全 文 ：山黧豆毒素 茁鄄ODAP的生态学功能及应用*
熊俊兰摇 白摇 雪摇 Asfa BATOOL摇 孔海燕摇 谭瑞玥摇 王亚馥摇 李志孝摇 熊友才**
(兰州大学生命科学学院 /草地农业生态系统国家重点实验室 /干旱农业生态研究所, 兰州 730000)
摘摇 要摇 山黧豆是一种具有广谱抗逆性且营养丰富的豆科作物,但其含有 茁鄄N鄄草酰鄄L鄄琢,茁鄄
二氨基丙氨酸(茁鄄N鄄oxalyl鄄L鄄琢,茁鄄diaminopropionic acid, 茁鄄ODAP)神经毒素,人畜长期大量食
用会导致神经性中毒,因此限制了山黧豆种质资源的利用.本文综述了干旱胁迫下山黧豆毒
素 茁鄄ODAP对植株渗透调节和生长调节的影响,以及 茁鄄ODAP 的分析方法、毒理机理和实用
价值方面的研究进展,并对低毒和无毒品种选育策略进行了总结.干旱胁迫下,山黧豆合成大
量毒素 茁鄄ODAP,其含量随胁迫程度增强而逐渐升高. 茁鄄ODAP可为植株生长和种子发育提供
氮源,并积极参与清除活性氧过程,作为小分子可溶性氨基酸参与渗透调节,作为锌离子转运
体参与根瘤发育.而含硫氨基酸(甲硫氨酸和半胱氨酸)含量升高可使山黧豆毒性显著降低.
近年来,在山黧豆种质资源收集、杂交育种,以及通过组织培养和基因操作等技术进行低毒或
无毒山黧豆品种选育方面做了大量工作. 茁鄄ODAP 可通过破坏细胞内 Ca2+稳态和作为谷氨酸
类似物引发兴奋性中毒,但在止血和抗肿瘤等方面有重要的药用价值.
关键词摇 山黧豆摇 茁鄄N鄄草酰鄄L鄄琢,茁鄄二氨基丙氨酸摇 神经毒素摇 生态学功能摇 干旱适应性
文章编号摇 1001-9332(2014)04-1197-09摇 中图分类号摇 Q194摇 文献标识码摇 A
Ecological function and application of toxin 茁鄄ODAP in grass pea (Lathyrus sativus) . XIONG
Jun鄄lan, BAI Xue, BATOOL Asfa, KONG Hai鄄yan, TAN Rui鄄yue, WANG Ya鄄fu, LI Zhi鄄xiao,
XIONG You鄄cai (School of Life Sciences / State Key Laboratory of Grassland Agro鄄ecosystem / Institute
of Arid Agroecology, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China) . 鄄Chin. J. Appl. Ecol. , 2014, 25
(4): 1197-1205.
Abstract: Grass pea (Lathyrus sativus) is a legume with various adverse adaptability and rich nu鄄
trition. However, it can lead to the human and animal neurotoxicity after long鄄term consumption
due to its neurotoxin, 茁鄄N鄄oxalyl鄄L鄄琢,茁鄄diaminopropionic acid (茁鄄ODAP), limiting its utilization.
This paper summarized the influences of 茁鄄ODAP on osmotic adjustment and growth regulation in
grass pea under drought stress, the research progress in analysis methods, toxicological mechanisms
and practical utility of 茁鄄ODAP, and the breeding strategies for low鄄 and zero鄄茁鄄ODAP. 茁鄄ODAP
synthesis was found to be abundant in grass pea under drought stress and its content was enhanced
gradually with the increasing extent of drought stress. 茁鄄ODAP could supply nitrogen for plant
growth and seed development, scavenge reactive oxygen species (ROS), involve in osmotic adjust鄄
ment as a soluble amino acid, transport zinc鄄ions as a carrier molecule, and impact nodule develop鄄
ment. However, increasing the content of sulfur鄄containing amino acids (methionine and cysteine)
could decrease the level of toxicity of grass pea. There were a lot of investigations on collecting ge鄄
netic resources, cross breeding, tissue culture, and gene manipulation for low鄄 and zero鄄toxin in
grass pea in recent years. Although 茁鄄ODAP could induce excitotoxicity by damaging intracellular
Ca2+ homeostasis and as glutamate analogues, it has medicinal value on hemostasis and anti鄄tumor.
Key words: Lathyrus sativus; 茁鄄N鄄oxalyl鄄L鄄琢,茁鄄diaminopropionic acid (茁鄄ODAP); neurotoxin;
ecological function; drought adaptability.
