全 文 ：土壤宏蛋白质组学在土壤污染评价中的应用*
张摇 曦1,2 摇 李摇 锋1,2**摇 刘婷婷1,2 摇 陈英旭2
( 1浙江大学环境与资源学院环境保护研究所, 杭州 310058; 2浙江大学水环境研究院, 杭州 310058)
摘摇 要摇 土壤微生物指标是评价土壤污染程度的重要生物学指标之一.近年来,随着分子生
物学的发展,应用宏基因组学、宏转录组学和宏蛋白质组学技术考察土壤微生物的生态功能
成为土壤功能的研究热点.相对于宏基因组学和宏转录组学,土壤宏蛋白质组学是以土壤微
生物基因的功能组分———蛋白质为直接研究对象,考察不同时空点提取出来的土壤蛋白质的
变化规律,更有助于揭示土壤微生物的生态功能及其在污染物迁移转化过程中的作用,在评
价土壤污染方面也更具潜力.目前,土壤宏蛋白质组学正处于起步阶段,而土壤蛋白质的提取
方法是制约其发展的主要因素之一,因此本文综述了蛋白质作为土壤污染评价指标的优势,
重点比较了不同土壤蛋白质提取方法的优劣,结合案例分析了蛋白质作为土壤污染评价指标
的可行性及存在的问题,并对土壤宏蛋白质组学的发展进行展望.
关键词摇 土壤污染摇 土壤微生物摇 宏蛋白质组学摇 土壤蛋白质提取方法
文章编号摇 1001-9332(2012)10-2923-08摇 中图分类号摇 X53摇 文献标识码摇 A
Applications of soil metaproteomics in soil pollution assessment: A review. ZHANG Xi1,2, LI
Feng1,2, LIU Ting鄄ting1,2, CHEN Ying鄄xu2 ( 1 Institute of Environmental Science and Technology,
College of Environmental and Resource Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China;
2Academy of Water Science and Environmental Engineering, Zhejiang University, Hangzhou 310058,
China) . 鄄Chin. J. Appl. Ecol. ,2012,23(10): 2923-2930.
Abstract: Soil microbial indicator is one of the important biological indicators in evaluating the ex鄄
tent of soil contamination. In recent years, with the development of molecular biology, many studies
have focused on the ecological functions of soil microorganisms by using metagenomics, metatran鄄
scriptome and metaproteomics. Relative to metagenomics and metatranscriptome, soil metapro鄄
teomics aims to investigate the spatial and temporal changes of the proteins extracted from soil as
well as the functional components of soil microbial genomic expression products, which is more con鄄
clusive to explore the ecological functions of soil microbes and their roles in soil pollutants transpor鄄
tation and transformation. Therefore, soil metaproteomics has great potential in soil pollution assess鄄
ment. Currently, soil metaproteomics is still at its infancy stage, while soil protein extraction meth鄄
od is one of the key factors restraining the potential application of soil metaproteomics. In this pa鄄
per, the advantages and disadvantage of soil metaproteomics in soil pollution assessment were re鄄
viewed, with the focus on the comparison of different soil protein extraction methods. In combining
with case studies, the feasibility and limits of soil proteins as an indicator for soil pollution assess鄄
ment were analyzed. In addition, the future research perspectives on the development of soil metap鄄
roteomics were discussed.
Key words: soil pollution; soil microbe; metaproteomics; soil protein extraction method.
*国家自然科学青年基金项目(21007055)和中国博士后科学基金
项目(20100471714,201104718)资助.
**通讯作者. E鄄mail: lifeng0617@ yahoo. com. cn
2011鄄12鄄24 收稿,2012鄄07鄄04 接受.
摇 摇 土壤是环境的重要组成部分,通过各种途径进
入环境的污染物质,大约 90%承载于土壤中[1] . 特
别是随着我国工业化进程的迅速发展,土壤污染问
题日趋严重.人们为了恢复污染土壤的生态功能,采
取了一系列方法对土壤进行修复,但在评估修复效
果的过程中,如何选择合适的土壤污染评价指标成
为关键. 作为土壤污染评价的指标应该具备以下 3
个特征[2]:首先要对所有能引起土壤质量变化的因
素敏感,其次要对特定污染物质的影响有一致的变
应 用 生 态 学 报摇 2012 年 10 月摇 第 23 卷摇 第 10 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
Chinese Journal of Applied Ecology, Oct. 2012,23(10): 2923-2930
化,最后要能够反映土壤污染的程度.
