 Laiwu 姜瘟病病原菌 Ralstonia solanacearum
DYJL19 姜 Ginger 莱芜 Laiwu 姜瘟病病原菌 Ralstonia solanacearum
DYJL鄄D 姜 Ginger 莱芜 Laiwu 姜根茎腐病菌 Pythium myriotylum
DYJL鄄F 姜 Ginger 莱芜 Laiwu 姜瘟病病原菌 Ralstonia solanacearum
DYJL1 冬枣 Jujube 沾化 Zhanhua 冬枣根朽病菌 Armillariella mellea
DYJL2 冬枣 Jujube 沾化 Zhanhua 冬枣根朽病菌 Armillariella mellea
DYJL3 冬枣 Jujube 沾化 Zhanhua 冬枣根朽病菌 Armillariella mellea
DYJL9 向日葵 Sunflower 内蒙古 Neimenggu 向日葵菌核病菌 Sclerotinia sclerotiorum
DYJL鄄G 向日葵 Sunflower 内蒙古 Neimenggu 向日葵菌核病菌 Sclerotinia sclerotiorum
DYJL6 棉花 Cotton 济宁 Jining 棉花枯萎病菌 Fusarium oxysporum f郾 sp. vasinfectum
DYJL25 棉花 Cotton 济宁 Jining 棉花枯萎病菌 Fusarium oxysporum f郾 sp郾 vasinfectum
DYJL26 棉花 Cotton 济宁 Jining 棉花枯萎病菌 Fusarium oxysporum f郾 sp郾 vasinfectum
DYJL28 棉花 Cotton 济宁 Jining 棉花枯萎病菌 Fusarium oxysporum f郾 sp郾 vasinfectum
DYJL30 棉花 Cotton 石河子 Shihezi 棉花枯萎病菌 Fusarium oxysporum f郾 sp郾 vasinfectum
DYJL31 棉花 Cotton 石河子 Shihezi 棉花枯萎病菌 Fusarium oxysporum f郾 sp郾 vasinfectum
DYJL32 棉花 Cotton 石河子 Shihezi 棉花枯萎病菌 Fusarium oxysporum f郾 sp郾 vasinfectum
DYJL33 棉花 Cotton 石河子 Shihezi 棉花枯萎病菌 Fusarium oxysporum f郾 sp郾 vasinfectum
DYJL34 棉花 Cotton 石河子 Shihezi 棉花枯萎病菌 Fusarium oxysporum f郾 sp郾 vasinfectum
DYJL35 棉花 Cotton 石河子 Shihezi 棉花枯萎病菌 Fusarium oxysporum f郾 sp郾 vasinfectum
DYJL4 棉花 Cotton 石河子 Shihezi 棉花枯萎病菌 Fusarium oxysporum f郾 sp郾 vasinfectum
DYJL12 辣椒 Chili 遵义 Zunyi 辣椒根腐霉病菌 Fusarium solani
DYJL13 辣椒 Chili 遵义 Zunyi 辣椒根腐霉病菌 Fusarium solani
DYJL14 辣椒 Chili 遵义 Zunyi 辣椒根腐霉病菌 Fusarium solani
DYJL38 烟草 Tobacco 遵义 Zunyi 烟草黑胫病菌 Phytophthora nicotianae
DYJL39 烟草 Tobacco 遵义 Zunyi 烟草黑胫病菌 Phytophthora nicotianae
DYJL40 烟草 Tobacco 遵义 Zunyi 烟草黑胫病菌 Phytophthora nicotianae
DYJL41 烟草 Tobacco 遵义 Zunyi 烟草黑胫病菌 Phytophthora nicotianae
DYJL42 烟草 Tobacco 遵义 Zunyi 烟草黑胫病菌 Phytophthora nicotianae
DYJL43 烟草 Tobacco 遵义 Zunyi 烟草黑胫病菌 Phytophthora nicotianae
DYJL44 烟草 Tobacco 遵义 Zunyi 烟草黑胫病菌 Phytophthora nicotianae