*高等学校博士学科点专项科研基金项目(20110211110022)、国家自然科学基金项目(31070372)、国家公益性行业(气象)科研专项子课题
(GYHY201106029鄄2)和教育部直属高校海外名师项目(Ms2011LZDX059)资助.
**通讯作者. E鄄mail: xiongyc@ lzu. edu. cn
2013鄄06鄄19 收稿,2013鄄11鄄11 接受.
应 用 生 态 学 报摇 2014 年 4 月摇 第 25 卷摇 第 4 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
Chinese Journal of Applied Ecology, Apr. 2014, 25(4): 1197-1205
摇 摇 山黧豆(Lathyrus sativus)是豆科山黧豆属一年
生作物,其营养丰富,包括蛋白质、脂肪、碳水化合
物、淀粉和氨基酸等[1] . 山黧豆籽粒的蛋白含量高
达 18. 2% ~ 34. 6% ,且富含 17 种氨基酸[2-5] . 山黧
豆对环境有广泛的适应性,能在干旱、盐碱和水涝等
条件下生长良好[6-8] .山黧豆还有很强的固氮能力,
可作为先锋作物种植于贫瘠地区,并与其他粮食作
物轮作,特别适宜于我国西北干旱、高寒和贫瘠的丘
陵山区、黄土丘陵沟壑区[9] . 随着人们对蛋白食物
要求的日益提高,山黧豆作为一种亟待开发的植物
蛋白质库和可持续农业的模式作物引起了越来越多
的重视.
山黧豆被广泛种植于世界各地,但是它含有的
一种非蛋白质氨基酸 茁鄄N鄄草酰鄄L鄄琢,茁鄄二氨基丙氨
酸 ( 茁鄄N鄄oxalyl鄄L鄄琢, 茁鄄diaminopropionic acid, 茁鄄
ODAP)限制了其发展[10-11] .人畜过度食用山黧豆会
导致不可逆瘫痪,茁鄄ODAP 已经成为开发和利用山
黧豆的主要障碍[12] . 目前,对于山黧豆毒素 ( 茁鄄
ODAP)的去除、开发和利用方面已有大量研究. 有
研究表明,随着 茁鄄ODAP含量的降低,山黧豆的抗逆
性(特别是耐旱性)和产量都会降低[13] . 茁鄄ODAP 是
山黧豆抗逆性的生态指示因子[9] . 本文综述了从山
黧豆传统育种到现代生物技术开展的低毒和无毒品
种选育以及种质资源利用情况,并总结和讨论了 茁鄄
ODAP的生理生态意义.
1摇 茁鄄ODAP可作为干旱胁迫下山黧豆抗逆性的生
化指标
摇 摇 山黧豆有很强的抗逆性,如干旱、盐碱和水涝
等,但是关于 茁鄄ODAP 与抗逆性关系的研究多集中
在干旱适应性方面.有研究表明,山黧豆具有极强的
耐旱性,能在干旱甚至年降雨量<300 mm 的地区生
长良好[14] .其原因可能是,山黧豆有很多形态学方
面的优势,如披针形叶片、发达的根系和大量的分枝
等[15] .但也有研究发现,其干旱适应性与 茁鄄ODAP
有关.例如,干旱胁迫下山黧豆 茁鄄ODAP含量大量增
加[16-19] .用 20%聚乙二醇(polyethyeneglycol, PEG)
600 对山黧豆幼苗进行模拟胁迫,茁鄄ODAP含量显著
上升,PEG处理 24 h后 茁鄄ODAP含量是未胁迫组的
1. 9 倍[16] .外源施加脱落酸(abscisic acid, ABA)可
以促进 茁鄄ODAP合成,聚乙二醇(PEG)、PEG+ABA、
ABA处理山黧豆幼苗后,其叶片 茁鄄ODAP 含量均显
著增加,外源施加 ABA 后,茁鄄ODAP 增加出现 2 个
时间点,且滞后于 ABA 含量的增加,因此推测 ABA
可以促进 茁鄄ODAP 合成[20] . 有研究进一步指出,
ABA可以通过增加多胺( spermine, Spm)含量促进
茁鄄ODAP合成[18] . 以高毒品种( Jamalpur)和低毒品
种(LS8603)为材料研究发现,山黧豆低毒品种对干
旱更敏感, 干旱使低毒品种积累更多的 茁鄄
ODAP[21] .低毒品种往往表现为低产和抗逆性弱,在
低毒品种选育过程中,虽然暂时能够得到低 茁鄄
ODAP含量且高产的品种,但随着时间的延长,其毒
素含量往往会增加. 因此,有研究指出,山黧豆极强
的干旱适应性与 茁鄄ODAP 有关,并尝试了解 茁鄄
ODAP参与干旱的适应机理[16-17] .