用于评价土壤污染的指标主要包括物理、化学
和生物 3 个方面.尽管理化指标在土壤评估过程中
具有重要作用,但其只有在土壤受到严重污染时才
会响应[3-4] .而土壤生物学特征在土壤稍微受到污
染物胁迫时便会发生变化[5-6],因此对土壤质量的
变化更敏感.目前用于土壤污染评价的生物学指标
主要有土壤微生物量、微生物群落组成、土壤微生物
生物量碳、潜在可矿化氮、土壤呼吸强度、微生物代
谢熵和土壤酶等[4,7] .其中,土壤微生物参数是最早
也是应用最多的用于反映土壤质量的生物学指
标[8-9] .而定量描述土壤微生物的多样性特别是其
在土壤环境中行使的功能成为目前研究的热点,同
时也是难点.因为大多数土壤微生物(约有 80% ~
99% )不能够通过传统培养方法鉴别[8,10-11] . 然而,
随着基因组学、转录组学和蛋白质组学的蓬勃发展,
一些基于土壤核酸和蛋白质的新方法为解决这一问
题提供了新的可能与方案.
1摇 蛋白质作为土壤污染评价指标的潜在优势
随着分子生物学的快速发展,生物技术的应用
不仅使得研究和鉴别某些无法培养的微生物成为可
能,而且有助于我们研究土壤微生物的多样性以及
微生物群落结构[10] . 土壤宏基因组学(将群落中所
有微生物的 DNA 提取出来研究)可以鉴别出参与
土壤污染物降解过程的微生物基因,在 DNA水平上
研究微生物群落结构,并获得与之相关的特定微生
物群落的基因丰度.与之相类似,宏转录组学(将群
落中所有微生物的 RNA 提取出来研究)可以提供
基因活性方面的信息,并有助于揭示土壤微生物的
功能[12] .基于 DNA和 RNA的分子生物技术主要包
括微阵列技术、实时定量 PCR以及稳定同位素探针
等[13] .这些技术虽然提供了对自然环境中微生物多
样性的认识,但是仅具有微生物群落结构方面的信
息还不能揭示微生物群落的生态功能. 其原因是基
因在转录、翻译后产生蛋白质的过程中,存在着转录
水平和翻译水平的调控,蛋白质往往还要经过剪接、
修饰加工之后,最终才能成为有功能的蛋白质.也就
是说 DNA和信使 RNA(mRNA)难以预测翻译后的
修饰,mRNA的丰度和蛋白质的丰度之间并非具有
绝对的对应关系,而蛋白质才是生物功能的体现
者[14-17] .
相对于核酸来说,蛋白质反映了微生物代谢反
应和调控因子方面的实际功能,并给出了比功能基
因甚至 mRNA 更加直接具体的关于微生物活性方
面的信息,是对功能基因有力的补充[18-20] . 近年来
兴起的宏蛋白质组学 (Metaproteomics)最初是由
Wilmes和 Bond[21]提出的,指大规模鉴定特定时间
和地点环境样品中的所有蛋白质[22] .由于蛋白质的
表达是特定生态系统下具体微生物活性的反映,因
而宏蛋白质组学在微生物群落功能分析过程中具有
更大的潜力[18] .
综上所述,使用蛋白质作为土壤污染评价指标
具有诸多优点[4,14,19,23-24]:首先,通过对土壤蛋白质
的分析可以检测新基因并提供与土壤微生物多样性
相关的基因信息;其次,基因是相对静态的,而蛋白
质是动态的,随着时间和空间的变化而变化,因此对
土壤环境中污染物质的反应更加灵敏;再次,在核酸
检测过程中基于 PCR 的技术对于某些模板常常效
果不佳,因此不宜用于定量分析,而宏蛋白质组学可
以弥补这一缺点,对基因的最终产物蛋白质能够进
行定性和定量分析测定;最后,代谢过程的调节可能
发生在转录以后,因此 mRNA 转录结果和实际微生
物的活性并不存在一一对应的关系,而分析土壤中
蛋白质的组成,则可以给出微生物代谢的直接信息,
其中出现的一些特异蛋白质可以作为表征土壤微生
物群落功能进而评价土壤污染程度的指标.