DYJL45 烟草 Tobacco 遵义 Zunyi 烟草黑胫病菌 Phytophthora nicotianae
DYJL46 烟草 Tobacco 遵义 Zunyi 烟草青枯病菌 Ralstonia solanacearum
DYJL47 烟草 Tobacco 遵义 Zunyi 烟草青枯病菌 Ralstonia solanacearum
DYJL48 烟草 Tobacco 遵义 Zunyi 烟草青枯病菌 Ralstonia solanacearum
DYJL49 烟草 Tobacco 遵义 Zunyi 烟草青枯病菌 Ralstonia solanacearum
DYJL50 烟草 Tobacco 遵义 Zunyi 烟草青枯病菌 Ralstonia solanacearum
DYJL51 烟草 Tobacco 遵义 Zunyi 烟草黑胫病菌 Phytophthora nicotianae
DYJL52 烟草 Tobacco 遵义 Zunyi 烟草黑胫病菌 Phytophthora nicotianae
DYJL53 烟草 Tobacco 遵义 Zunyi 烟草黑胫病菌 Phytophthora nicotianae
DYJL54 烟草 Tobacco 遵义 Zunyi 烟草黑胫病菌 Phytophthora nicotianae
DYJL55 烟草 Tobacco 遵义 Zunyi 烟草黑胫病菌 Phytophthora nicotianae
DYJL56 烟草 Tobacco 遵义 Zunyi 烟草黑胫病菌 Phytophthora nicotianae
3152 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 徐莹莹等: 几种经济作物根际拮抗细菌的多样性摇 摇 摇 摇 摇 摇
摇 摇 16S rDNA 测序结果用 NCBI 数据库中的
BLAST进行相似性分析,采用 DNAMAN 6郾 0 程序进
行多序列同源性分析,使用 MEGA 4郾 0 (Molecular
Evolutionary Genetics Analysis Software Version 4郾 0)
程序包以 Neighbor鄄joining法构建系统发育树.
2摇 结果与分析
2郾 1摇 抗菌谱测定及拮抗性能
2郾 1郾 1 供试菌抗菌谱摇 以病原菌为指示菌采用平板
对峙试验测定供试菌株的抗菌谱,图 1 显示了部分
供试菌对番茄灰霉病和烟草赤星病病原菌的拮抗效
果,拮抗菌周围出现明显的抑菌带.
2郾 1郾 2 供试菌拮抗能力摇 参照文献[12,16],依据记
录的供试菌对病原菌抑菌带宽度(R2)和供试菌菌
落半径(R1),计算供试菌的拮抗能力(R2 / R1 ),无
拮抗效果记为“-冶;0<2 记为“++冶;2臆R2 / R1<2郾 5 记为“+++冶;R2 / R1逸
2郾 5 记为“++++冶,结果见表 2.
摇 摇 从表 2 可以看出,来自大蒜根际和向日葵根际
的拮抗菌抗菌谱较广,均对 10 种以上病原菌有拮抗
作用,拮抗能力较强,R2 / R1 为 1郾 0 ~ 3郾 0.而来自辣
椒根际的 3 种拮抗菌的拮抗能力差别较大:DYJL13
和 DYJL14 抗菌谱较广,拮抗能力 R2 / R1 多数为 2郾 0
~ 4郾 0;DYJL12 仅对芹菜灰霉病菌和辣椒根腐病菌
有较弱的拮抗作用,R2 / R1 <1郾 0. 有 19 个菌株对 10
种以上病原菌有拮抗作用,有 25 个菌株对 5 种以下
病原菌有拮抗作用.可见,供试根际拮抗菌的拮抗性
能具有丰富的多样性.
2郾 2摇 生理生化特征分析
所有供试菌在 40 益条件下生长,在 4 益条件下
停止生长. 供试菌均能以葡萄糖作为唯一碳源,
DYJL9、DYJL10、DYJL14 等 20 株能以尿素为唯一碳
源. 32 株供试菌耐受 300 滋g·mL-1的氨苄青霉素霉
素,仅 DYJL11 能耐受 100 滋g·mL-1的庆大霉素;28
图 1摇 部分供试菌的拮抗效果
Fig. 1摇 Antagonisation of some tested strains against plant pathogens.
图 2摇 供试菌株的 BOXAIR鄄PCR指纹图谱
Fig. 2摇 Fingerprints of BOXAIR鄄PCR electrophoresis of tested strains.