2摇 茁鄄ODAP的生态学功能
茁鄄ODAP可能在山黧豆生长和广泛适应性特别
是干旱方面有着重要作用,其中,茁鄄ODAP 与氮源、
活性氧、渗透调节和根瘤发生的关系研究最为多见.
2郾 1摇 茁鄄ODAP与氮源的关系
氮是影响植物生长和产量的重要因素,从种子
萌发到后期种子形成,氮素的转移和利用非常频繁.
种子萌发过程中,氮素会大量转移用于苗期生长,随
着叶片的衰老和光合能力的下降,营养器官中氮素
开始向繁殖器官转移[22] .而山黧豆 茁鄄ODAP 的大量
合成主要集中在 2 个时期:种子萌发和种子形成.有
研究推测,作为一种氨基酸(图 1),茁鄄ODAP 可以高
效率地转运氮,茁鄄ODAP作为氮库,在萌发和蛋白分
解后可供应必要的氮源使山黧豆植株生长. 20 世纪
90 年代发现,少量施用氮肥可以逐渐降低山黧豆 茁鄄
ODAP含量;在缺素试验中,培养液分别缺乏 N、Zn、
Mo和 Mn 元素,山黧豆茎、根中 茁鄄ODAP 含量高于
对照组,其中缺乏氮素影响最大,说明氮素可显著影
响山黧豆 茁鄄ODAP含量[23-24] .
2郾 2摇 茁鄄ODAP与活性氧的关系
干旱胁迫初期,植物活性氧 ( reactive oxygen
species, ROS)会增加并以第二信使存在,随着胁迫
程度的增加,ROS 积累从而对细胞产生毒害作用,
引发膜脂过氧化反应,使细胞代谢失衡[25] . 有研究
证实,茁鄄ODAP有清除 ROS的作用:外源施加羟自由
基会增加茁鄄ODAP含量,外源施加茁鄄ODAP可以降
图 1摇 茁鄄ODAP的化学结构式[10]
Fig. 1摇 Chemical structural formula of 茁鄄ODAP[10] .
8911 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 25 卷
低羟自由基含量;在 PEG处理 15 d的山黧豆幼苗中
加入 H2O2抑制剂二乙基二硫代氨基甲酸钠(diethyl鄄
dithiocarbamate, DDC)和促进剂氨基三唑(aminotri鄄
azole, AT)后,发现 DDC可降低叶片 茁鄄ODAP含量,
AT导致 茁鄄ODAP 积累[13,17,26] . 山黧豆不同组织中
茁鄄ODAP的聚集与低水平的 O2
-·和 H2O2相关[13,27] .
茁鄄ODAP清除 ROS 的机制需要更深入的研究,如使
用突变体等,已有研究应用 酌 射线在山黧豆中筛选
出了活性氧清除剂抗坏血酸的缺失突变体并测定了
其抗氧化能力[28],因此可通过测定干旱胁迫下该突
变体 茁鄄ODAP含量变化进一步分析 茁鄄ODAP积累与
活性氧的耦合关系.
2郾 3摇 茁鄄ODAP与渗透调节的关系
脯氨酸是逆境下植物保持水分、进行渗透调节
的重要物质之一. 正常环境下,植物脯氨酸含量很
低,干旱胁迫下其含量会大量增加. 目前发现,所有
氨基酸中只有脯氨酸能清除 ROS[29] . 茁鄄ODAP 作为
一种非蛋白质氨基酸,虽然与脯氨酸不同,但因其在
干旱胁迫下大量聚集,有研究认为其不仅可以清除
活性氧,还能参与渗透调节[17] .然而,虽然干旱胁迫
下 茁鄄ODAP含量有所增加,但其增幅远低于脯氨酸,
这对其渗透调节作用产生质疑.