2摇 土壤蛋白质的提取方法
当土壤环境中的生物细胞死亡或者破裂之后,
其中的蛋白质便会释放到土壤中. 尽管一些胞外蛋
白很快就被土壤中的微生物降解成许多小的多肽片
段,但是大部分的蛋白质因为与土壤黏土矿物和腐
殖质结合而未被分解[20,25-26] . 因此,在设计土壤蛋
白质提取方法的时候,一般要满足以下 3 个条件:首
先,能够成功从土壤样品中获取大量蛋白质;其次,
对获得的粗提取蛋白质进行必要的纯化,去除腐殖
质等可能影响后续分析的分子;最后,蛋白质的提取
条件不能改变其分子结构,否则会影响质谱分析的
结果.在这一过程中,最大的困难在于蛋白质与腐殖
酸的分离[10,12,19] .
2郾 1摇 影响土壤蛋白质提取效果的因素
蛋白质对环境因素(包括温度、pH 和离子强
度)的变化十分敏感,其三维空间结构也很容易变
化.因此,在提取土壤蛋白质的过程中提取缓冲液的
组分显得尤为重要,良好的缓冲体系有助于保持蛋
白质的空间结构和功能.为了防止蛋白质变性,缓冲
体系的 pH值一般控制在 3郾 0 ~ 9郾 5,否则可能出现
4292 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 23 卷
蛋白质肽键水解、二硫键断裂和消旋化作用等情况.
一般来说,碱性条件被用来萃取腐殖质,在这种条件
下会引入影响蛋白质分析的组分,而在酸性环境中
则可以使与蛋白质结合的腐殖酸沉淀[12] .由于蛋白
质分子吸附于土壤矿物以及有机质是一个吸附鄄解
吸的物理化学过程,这一过程取决于 pH 环境,氢离
子活性控制着反应的进程[27] . 因此,合适的 pH 值
有助于蛋白质分子的解吸,增加提取效率.根据蛋白
质提取缓冲液的成份不同提取出的土壤蛋白质形态
也有所不同.采用盐溶液提取出的是可交换态的蛋
白质,而采用碱性焦磷酸盐或者 NaOH 溶液则可以
提取出与土壤矿物以共价键结合的蛋白质.此外,在
提取过程中需要加入还原剂如二硫苏糖醇(DTT)或
者 茁鄄巯基乙醇,以保持蛋白质的结构与活性;为了
防止蛋白质被蛋白酶降解,还需要采取一些措施抑
制蛋白酶的活性,如低温操作或者添加酶抑制剂
等[12] .以上因素都会影响到后续蛋白质分析和鉴定
过程,因此设计提取方案时必须综合考虑这些因素.
2郾 2摇 几种土壤蛋白质提取方法
目前,文献中虽然提出了许多种土壤蛋白质的
提取方法,但是这些方法的提取效率和质量参差不
齐,没有一种可以适用于所有类型土壤的通用方法,
而能否得到高质量的蛋白质样品对后续的检测和分
析至关重要[24] . 因此,下面介绍一些土壤蛋白质的
提取方法,并就其优缺点进行比较.
Wright等[28]早在 1996 年研究土壤球囊霉素
时,建立了一种提取土壤中球囊霉素的方法.其采用
pH=7郾 0 的柠檬酸盐缓冲体系在高温(121 益)条件
下提取,这是一种用于提取球囊霉素的有效方法.在
如此极端的提取条件下,一些非热稳定性蛋白质在
这一过程中变性,导致提取出的蛋白质种类减少,但
是一些植物产生的蛋白质却不会变性,因此这种高
温操作方法也仍然可以提取一些土壤蛋白质[29] .