1 ~ 55:DYJL1、DYJL2、DYJL3、DYJL5、DYJL6、DYJL9、DYJL10、DYJL12、DYJL13、DYJL14、DYJL16、DYJL17、DYJL18、DYJL19、DYJL21、DYJL23、
DYJL24、DYJL25、DYJL26、DYJL28、DYJL30、DYJL31、DYJL32、DYJL33、DYJL34、DYJL35、DYJL36、DYJL38、DYJL39、DYJL40、DYJL41、DYJL42、
DYJL43、DYJL44、DYJL45、DYJL46、DYJL47、DYJL48、DYJL49、DYJL50、DYJL51、DYJL52、DYJL53、DYJL54、DYJL55、DYJL56、DYJL鄄G、DYJL鄄H、
DYJL鄄I、DYJL鄄J、DYJL鄄A、DYJL鄄B、DYJL鄄C、DYJL鄄D、DYJL鄄F; M:200 bp DNA分子量标准 200 bp DNA ladder.
415 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 23 卷
表 2摇 供试菌的拮抗性能
Table 2摇 Antagonism of all tested strains
试验菌株
Strain
烟草赤星
病菌
A郾 alternate
番茄灰霉
病菌
B郾 cinerea
芹菜灰霉
病菌
B郾 cinerea
苹果炭疽
病菌
C郾 gloeosp鄄
orioides
烟草炭疽
病菌
C郾 nicot鄄
ianae
黄瓜枯萎
病菌
F郾 oxyspor鄄
ium f郾 sp郾
cucumeris
西瓜枯萎
病菌
F. oxys鄄
porum f. sp.
niveum
辣椒根腐
病菌
F. solani
黄瓜霜霉
病菌
P. cubensis
辣椒疫霉
病菌
P. capsici
苹果叶枯
病菌
R. solani
茄子黄萎
病菌
V. dahliae
DYJL21 - + - - - - - + - - - -
DYJL8 - - - - - - - - + - - -
DYJL24 ++ - + ++ ++ ++ ++++ +++ ++++ + ++++ +
DYJL5 + ++ + +++ + + + ++ ++ + ++++ +
DYJL10 ++ ++ - ++ ++ +++ + +++ ++ - ++ +
DYJL鄄A - ++++ - - - - ++++ - - ++ - -
DYJL鄄B + ++++ + +++ + + ++ ++ + - ++ -
DYJL鄄C - ++ - - - - ++++ - - - - ++
DYJL鄄H - - - - - - - - - - ++ -
DYJL鄄I - - - ++ + - ++ - - + - -
DYJL鄄J - - - - + + + - - - +++ -
DYJL16 + + + +++ - ++ + - + + ++ -
DYJL17 - - - - + - + - - - - -
DYJL18 - - - +++ + ++ ++ - - - - -
DYJL19 + - - - + - - - - - - -
DYJL鄄D - ++++ - - - - +++ - - +++ - -
DYJL鄄F - - - ++ + - +++ - - - - -
DYJL1 + + - - - - - - - - - -
DYJL2 ++ - - +++ + +++ +++ + +++ - ++ -
DYJL3 + - - - - - + - - - - -
DYJL9 + ++ - +++ ++ + + ++ ++ + - +
DYJL鄄G + ++ ++ ++ ++ - + ++ - + ++ ++++
DYJL6 + ++ + ++ + ++ + + ++ + + ++
DYJL25 - + ++ - +++ ++ ++++ - ++++ ++ ++ -
DYJL26 ++ ++ + ++ ++ ++ ++++ - + + ++ ++
DYJL28 + ++ ++ ++ + + ++++ + ++ + ++ +
DYJL30 + ++ ++++ ++ + ++ ++ + ++ - ++ +
DYJL31 + + ++ ++ + + ++ + ++ + ++ +
DYJL32 + ++ ++++ ++++ ++ ++ ++++ + +++ ++ +++ ++
DYJL33 + + ++ ++ + ++ ++ ++ + + ++ +
DYJL34 - - - - ++ +++ ++++ - ++++ ++ - +
DYJL35 + ++++ ++ +++ + ++ ++++ ++ + + ++ +
DYJL4 + ++ + + + + + ++ + - + +++
DYJL12 - - + - - - - + - - - -
DYJL13 + ++ ++++ ++ ++ ++ + ++ +++ - ++ -
DYJL14 + + ++ ++ ++ ++ + ++ +++ ++ + ++