2郾 4摇 茁鄄ODAP与根瘤生长和锌转运的关系
山黧豆 茁鄄ODAP积累可能与其苗期根瘤发育相
关,虽然 茁鄄ODAP并非根瘤菌的营养成分,但是低浓
度 茁鄄ODAP可以提高根瘤菌的结瘤能力[30] .在生长
前期,山黧豆能向根际分泌 茁鄄ODAP,茁鄄ODAP 对微
生物和动植物有普遍的毒性,能使山黧豆幼苗更好
地生长在贫瘠的土壤中[10] . 有研究表明,茁鄄ODAP
可以螯合锌,而土壤缺锌会使种子 茁鄄ODAP 含量升
高,因此推测,茁鄄ODAP 是锌离子的运载体,可将锌
从山黧豆植株根部运往地上部分[31-32] .另有研究表
明,在温室中,施用锌肥可以逐渐降低 3 个山黧豆品
系的 茁鄄ODAP含量;大田条件下,选定 9 个山黧豆品
系,降雨量分别为 260、429 和 405 mm 时,分别施加
0、5、10 和 20 kg·hm–2锌肥,相比对照籽粒中 茁鄄
ODAP含量降低 10% ~40% [33] .向来源于山黧豆叶
片外植体的愈伤组织施加锌,会减少 茁鄄异噁唑啉鄄5鄄
酮鄄2鄄L鄄丙氨酸[茁鄄( isoxazoline鄄5鄄on鄄2鄄yl)鄄L鄄alanine,
BIA]向 茁鄄ODAP 的转化程度,而 BIA 是 茁鄄ODAP 生
物合成过程中的中间体[34] .
3摇 茁鄄ODAP的分析方法、毒理学机理和实用价值
3郾 1摇 茁鄄ODAP的分析方法
自 1964 年印度学者 Rao 等[10]分离并鉴定出山
黧豆引发中毒的主要成分 茁鄄ODAP 后,茁鄄ODAP 的
分析方法得到了快速发展,经历了从定性分析到定
量分析的转变[35] .定性分析可以快速有效地检测 茁鄄
ODAP,在山黧豆早期应用中起到重要作用,其包括
纸层分析法、薄层色谱法、化学显色法、酶法、分光光
度法和电泳技术等[35] . 虽然定性分析简单易行,但
是其无法精确且有效地提取和鉴定 茁鄄ODAP的理化
性质和结构,因此创建了很多定量方法,包括高压液
相色谱法、毛细管电泳法、流动注射分析法和质谱分
析法等[35] .这些技术为揭示 琢鄄ODAP 和 茁鄄ODAP 异
构体及二者互变机理,测定不同基因型的山黧豆、不
同自然分布的山黧豆居群和不同方法加工处理的山
黧豆制品中 茁鄄ODAP 含量,以及鉴定蛋白质氨基酸
和非蛋白质氨基酸种类及性质等提供了支持.
3郾 2摇 茁鄄ODAP的毒理学机理
1986 年,Spencer 等[36]证实 茁鄄ODAP 是人畜山
黧豆神经性中毒的主要因素后,许多学者意识到,开
展这种非蛋白质兴奋性氨基酸 ( excitatory amino
acid, EAA)神经性中毒的分子机理研究有重大意
义.早期采用小白鼠、雏鸡和羊等多种动物模型饲喂
茁鄄ODAP试验表明,茁鄄ODAP 经过血循环,透过血脑
屏障(blood鄄brain barrier, BBB)选择性滞留于神经
组织并伤害靶器官———中枢神经系统( centre nerv鄄
ous system, CNS),导致脑和脊髓神经细胞膜受损
伤,线粒体嵴崩解,部分神经细胞出现细胞坏死或凋
亡[37] . 茁鄄ODAP可透过血脑屏障后在中枢神经系统
中积累,随后向腹膜和静脉内渗入,同时诱发一系列
神经性中毒症状[38] . 近几年,随着分子生物学及其
相应技术的发展,对毒物作用机理的研究已从器官
水平和细胞水平发展到亚细胞水平和分子水平. 要
深入认识 茁鄄ODAP如何引起的危害,必须在分子水
平上探讨 茁鄄ODAP与生物体内大分子之间的相互作
用,以及 茁鄄ODAP如何与细胞内受体结合和导致细
胞信号转导改变.目前,对 茁鄄ODAP神经性中毒机理
的阐述有:1)破坏细胞内钙稳态:茁鄄ODAP在兴奋性
神经毒性发生早期诱导细胞内 Ca2+浓度升高,从而
增加内质网鄄线粒体轴 Ca2+浓度,激活细胞内许多敏
感 Ca2+信号蛋白,破坏细胞骨架蛋白引起细胞损伤
坏死和程序性细胞死亡 ( programmed cell death,
PCD) [39-40] . 2)阻碍配体与受体结合:茁鄄ODAP 空间
结构与谷氨酸(glutamic acid, Glu)相似,可作为 Glu
类似物影响粘附调变蛋白(adhesion modulation pro鄄
tein A, AMPA)受体的激活[41-43] . Glu作为兴奋性神
经递质广泛分布于哺乳动物的中枢神经系统,是中
99114 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 熊俊兰等: 山黧豆毒素 茁鄄ODAP的生态学功能及应用摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
枢神经系统中含量最高的一种兴奋性氨基酸,对大
脑皮层神经细胞有普遍而强烈的兴奋作用,而 茁鄄
ODAP有可能在中枢神经系统中竞争性结合 Glu 受
体,即 N鄄甲基鄄D鄄天门冬氨酸(N鄄methyl鄄D鄄aspartate,
NMDA)受体和非鄄NMDA受体而诱导兴奋性神经毒
性 ( excito鄄toxicity ) . 3)干扰 MAPK信号传递: 茁鄄
ODAP通过磷脂酰乙醇胺结合蛋白 1(phosphatidyle鄄
thanolamine鄄binding protein 1, PEBP1)下调而影响促
丝裂原激酶活蛋白激酶(mitogen鄄activated protein ki鄄
nase, MAPK)信号的级联反应,可以推测 茁鄄ODAP
兴奋性神经毒性可能是通过降低 PEBP1 表达而增
加磷酸化,继而诱发关键信号蛋白而调节 MAPK 信
号级联反应[44-45] .