Murase等[30]采用 pH = 6郾 0 的磷酸盐缓冲体系
从温室土壤中提取胞外蛋白,后续使用三氯乙酸
(TCA)沉淀蛋白.值得注意的是,此处缓冲液的 pH
=6郾 0,过高的 pH会提取出大量的有机质,对后面使
用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离蛋白质造成障
碍.该法用于温室土壤提取蛋白的效果较好,但用于
森林土、水稻土和茶园土等提取效果较差,因此适用
范围较窄.
Singleton等[31]研究 Cd污染对土壤蛋白质的影
响时,改进了 Ogunseitan[32]的提取方法,采用 Tris鄄
HCl缓冲体系(包含蔗糖、DTT、EDTA和蛋白酶抑制
剂)提取土壤总蛋白,分别采用液氮速冻法和玻璃
珠研磨法打散土壤团粒使细胞裂解,其中速冻法可
以最大程度提取土壤蛋白质.
Schulze等[33]研究了分离于森林湖泊及土壤中
溶解态有机质的各种蛋白质,在试验过程中使用多
钨酸盐比重液使颗粒态有机质与土壤分离,再用
10%HF从土壤中提取可溶性蛋白质,后续采用液相
色谱(LC)和质谱(MS)进行鉴定.
Ogunseitan等[10]提出了一种相对简单的提取方
法,采用磷酸盐缓冲体系和 EDTA溶液作为提取剂,
将所得悬浮液于冰浴中进行声波裂解,打散土壤团
粒,使细胞裂解,释放蛋白质. 此处声波裂解法是一
种常用于打散聚集的土壤颗粒的方法,并可以使细
胞裂解释放出蛋白质分子. 然而声波裂解在某些情
况下(取决于土壤特征)可能引起蛋白质变性,但在
低温下操作可以缓解这种不利影响[10] .
Benndorf等[19]提出了一种新的蛋白质提取方
法,用于土壤和地下水的蛋白质功能分析.这种方法
将 NaOH与苯酚联合使用,分离土壤样品中的有机
和无机组分.土壤样品加入 NaOH 将腐殖质和蛋白
质从土壤矿物和裂解的微生物细胞中释放出来,之
后使用苯酚萃取,将蛋白质和腐殖质分离.但是最近
有研究指出,单独使用 NaOH 作为土壤蛋白质提取
液,仅能从土壤样品中提取部分蛋白质,一些水溶性
蛋白在提取过程中损失,而且腐殖酸不能被有效去
除,影响后续分析[34-35] .
Masciandaro等[36]以 2 种森林土壤为材料,分别
采用 3 种不同的蛋白质提取剂来提取细胞外蛋白.
这 3 种蛋白质提取缓冲液分别为焦磷酸盐缓冲液
(pH=7),其用于提取与腐殖酸结合的胞外蛋白质,
以及磷酸盐缓冲液(pH = 6)和硫酸钾缓冲液(pH =
6郾 6),其用于提取可溶性胞外蛋白质,得到的蛋白
质样品使用聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)纯化.获得的
蛋白质样品使用 SDS鄄PAGE 分离,银染后图谱背景
颜色较深,仅有少量条带可以识别,影响蛋白质的鉴
定.
Chen等[34]在研究土壤中球囊霉素相关蛋白的
过程中,分别比较了柠檬酸盐、NaOH和 SDS 缓冲液
作为蛋白质提取液的提取效果,在使用柠檬酸盐提
取蛋白质时,还分别使用 TCA和苯酚对获得的样品
进行纯化.结果表明,SDS缓冲液能够更好地提取土
壤蛋白,而苯酚能够有效地去除干扰物质.在此基础
上优化参数建立了连续提取法,即采用柠檬酸盐缓
冲液和 SDS缓冲液分步提取土壤蛋白,之后用苯酚
529210 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 张摇 曦等: 土壤宏蛋白质组学在土壤污染评价中的应用摇 摇 摇 摇 摇
使蛋白质与腐殖质分离. 这种方法的优点是采用柠
檬酸盐和 SDS 缓冲液分步提取可以获得更多的蛋
白质样品,而且样品中含有的干扰物质较少,在
SDS鄄PAGE分离的过程中可以得到更多的条带. 最
近,Wang等[37]研究根际土壤的宏蛋白质组学时,在
分步提取法的基础上,同时使用柠檬酸盐缓冲液和
SDS缓冲液一步提取土壤蛋白质,也获得了较好的
效果.
