全 文 ：铜尾矿废弃地生物土壤结皮固氮微生物多样性*
詹摇 婧摇 阳贵德摇 孙庆业**
(安徽大学资源与环境工程学院, 合肥 230601)
摘摇 要摇 生物土壤结皮能够有效提高矿业废弃地有机质和氮的积累,促进植被的恢复.本研
究基于固氮微生物的 nifH基因多样性,以铜陵铜尾矿废弃地 3 种类型的生物土壤结皮(藻结
皮、藓结皮和藻鄄藓混合结皮)为对象,利用变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术研究生物土壤结皮
中固氮微生物的多样性以及废弃地植物群落发育对其产生的影响.结果表明: 尾矿库裸地表
面的藻结皮的固氮微生物多样性最高,其次为维管植物群落下的藻鄄藓混合结皮,苔藓结皮的
固氮蓝藻多样性最低;随着维管植物群落高度和盖度的增加,固氮微生物多样性降低,铜尾矿
废弃地的 pH、水分、有机质、养分含量(氮和磷)以及有效态和总重金属浓度对固氮微生物多
样性的影响均不显著.测序和系统发育分析表明,废弃地结皮中固氮微生物以蓝藻为主,主要
为不具有异形胞的丝状蓝藻.
关键词摇 生物土壤结皮摇 固氮摇 微生物多样性摇 矿业废弃地摇 PCR鄄DGGE
文章编号摇 1001-9332(2014)06-1765-08摇 中图分类号摇 S154. 36摇 文献标识码摇 A
Diversity of nitrogen鄄fixing microorganisms in biological soil crusts of copper mine wastelands.
ZHAN Jing, YANG Gui鄄de, SUN Qing鄄ye (School of Resources and Environmental Engineering,
Anhui University, Hefei 230601, China) . 鄄Chin. J. Appl. Ecol. , 2014, 25(6): 1765-1772.
Abstract: Biological soil crusts play an important role in increasing the accumulation of organic
matter and nitrogen in re鄄vegetated mining wastelands. The diversity of nitrogen鄄fixing microorgan鄄
isms in three types of biological soil crusts (algal crust, moss crust and algal鄄moss crust) from two
wastelands of copper mine tailings were investigated by polymerase chain reaction鄄denaturing gradi鄄
ent gel electrophoresis, based on the nifH gene of diazotrophs, to investigate: The diversity of nifH
gene in the crusts of mine wastelands, and whether and how the nifH gene diversity in the crusts
could be affected by the development of plant communities. The algal crust on the barren area dis鄄
played the highest nifH gene diversity, followed by the algal鄄moss crusts within vascular plant com鄄
munities, and the moss crust displayed the lowest nifH gene diversity. The diversity of diazotrophs
in algal鄄moss crust within vascular plant communities decreased with the increase of height and
cover of vascular plant communities. No significant relationship was found between wasteland
properties ( pH, water content, contents of organic matter, nitrogen and phosphorus and heavy
metal concentration) and nifH gene diversity in the crusts. Sequencing and phylogenetic analysis
indicated that most nitrogen鄄fixing taxa in the crusts of mine wastelands belonged to Cyanobacteria,
especially nonheterocystous filamentous Cyanobacteria.
Key words: biological soil crust; nitrogen fixation; microbial diversity; mine wasteland; PCR鄄
DGGE.
*国家自然科学基金项目(41171418)资助.
**通讯作者. E鄄mail: sunqingye@ ahu. edu. cn
2013鄄10鄄10 收稿,2014鄄03鄄11 接受.