3郾 3摇 茁鄄ODAP的实用价值
茁鄄ODAP的大量合成集中在山黧豆苗期和结荚
期,而这 2 个时期最易受动物和昆虫的啃食,茁鄄
ODAP对动物、蠕虫和真菌等均具有不同程度的毒
性,这可能是山黧豆具有良好抗生物胁迫特性的原
因之一[10,23,46] . 另外,山黧豆植株可以通过根将 茁鄄
ODAP分泌到根际土壤,在一定程度上抑制周围植
株的生长,以获得更多的水分、阳光和营养等资
源[47] .可见,茁鄄ODAP 可以起到主动防御和被动调
控的双重作用,是山黧豆进化上的一种选择.山黧豆
是一种具有广泛耐受性的豆科作物,其极强的抗逆
性与 茁鄄ODAP 相关,如果将调控 茁鄄ODAP 的基因在
富含含硫氨基酸的植物中微量表达,有可能既能增
强其抗逆性又可以无毒,这将是 茁鄄ODAP 开发利用
的一个重要方向. 如果将毒素 茁鄄ODAP 基因转移到
其他作物中,可以进一步评价 茁鄄ODAP 的生理作用
和调节机理.
虽然大量长期食用 茁鄄ODAP会导致人畜神经性
中毒,但是研究发现 茁鄄ODAP 是植物中的一种多功
能代谢物,具有重要的药用价值[1] . 人参和三七中
含有 茁鄄ODAP,被命名为三七氨酸( dencichine),是
三七止血的重要成分[48-49] . 有研究发现,低剂量 茁鄄
ODAP可以止血,高剂量 茁鄄ODAP 会引发神经毒性,
三七氨酸(茁鄄ODAP)可通过增加体内血小板数量止
血,并缩短凝血时间和出血时间[48-50] . 使用电子显
微镜观察发现,三七注射液(含 茁鄄ODAP)能使豚鼠
血小板伪足伸展、变形、聚集,从而破坏血小板膜,产
生血小板脱颗粒等反应,进一步诱导血小板释放二
磷酸腺苷( adenosine diphosphate, ADP)、血小板凝
血因子芋和 Ca2+等止血活性物质,发挥凝血作
用[51-52] . 茁鄄ODAP止血的机理包括影响凝血酶原时
间、血小板聚集性、血栓素 A2 等方面,但还需要建
立病理动物模型进行验证.此外,有研究应用特定高
压液相色谱法检测三七氨酸(茁鄄ODAP)在动物血浆
内的药物代谢动力学以确切了解其药理作
用[50,53-54] .另外,茁鄄ODAP还可以杀死人恶性神经胶
质瘤细胞和小鼠纤维瘤细胞,用于防治部分肿瘤,其
疗效高且安全[55] . 茁鄄ODAP可以活化蛋白激酶 C,为
治疗阿尔兹海默症和提高神经元细胞长时程记忆提
供了新思路[56] .
4摇 山黧豆降毒选育进展
从传统方法到现代生物技术,山黧豆低毒品种
选育已经尝试了多种方法,但是低毒品种选育仍是
山黧豆研究的难点,其原因是低 茁鄄ODAP 难以稳定
遗传.结合现代生物技术和传统的杂交育种有望突
破这一瓶颈,丰富含硫氨基酸含量则为育种学专家
提供了一个新方向.
4郾 1摇 传统杂交育种
不同种和品种的山黧豆农艺性状和 茁鄄ODAP含
量有所不同,利用种间或种内杂交可以选育低毒品
种,而杂交的第一步就是种质资源的收集和评估.早
在 20 世纪 60 年代就有研究所对山黧豆种质资源进
行收集和评估,到目前为止,已经有加拿大、智利、埃
塞俄比亚、法国和印度等多个国家参与,位于罗马的
国际生物多样性中心收集了世界上最多的山黧豆品
种(>4000),叙利亚的国际旱农中心(ICARDA)保存
了来自超过 45 个国家的山黧豆属的种质材料,并且
针对其农艺性状和 茁鄄ODAP 含量进行了评定[13,57] .