Chourey等[38]改进了一种直接裂解细胞提取土
壤蛋白质的 SDS鄄TCA方法.使用 SDS缓冲液作为土
壤蛋白质提取液,获得的蛋白质溶液加入 TCA 纯
化.在之后的分析过程中,可以鉴别出的蛋白质最多
可达 1343 种,提取效果较好.但是否具有普适性还
需要进一步验证.
综上所述,土壤蛋白质的提取方法多种多样
(表 1),目前还没有一种通用的方法,不同的方法只
适用于某一种土壤.因此,在进行土壤宏蛋白质组学
研究时,要根据所研究土壤的实际情况合理选择和
改进提取方法,为后续的分离和鉴定工作提供便利
条件.
此外,在蛋白质沉淀过程中,苯酚鄄醋酸铵甲醇
溶液和 TCA /丙酮是常用的两种方法. 这里需要指
出,在植物组织蛋白质提取时,与苯酚鄄醋酸铵甲醇
溶液提取不同,TCA /丙酮沉淀的方法会使分子量大
的蛋白质损失,而分子量较小的蛋白质增加. 此外,
沉淀后蛋白质的再溶解也是 TCA /丙酮沉淀法所面
临的问题,特别是对大分子蛋白质而言尤为如此,因
而 TCA /丙酮蛋白质样品再溶解时,获得的大部分
都是小分子蛋白质[39] .但在土壤蛋白质提取过程中
是否存在类似现象还有待进一步研究.
表 1摇 土壤蛋白质的提取方法及适用范围
Table 1摇 Soil protein extraction methods and their potential application field
方法来源
Origin of the method
土壤蛋白质提取缓冲体系
Soil protein extraction buffer system
分析方法
Analysis method
方法特点
Characteristics of methods
Simonart 等(1967) [40] 0郾 1 mol·L-1 NaOH和 2 mol·L-1 HF 纸层析法 有效分离蛋白质与腐殖酸
Ogunseitan(1993) [32] 50 mmol·L-1 Tris鄄HCl(pH = 7郾 6)、1 mmol·L-1 EDTA、
10% 蔗糖、1 mmol·L-1 DTT、300 滋g·mL-1溶菌酶、
0郾 1%鲸蜡醇聚氧乙烯醚,0益条件下冻融
SDS鄄PAGE 提取土壤中的总蛋白或者某种
特定蛋白质
Wright和 Upadhyaya
(1996) [28]
50 mmol·L-1柠檬酸缓冲液( pH = 8郾 0),121 益提取 90
min
SDS鄄PAGE 用于提取土壤中的球囊霉素
Criquet等(2002) [26] 分别采用蒸馏水、CaCl2、KCl、NaCl、Na2 SO4、pH = 6郾 0 的
5 种缓冲液(丁二酸盐、Bis鄄Tris、磷酸盐、焦磷酸盐和柠
檬酸盐)
Bradford 法测定
含量
优化了土壤蛋白质提取方法,降
低蛋白质样品中腐殖酸以及其
他与 Bradford 试剂反应的杂质
含量,所用方法中 CaCl2提取的
样品杂质含量较少
Singleton等(2003) [31] 50 mmol·L-1 Tris鄄HCl、2 mmol·L-1 DTT、4 mmol·L-1
EDTA、0郾 1% Brij 58,缓冲体系 pH=7郾 58,在速冻条件下
提取
SDS鄄PAGE 提取土壤中的胞内和胞外蛋白
质
Murase等(2003) [30] 67 mmol·L-1磷酸盐缓冲液(pH=6郾 0) SDS鄄PAGE 仅提取土壤中的胞外蛋白质
Schulze等(2005) [33] 10% HF 液相色谱鄄质谱 提取与可溶性有机质结合的土
壤蛋白质
Ogunseitan等(2006) [10] 0郾 3 mol·L-1 K2HPO4,0郾 3 mol·L-1 EDTA(pH=8郾 0) SDS鄄PAGE 提取土壤中的总蛋白质,同时可