DYJL38 + ++++ - - + ++ ++++ + ++ + -
DYJL39 - - - - - - ++ - ++ - ++ ++
DYJL40 - - + ++ + ++ + ++ ++ + ++ +
DYJL41 - - - - - - - - + - - -
DYJL42 - ++ ++ +++ ++ ++ ++ ++ +++ + + ++
DYJL43 - +++ - - - - - - - - - -
DYJL44 - + - - - - - - - - - -
DYJL45 - + ++ - + ++ + ++ ++ + ++ ++
DYJL46 ++ - ++ ++ ++ ++ ++ - ++ - ++ -
DYJL47 + - ++ +++ ++ ++++ ++ - ++ - ++ -
DYJL48 ++ - ++++ - ++ ++ ++ - ++ - ++ -
DYJL49 + - +++ - + ++++ ++ - ++ - - -
DYJL50 + + ++ ++ ++ +++ ++ - ++ - + -
DYJL51 - ++++ - - - - - - - ++ - ++
DYJL52 - +++ - - - - - - - ++ - ++
DYJL53 - - - - - - - - - ++ - -
DYJL54 + - - - - - - - - + ++ -
DYJL55 - - - ++ - - ++ - - - + ++
DYJL56 - - ++ - ++ +++ ++ - - - ++ -
5152 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 徐莹莹等: 几种经济作物根际拮抗细菌的多样性摇 摇 摇 摇 摇 摇
株能耐受 10%的氯化钠.所有供试菌能在 pH 10郾 0
条件下生长,DYJL1、DYJL3、DYJL4、DYJL5 等 28 株
菌能在 pH 4郾 0 条件下生长.硝酸盐还原反应测定中
有 19 株供试菌为阴性.
2郾 3摇 BOXAIR鄄PCR分析
供试菌株的 BOXAIR鄄PCR 指纹图谱如图 2 所
示.将 BOXAIR鄄PCR扩增条带进行 UPGMA 聚类分
析得到图 3,其中所有供试菌株在 68郾 0%水平上具
有相似性,在 72郾 1% 水平上可以聚为 7 个群,在
85郾 0%水平上所有拮抗菌聚为 25 个群. 在 72郾 1%
水平上,群 1、2 和 6 较大,分别由 7、37 和 5 株拮抗
菌组成.来自棉花根际的拮抗菌除 DYJL25 聚在群 1
图 3摇 供试菌株 BOXAIR鄄PCR分析 UPGMA树状图
Fig. 3摇 Dendrogram obtained by BOXAIR鄄PCR patterns.
图 4摇 供试菌株的系统发育树
Fig. 4 摇 Dendrogram of strains generated by Neighbor鄄joining
method.
数字表示自展次数 Numbers showed the bootstrap times.
615 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 23 卷
以外其余全部聚在群 2 中,来自番茄、向日葵、大蒜
和辣椒的根际拮抗菌全部聚在群 2 中,来自烟草根
际的拮抗菌分别聚在群 2、4、6 和 7 中. 表明供试拮
抗菌具有丰富的遗传多样性.
2郾 4摇 16S rDNA序列分析
将所获取的所有供试菌和选取的参比菌株的
16S rDNA序列通用 MEGA 4郾 0 软件构建系统发育
树(图 4).由图 4 可以看出,55 株供试菌分属于芽
孢杆菌属、类芽孢杆菌属、短芽孢杆菌属、假单胞菌
属和产碱菌属等 5 个属,共 15 个种,结合生理生化
特征分析后得知这 15 个种分别为解淀粉芽孢杆菌
(Bacillus amyloliquefaciens)、枯草芽孢杆菌(Bacillus
subtilis)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、高地芽孢
杆菌(Bacillus altitudinis)、简单芽孢杆菌 (Bacillus
simplex)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、蜡样
芽孢杆菌(Bacillus cereus)、多粘类芽孢杆菌(Paeni鄄
bacillus polymyxa)、短短芽孢杆菌(Brevibacillus bre鄄
vis)、类短短芽孢杆菌(Brevibacillus parabrevis)、粪产
碱菌(Alcaligenes faecalis)、施氏假单胞菌 (Pseudo鄄
monas stutzeri)、莓实假单胞菌(Pseudomonas fragi)、
油菜假单胞菌(Pseudomonas brassicacearum)和黎巴
尼恩假单胞菌(Pseudomonas libaniensis). 这说明作
物根际拮抗菌具有丰富的物种多样性.