兰州大学生命科学学院草地农业生态系统国家重点
实验室于 2011 年参与由 ICARDA 发起的生物多样
性与基因综合管理计划(Biodiversity and Integrated
Gene Management Program, BIGMP)项目,负责高产、
早熟、低毒 3 类不同遗传特性山黧豆品种在中国西
北地区的繁育工作.
分类学研究表明,只有 L. amphicarpos 和扁荚
山黧豆(L. cicera)能与山黧豆(L. sativus)杂交,因
此山黧豆低毒品种的杂交选育多集中在种内[12] . 20
世纪 90 年代,Wuletaw等[58]为选育低毒山黧豆提供
了系统的方法:1)开展杂交育种项目;2)从国际种
质资源选择低毒品种;3)收集、分类和评估本地种
的毒性和农艺性状;4)发展不同品种的抗逆性;5)
培育早熟品种.低毒品种的选育随着全球山黧豆品
种的收集取得了一定成功,与本地种相比能够培育
部分毒素相对降低的品系,如 ICARDA 的 Wasie,其
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毒素仅为 0. 08% [59] .
选育好的低毒品种需要进行详细的种质资源遗
传多样性鉴定,方法包括直观的形态学、细胞学和生
化标记等.这些方法在精度和数量上均有限,且易受
环境和发育时期的影响,因此对山黧豆低毒品种选
育产生了一定限制. 近 20 年来,人们已成功采用
DNA分子标记技术从分子水平直接定量检测物种
遗传多样性,其数量丰富、遗传稳定,不受环境和发
育时期影响,方法包括限制性片段长度多态性( re鄄
striction fragment length polymorphism, RFLP)、随机
扩增多态性 DNA(random amplification polymorphism
DNA, RAPD)和随机扩增片段长度多态性( ampli鄄
fied fragment length polymorphism, AFLP)等. 应用
DNA分子标记技术检测山黧豆种质资源,如 Chtour鄄
ou鄄Ghorbel和 Lauga[60]采用 RFLP 和 RAPD 方法鉴
定山黧豆属中地理起源和分布幅度大并有代表性的
5 个物种、9 个居群之内和之间的遗传多样性水平,
其鉴定结果与传统方法一致;利用来源于表达序列
标签(expressed sequence tags, ESTs)和表达序列中
的简单重复序列标记(EST鄄SSRs)研究埃塞俄比亚
山黧豆种群遗传多样性,发现其所有引物平均多态
性为 0. 416,平均基因多样性为 0. 477,其范围为
0郾 205(marker: Ls942) ~ 0. 804(marker: MtBA32F05),
并且该地区山黧豆变异 ( 84% ) 多发生在品系
内[60-62] .可见,DNA分子标记技术为山黧豆种质资
源鉴定提供了较强的技术支持.
目前,虽然已经成功选育了一些低毒品种,如
ICARDA的 Wasie,但是随着时间的推移,试验田中
茁鄄ODAP含量会上升[59] . 山黧豆杂交育种遇到了很
多困难:1)对低毒的定义模糊不清,不能清楚地界
定安全的食用浓度,近年来 ICADRA 将其定义为
0郾 1% ,<0. 1%可安全食用[13];2)茁鄄ODAP 是多基因
控制的产物,其含量受环境和遗传因素共同控制,环
境变动极易影响 茁鄄ODAP 含量,胁迫条件下植株 茁鄄
ODAP含量升高;3)种植时间,推迟 2 ~ 3 周种植的
茁鄄ODAP含量约增加 25% ;4)田间管理方面,如蜜蜂
等媒介引发的不可避免的杂交会影响 茁鄄ODAP 含
量.因此,影响 茁鄄ODAP的因素太多,难以控制,很难
找到合适的途径寻找能稳定遗传并应用的无或低
茁鄄ODAP的山黧豆品种[1] . 但是,稳定遗传的 DNA
分子标记技术可以为山黧豆杂交选育低毒品种提供
技术支持,并为成功杂交选育提供一定的可能.
4郾 2摇 现代生物技术
由于传统方法在山黧豆低毒品种选育方面存在
难以突破的瓶颈,因此有研究者将目光投向了现代
生物技术,如组织培养、转基因技术和反义 RNA 技
术等.