以保持酶的活性
Benndorf等(2007) [19] 0郾 1 mol·L-1 NaOH SDS鄄PAGE、2D鄄
PAGE、 液 相 色
谱鄄质谱
可以提取污染土壤中胞外和胞
内蛋白质,用于宏蛋白质组学
分析
Masciandaro等
(2008) [36]
0郾 1 mol·L-1焦磷酸盐缓冲液(pH=7郾 0),67 mmol·L-1
磷酸盐缓冲液(pH = 6郾 0),0郾 5 mol·L-1硫酸钾缓冲液
(pH=6郾 6)
SDS鄄PAGE 根据缓冲液的不同可以提取出
与腐殖酸结合的蛋白质以及溶
解性胞外蛋白质
Chen等(2009) [34] 0郾 25 mol·L-1柠檬酸盐缓冲液( pH = 8郾 0),SDS 缓冲液
(10% SDS、 pH = 6郾 8 的 0郾 1 mol · L-1 Tris鄄HCl、 20
mmol·L-1 DTT)
SDS鄄PAGE,2D鄄
PAGE
用于提取与球囊霉素相关的土
壤蛋白质,可以有效去除土壤腐
殖酸
Chourey等(2010) [38] 碱性 SDS 缓冲液(5% SDS、50 mmol·L-1 pH = 8郾 5 的
Tris鄄HCl、0郾 15 mol·L-1 NaCl、0郾 1 mmol·L-1 EDTA、
1 mmol·L-1 MgCl2、50 mmol·L-1 DTT)
液相色谱鄄质谱 直接裂解土壤微生物细胞获得
土壤中的总蛋白质
Taylor和 Williams
(2010) [41]
0郾 5 mol·L-1 Tris鄄HCl( pH = 8郾 7)、0郾 9 mol·L-1蔗糖、
0郾 05 mol·L-1 EDTA、0郾 1 mol·L-1 KCl 和 2% 茁鄄巯基
乙醇
SDS鄄PAGE 用于提取土壤微生物的蛋白质
进行蛋白质组学分析
6292 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 23 卷
3摇 土壤蛋白质的分离与鉴定
蛋白质分离和鉴定技术的进步极大地促进了蛋
白质组学的发展,特别是 SDS鄄聚丙烯酰胺凝胶电泳
(SDS鄄PAGE)、双向凝胶电泳(2D鄄PAGE)和质谱技
术的联用,使得宏蛋白质组学可以应用于土壤这样
的复杂系统.
3郾 1摇 蛋白质的分离
SDS鄄PAGE 是对蛋白质进行分离、纯化和分析
的一种常用方法,主要是依据蛋白质的分子量大小
对其进行分离. SDS 的目的是使蛋白质分子变性,
SDS鄄蛋白复合物的大小与分子量成正比,有效提高
了分离效率.进行土壤宏蛋白质组学研究,一般选择
4%的浓缩胶,12%的分离胶.但是当混合物成分比
较复杂时,仅仅使用这种单向凝胶电泳往往不能达
到良好的分离效果,鉴于这种局限性,2D鄄PAGE 应
运而生.
等电聚焦凝胶电泳( IEF)是依据蛋白质分子的
净电荷或者等电点进行分离的技术. O爷Farrell[42]证
实,将等电聚焦后的胶条放在 SDS鄄PAGE 上依据分
子量进行第 2 向电泳时可以提高分辨率. 目前的双
向电泳第 1 向大都采用固相 pH梯度等电聚焦,第 2
向为 SDS鄄PAGE[43] .在分析土壤蛋白质的过程中,第
1 向等电聚焦,一般选择 pH 为 3 ~ 10 的胶条. 双向
凝胶电泳上蛋白质点的亮度和面积更加直观地反映
了特定土壤蛋白质的表达丰度[18] .
为了使 SDS鄄PAGE 电泳的条带或者 2D鄄PAGE
图谱的点可视化,需要使用合适的方法对电泳后的
凝胶进行染色.目前常用的染色方法主要有考马斯
亮蓝法和银染法.考马斯亮蓝染色法的敏感度是每
条带 0郾 1 ~ 1 滋g,而银染的敏感度是每条带 8 ~ 10
ng,比考马斯亮蓝染色法敏感 100 倍[44-45] .