摇 摇 16S rDNA序列结合生理生化特征分析,结果显
示,简单芽孢杆菌只从辣椒根际中分离得到,其他供
试作物根际没有分离到,而巨大芽孢杆菌、莓实假单
胞菌和油菜假单胞菌分别只从柚子、烟草和向日葵
根际中分离到.从所有供试的 10 种作物根际分离得
到芽孢杆菌属的多个种. 从棉花根际分离的拮抗菌
中芽孢杆菌属和短芽孢杆菌属在供试根际拮抗菌中
所占比例分别为 16郾 4%和 3郾 6% ;从烟草根际分离
的拮抗菌中芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属、短芽孢杆菌
属、假单胞菌属和产碱菌属在供试烟草根际拮抗菌
中所占比例分别为 5郾 5% 、7郾 3% 、9郾 1% 、5郾 5% 和
7郾 3% .说明根际拮抗菌的种类和数量受作物种类及
其根际特性的影响.
3摇 讨摇 摇 论
本研究对分离自 10 种经济作物根际的 55 株拮
抗细菌对 12 种病原菌的拮抗性能、系统发育进行了
研究,结果表明作物根际存在的拮抗菌种类多属于
芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属、短芽孢杆菌属、假单胞
菌和产碱菌属,这与前人的研究结果一致[8-10] . 其
中,DYJL54、DYJL55 和 DYJL鄄C 为高地芽孢杆菌,
Gopalakrishnan等[21]曾报道,高地芽孢杆菌对高粱
茎腐病(Macrophomina phaseolina)有拮抗作用.本研
究首次发现,高地芽孢杆菌对苹果叶枯病菌、苹果炭
疽病菌和西瓜枯萎病菌也有拮抗作用.
拮抗菌的种类和数量均受作物根系活动的影响
(图 4),其主要原因可能是不同植物根系利用和释
放的有机物质和无机物质的种类不同,从而引起根
际土壤物理、化学和生物特性的改变,进而影响拮抗
菌在植物根际的定殖能力[22-24] .
本研究中来自济宁和新疆石河子的棉花根际拮
抗菌 DYJL25 和 DYJL34 同为短短芽孢杆菌,但其对
番茄灰霉病原菌、芹菜灰霉病菌和茄子黄萎病菌的
拮抗作用存在明显差异(表 2). 解淀粉芽孢杆菌
DYJL鄄H仅对苹果叶枯病菌有拮抗能力,其R2 / R1为
1郾 0 ~ 2郾 0,其余的解淀粉芽孢杆菌对 12 种病原菌中
的至少 11 种有拮抗作用(表 2),且拮抗能力多数较
强. DYJL鄄H具有对氯霉素(5 滋g·mL-1)有耐受力、
接触酶反应为阳性以及不能利用 L鄄谷氨酸等不同
于其他解淀粉芽孢杆菌的性状. 以上说明拮抗细菌
的拮抗性能在种内存在差异,这为拮抗基因在细菌
种间分布的研究提供了一定的理论依据.
许多拮抗菌已被广泛应用于生物防治中,如梅
新兰等[25]将多粘类芽孢杆菌和短小芽孢杆菌用于
辣椒疫霉病生物防治中,杨秀荣等[2]将生防细菌
B579 应用于黄瓜土传病害的生物防治中. DYJL13、
DYJL32 和 DYJL35 等多株根际拮抗菌因其抗菌谱
较广(表 2)、拮抗能力普遍较强,具有较大的应用潜
力,可作为番茄、烟草、姜等经济作物生物防治的菌
种资源.
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作者简介摇 徐莹莹,女,1986 年生,硕士.主要从事分子微生
物学研究. E鄄mail: yingyingbingyu@ 163. com
责任编辑摇 肖摇 红
815 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 23 卷