4郾 2郾 1 组织培养和转基因技术摇 山黧豆组织培养方
法的发展为利用无性系变异筛选低 茁鄄ODAP含量的
山黧豆提供了可能.用含有 8%或 12%蔗糖的琼脂
培养基培育了高 2 mm的 L. articulatus,并使 L. cly鄄
menum伊L. articulatus 杂交[63] . 以山黧豆茎尖、茎间
分生组织、叶盘、根、种子和体细胞为材料进行组织
培养,其中叶和根成功获得低 茁鄄ODAP 含量和高产
的材料[64-69] .利用遗传转化可以将特殊基因转入到
山黧豆组织中,如将载有 Neomycin Phosphotransferse
II (Npt II)基因和 茁鄄glucuronidase (gus)内含子的农
杆菌与山黧豆上胚轴段放于培养基中共同培养,应
用 GUS 组织化学染色法检测,其转化率高达
36% [70] .从土壤中分离到能降解 茁鄄ODAP 的菌株
BYA1,将其构建到载体 PUC18 中并转化到山黧豆
组织中[71] .无论是降解 茁鄄ODAP的菌株还是低毒变
异都可为进一步培育为稳定遗传低毒品种提供材
料[66,72] .但是,目前应用组织培养低 茁鄄ODAP 含量
的山黧豆存在很多困难,如染色体变异频率高、范围
广、时间早,以及能降解 茁鄄ODAP的菌株很少[13,73] .
4郾 2郾 2 根据生物合成途径改良摇 自从 1964 年印度 2
个研究小组相继独立从山黧豆种子中分离和鉴定出
茁鄄ODAP以来[10,74],为了更好地培育低毒品种,探索
茁鄄ODAP的生物合成途径已经成为山黧豆研究的重
要内容.可以通过生化突变和基因操作等技术阻断
茁鄄ODAP生物合成过程中的重要前体物质或合成酶
从而降低 茁鄄ODAP含量.
应用放射性同位素标记手段合成山黧豆 茁鄄
ODAP取得了较大进展. Malathi小组于 1970 年提出
了草酸(oxalate, OA)和 L鄄琢,茁鄄二氨基丙酸(diamin鄄
opropanoic acid, DAP)在草酰辅酶 A(Oxalyl鄄CoA)
和 茁鄄ODAP 合成酶的作用下生成 茁鄄ODAP 的路线:
草酸和辅酶 A (coenzyme A, CoA)在草酰合成酶的
作用下生成草酰辅酶 A,草酰辅酶 A 与 DAP 在 茁鄄
ODAP合成酶作用下合成 茁鄄ODAP[75-76] .
Lambein小组于 20 世纪 90 年代初提出了天冬
酰胺寅BIA寅DAP寅草酰辅酶 A 合成路线[77] . 具体
途径如下:天冬酰胺( asparagine, Asn)环化形成异
噁唑啉鄄5鄄酮( isoxazoline鄄5鄄one),异噁唑啉鄄5鄄酮在半
胱氨酸合成酶作用下取代 O鄄乙酰丝氨酸(O鄄acetyl鄄
serine, OAS)的乙酰基生成 茁鄄异噁唑啉鄄5鄄酮鄄2鄄L鄄丙
氨酸 [ 茁鄄( isoxazoline鄄5鄄on鄄2鄄yl )鄄L鄄alanine, BIA ],
10214 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 熊俊兰等: 山黧豆毒素 茁鄄ODAP的生态学功能及应用摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
BIA开环后形成短命中间体 DAP,DAP 经过 Oxalyl鄄
CoA草酰化后形成 茁鄄ODAP.其中,草酰辅酶 A 来源
于活化状态的草酸. 但是,基于此途径设计的脱毒、
去毒方法,效果不大,甚至完全没有效果,其原因可
能是此途径虽然建立在试验的基础上,但是整个过
程都是由假说链接起来的,这些假说并未都能得到
合理解释,如 DAP 是合成途径中的关键物质,但是
山黧豆植物体内并无 DAP 分布. 因此,还需要进一
步弄清楚 茁鄄ODAP的生物合成途径,以便更好地培
育出低 茁鄄ODAP品种[77-80] .