双向电泳虽然具有上样量低、最大程度减少疏
水性蛋白损失以及高分辨率等优点,但也具有技术
复杂、操作费时和自动化程度低的缺点[46] .近年来,
以液相色谱(LC)为基础的蛋白质组学方法(鸟枪蛋
白质组学)成为宏蛋白质组学分析的新方法[47] . 这
种方法可以从整体上分析微生物,目前能精确鉴定
出包括高丰度蛋白(如代谢酶)和低丰度蛋白(如调
控蛋白)在内的 500 ~ 1000 种蛋白质,但在差异表达
蛋白分析方面不如双向电泳灵活高效.另外,由于离
子化的抑制作用,液相色谱分离法还很难定量分析
胰蛋白酶肽段[48] .
3郾 2摇 蛋白质的鉴定
质谱技术是蛋白质研究中必不可少的工具,并
成为蛋白质组学研究中的主要支撑技术. 对于蛋白
质和多肽而言,质谱技术最重要的就是要确定蛋白
质或多肽的分子质量和等电点. 而分子量是一个蛋
白质、多肽或者氨基酸最基本的特征.不同的氨基酸
组成、不同的氨基酸序列、不同的修饰方式、不同的
蛋白之间结合方式、不同的位点差异都可以在蛋白
质的分子质量和等电点上体现. 对组成蛋白质的多
肽或氨基酸的分子量和等电点的测定实际上就是对
蛋白质种类和性质的鉴定[49] .
4摇 宏蛋白质组学在土壤污染评价中的应用
目前,宏蛋白质组学应用于地球生物化学循环
以及根际土壤微生态系统的研究较多,而对污染土
壤微生物的群落结构和功能方面的研究鲜有报道.
Singleton等[31]分别研究了 Cd 对土壤微生物量
和土壤蛋白质表达的影响,结果表明,在 Cd 胁迫
下,土壤蛋白质相对于微生物量的减少更加明显
(多约 10% ).就蛋白质表达量而言,由于提取方法
不成熟,从土壤中仅提取出少量蛋白质,并且样品中
的有机质严重干扰了 SDS鄄PAGE的分离效果.因此,
所有样品都只有少量条带可见.但是在 Cd 胁迫下,
土壤中的小分子量( <21 kDa)蛋白质大量增加,说
明重金属会刺激微生物合成低分子量的蛋白质(如
金属硫蛋白).
Benndorf等[19]应用宏蛋白质组学研究了土壤
中有机污染物的生物降解过程. 试验中向 2 组土壤
加入等量的除草剂 (2,4鄄D),其中一组添加 3 种
2,4鄄D降解菌,培养 22 d 后,分别提取土壤中的总蛋
白质,得到的样品使用 SDS鄄PAGE 和 2D鄄PAGE 分
离.由于土壤中腐殖酸含量较高,尽管对所提取的土
壤蛋白质进行了必要的纯化,但是仍然无法使用
2D鄄PAGE 对其分离,仅能通过 SDS鄄PAGE 进行分
析,并首次使用 LC鄄MS对土壤微生物的胞内蛋白质
进行鉴定.结果表明,2,4鄄D 双加氧酶、外膜蛋白、邻
苯二酚 1,2鄄双加氧酶和热休克蛋白(分子伴侣 Gro鄄
EL)在处理组大量表达,表明它们在 2,4鄄D 的降解
过程中发挥重要作用.
综上所述,宏蛋白质组学在土壤污染评价方面
的应用还处在探索阶段,这些研究大都是在实验室
可控条件下开展的,需要在土壤中预先培养或者富
集特定微生物.但是自然环境下,土壤是个复杂的生
态系统,诸多因素共同影响着污染物的迁移、转化以
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及微生物的群落结构,土壤蛋白质在实际污染土壤
评价中的应用还有待进一步研究.
5摇 结论与展望
每克土壤中大约有 4000 ~ 7000 种达 100 亿个
细菌[50],因此土壤蛋白质的种类远多于微生物数
量.土壤宏蛋白质组学是鉴定与微生物生理生化活
动相关的蛋白质,通过对差异蛋白质进行鉴定,可以
甄选出与微生物生理活动密切相关的基因,进而阐
明微生物的基因组功能.因此,土壤宏蛋白质组学可
以帮助我们定量化评价土壤污染程度,并明确微生
物在土壤污染过程中的作用、参与其中的蛋白以及
它们在生态系统中的功能.有理由相信,使用蛋白质
评价土壤微生物生态功能在土壤污染评估方面应用
潜力巨大.土壤宏蛋白质组学的研究势必成为微生
物群落功能研究的中心,随着基因组测序技术和蛋
白质谱鉴定技术的发展,宏蛋白质组学将会在土壤
污染评价中发挥更大的作用[18] .
与 DNA 和 RNA 研究相比,土壤蛋白质研究存
在诸多挑战.土壤蛋白质分为细胞内蛋白和细胞外
蛋白,其分布因土壤基质类型而存在巨大差别.由于
土壤中蛋白质含量很少,且常与有机质(如腐殖酸
等)结合,又没有类似 PCR 的蛋白扩增技术用于土
壤蛋白质富集,因此建立适当的提取方法以提高蛋
白质的提取效率尤为重要.但是,目前还没有标准化
的蛋白质提取方法,也没有商业土壤蛋白质提取试
剂盒可供选择,不同的方法可能只适用于某一类特
定的土壤[12] .因此,土壤宏蛋白质组学仍然期待建
立一种更加通用的土壤蛋白质提取方法,这样蛋白
质作为土壤污染评价指标才能发挥更大的潜力.
近年来,随着蛋白质分析技术的迅速发展,蛋白
质组学研究取得了很大进展,但是与 DNA 技术相
比,蛋白质技术仍然稍显逊色. 目前,蛋白质组学研
究主要依赖于蛋白质提纯或者 SDS鄄PAGE 等方法,
但这些方法都不是高通量的方法[51] . 此外,低丰度
蛋白通常被高丰度蛋白掩盖而很难分离,因而许多
重要蛋白质的信息可能会丢失. 质谱技术是目前蛋
白质鉴定的主流技术,并已经应用于土壤宏蛋白质
组学,但只有少数蛋白质可以被鉴定出.原因在于质
谱技术只能对已经被基因测序的微生物产生的蛋白
质进行大规模分析[52],而很多土壤微生物的基因未
被测序[12],缺乏相应的数据库支持,因此给鉴定工
作带来困难.鉴于此,土壤宏蛋白质组学研究目前还
不能给出全面精确的土壤蛋白质种类、数量等信息.
但是,随着环境样品中可利用基因数据的增加和多
肽从头测序技术的改进将极大地促进土壤蛋白质组
学分析和功能翻译研究的发展[19] .
综上所述,尽管研究人员在土壤蛋白质的提取、
分离和鉴定方法方面做了大量工作,但是土壤宏蛋
白质组学目前仍处于起步阶段.因此,现阶段在应用
蛋白质作为土壤污染评价指标时,一定要将现有的
技术手段综合运用. 土壤蛋白质组学与基因组学和
转录组学一起将为研究土壤微生物的群落结构和生
态功能提供强有力的支持,基因组技术与蛋白质组
技术相结合将有助于阐明微生物群落结构和土壤生
态功能之间的关系[53] . 例如,将土壤蛋白质组学与
稳定同位素探针技术(SIP)相结合,不仅可以提供
土壤逆境条件下蛋白质或者酶数量减少方面的信
息,而且可以得到与具体土壤过程相关的蛋白质并
确定其来源[4] .另一方面需要进一步丰富和发展蛋
白质组学研究技术,增加其敏感性、稳定性、可重复
性和特异性.土壤宏蛋白质组学是在蛋白质水平上
定性和定量评价土壤质量和功能的强有力的工具,
随着蛋白质组学技术的进一步发展以及相关数据库
的进一步充实,土壤宏蛋白质组学在评价土壤污染
状况和修复效果方面会有更广阔的发展前景.
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作者简介摇 张摇 曦,男,1987 年生,硕士研究生.主要从事环
境生物技术研究. E鄄mail: xizhang1987@ zju. edu. cn
责任编辑摇 肖摇 红
0392 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 23 卷