4郾 2郾 3 丰富含硫氨基酸含量 摇 有研究发现,山黧豆
自身含硫氨基酸(甲硫氨酸和半胱氨酸)的缺乏和
过量食用 茁鄄ODAP是导致山黧豆中毒的 2 个重要因
素[4,81-82] .甲硫氨酸和半胱氨酸在中枢神经系统中
起重要作用,人畜长期食用缺硫氨基酸会使身体缺
乏谷胱甘肽,而谷胱甘肽是应对氧化胁迫的重要代
谢物质之一[83] .应用有效可行的遗传转化等现代生
物技术发展高含量的甲硫氨酸和半胱氨酸的山黧豆
品种,不仅仅降低 茁鄄ODAP含量,可能是既安全食用
山黧豆又能保持山黧豆极强抗逆性的方法[1,83] . 菜
豆(Phaseolus vulgaris)有编码合成甲硫氨酸的基因,
并已经成功用于遗传转化,有研究已将该基因转入
名为 Bahir Dar 和 Gondar 的山黧豆中[84] . 2009 年 9
月,比利时根特大学召开的山黧豆大会将培育低含
量 茁鄄ODAP同时富含半胱氨酸和甲硫氨酸作为大会
主题,并把该领域定位为山黧豆培育和遗传的重要
方向.
5摇 研究展望
山黧豆能生长在多种不良环境中,包括干旱、水
涝、盐碱等,特别是非洲干旱地区,因其蛋白含量丰
富而被誉为“穷人的肉类冶.虽然 茁鄄ODAP 限制了山
黧豆作为作物的发展,但由于其在山黧豆干旱适应
方向的重要作用而受到越来越多的重视. 茁鄄ODAP
作为干旱胁迫下的浓缩氮源释放氮,同时清除活性
氧和参与渗透调节减轻干旱对山黧豆植株的伤害,
表明山黧豆 茁鄄ODAP 含量与其干旱适应性呈正相
关,但是也有部分试验不支持该结论. 例如,将高毒
和低毒 2 个品种山黧豆在不同浓度 NaCl、甘露醇和
PEG中吸涨过夜,然后转移到与原溶液具有相同渗
透压的培养基上生长 4 d,结果表明,不同毒性品种
的根 /芽无明显变化,由于根 /芽可以反映植物的干
旱适应性,因此认为 茁鄄ODAP 与耐旱性无关[85] . 但
事实上,根 /芽并不能充分反映山黧豆的干旱适应
性.有研究表明,向 PEG 胁迫下山黧豆幼苗外源施
加铕离子,既能提高株高,减缓气孔下降速率,还能
降低 茁鄄ODAP含量[86] .山黧豆繁殖生长期间水分缺
失降低了产量但保持了种子大小,其 茁鄄ODAP 含量
未显著上升,仍然<0. 05% [87] .向干旱胁迫下山黧豆
幼苗外源施加 0. 1 mg·L-124鄄表油菜素内酯,可以
提高脯氨酸含量和抗氧化酶活性,降低气孔导度和
叶片相对含水量下降速率,减缓干旱对山黧豆生长
的抑制作用,延长存活天数,与此同时,降低叶片中
茁鄄ODAP含量,说明 茁鄄ODAP 可能并非是山黧豆干
旱适应性的生态指示因子,该方面需要进一步研
究[88] .
近年来,山黧豆研究取得了很大进展,但还有一
些方向需要深入研究:1)由于山黧豆在多个抗逆方
向有很强的适应性,因此被认为拥有能适应多种胁
迫的基因,利用现代生物技术筛选出相关基因应用
于作物育种[1];2)茁鄄ODAP 的生物合成途径方面有
很大疑点,特别是 BIA和 DPA;3)茁鄄ODAP的生态学
角色方面,茁鄄ODAP 是否为干旱胁迫的生态指示因
子或只是一种代谢产物;4)茁鄄ODAP 引发神经性中
毒的具体机理;5)山黧豆低 茁鄄ODAP 和高产品种的
成功选育;6)基于 茁鄄ODAP 的药用价值,在山黧豆
茁鄄ODAP方面不仅限于降低其含量,更应大量利用
和开发[32] .
兰州大学与其他科研院所围绕山黧豆毒素分
析[89]、脱毒处理[90]、低毒品种筛选[72]及干旱适应
性[16-18]等方面进行了大量研究,本实验室致力于研
究 茁鄄ODAP在山黧豆干旱适应性中的生态学作用,
并编纂了《山黧豆生物学》 [35],总结了国内外研究,
系统介绍了山黧豆种质资源和生物学特征,山黧豆
毒素的提取及合成、定性定量分析、毒理和生理作
用,山黧豆的组织培养和遗传育种,以及今后的研究
方向与应用前景等,为山黧豆低毒品种选育提供了
一定的理论和实践基础.
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然科学版), 2007, 44(4): 439-442 (in Chinese)
作者简介摇 熊俊兰, 女,1986 年生,博士研究生. 主要从事
植物生理生态研究. E鄄mail: xiongjunlan09@ 163. com
责任编辑摇 孙摇 菊
50214 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 熊俊兰等: 山黧豆毒素 茁鄄ODAP的生态学功能及应用摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