摇 摇 生物土壤结皮是由蓝藻、细菌、真菌、地衣及苔
藓组成的复合体,广泛分布于高原[1-3]、森林[4]和沙
漠[5-7]等生态系统. 生物土壤结皮能够促进水土保
持[1,6]、改善土壤有机质和养分含量[1]、提高微生物
活性和微生物生物量[8],同时影响维管植物的生长
和群落的发育[9] . 研究表明,生物土壤结皮中的蓝
藻和固氮细菌对大气中氮的固定是陆地生态系统的
重要氮源[3-4,10-12] . Russow等[13]认为,沙漠中结皮的
固氮能力在 10 ~ 41 kg N·hm-2·a-1 . 固氮微生物
的活性和多样性因基质的物理结构和养分条件而
异[4,14-15],且对重金属较为敏感[16-17] . 生物土壤结
应 用 生 态 学 报摇 2014 年 6 月摇 第 25 卷摇 第 6 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
Chinese Journal of Applied Ecology, Jun. 2014, 25(6): 1765-1772
皮中的主要固氮类群蓝藻能够进行光合自养,具有
耐旱、耐贫瘠、耐盐碱的特性,广泛分布于岩石、沙
漠、矿业废弃地等极端环境中[9,18-21] .
实验室培养和显微镜观察常被用于分析生物土
壤结皮中的微生物群落[22-23],然而,较大比例的结
皮微生物不能被培养. 因此,分子生态学方法,包括
限制性内切酶片段长度多态性(RFLP)、末端限制性
片段长度多态性 ( T鄄RFLP)、变性梯度凝胶电泳
(DGGE)等逐渐被应用于生物结皮中微生物群落结
构和多样性的研究[1,3,5,12,24] . PCR鄄DGGE 是一种快
速的分析微生物群落的 DNA技术,可用于比较不同
时间、空间、理化条件和环境扰动下的微生物群落结
构[3,5,25-26] . nifH基因是编码固氮酶铁蛋白亚基的一
段高保守序列,可有效地用于探讨环境样品中的固
氮微生物[3,25-28] .
矿业废弃地是由选矿过程中的废弃物堆积而形
成的人工废弃地,其养分(氮和磷)贫瘠,有机质含
量低,并且含有高浓度的重金属[29-30] . 氮含量的提
高被认为是控制废弃地自然生态系统初级生产和大
多数生物活性的主要因子[31-32] . 野外调查表明,铜
陵铜尾矿废弃地表面生长有各种类型的生物土壤结
皮,结皮出现于废弃地生态演替过程的早期阶段;根
据结皮的主要生物组成,废弃地表面的生物土壤结
皮可分为藻结皮、苔藓结皮和藻鄄藓混合结皮[29] .
废弃地自然生态恢复过程中,湿度适宜条件下
藻类定居,后期各种苔藓出现,形成藻鄄藓混合结皮;
维管植物群落下也有藻藓混合结皮的形成. 研究表
明,铜尾矿废弃地的生物土壤结皮能够显著提高尾
矿土壤的有机质、总氮和速效磷含量[29],促进微生
物生物量和土壤酶活性的提高[8] .
本研究基于固氮微生物的 nifH基因,利用 PCR鄄
DGGE技术分析铜尾矿废弃地生物土壤结皮中固氮
微生物多样性,比较不同类型生物土壤结皮 nifH 基
因的差异,探讨环境因子对结皮中固氮微生物多样
性的影响.本研究假设在尾矿废弃地自然生态恢复
过程中,维管植物群落的发育能够改变废弃地表面
的湿度、光照、温度和化学性质,从而引起生物土壤
结皮固氮微生物群落结构的改变.
1摇 研究区域与研究方法
1郾 1摇 研究区域
杨山冲铜尾矿库和铜官山铜尾矿库位于安徽省
铜陵市铜矿区(30毅54忆 N,117毅53忆 E). 该区域年降
水量 1346 mm,雨季为 5—9 月,年均温为 16郾 2
益 [29] .两尾矿库分别弃置于 1991 年和 1980 年. 尾
矿库废弃地植物群落演替表现为:原生裸地®隐花
植物结皮®草本植物群落®木本植物群落[29] .杨山
冲尾矿废弃地裸地和植物群落呈斑块分布,白茅
( Imperata cylindrica var. major) 群落、木贼 ( Hip鄄
pochaete ramosissimum)群落和中华结缕草 (Zoysia
sinica)群落为其优势植物群落,维管植物群落下伴
随有藻鄄藓混合结皮的形成[27] . 废弃地表面同时分
布有斑块状的苔藓群落,如黄色真藓(Bryum palles鄄
cens)结皮[29] .白茅群落是铜官山老尾矿废弃地的优
势植物群落[30] .
1郾 2摇 样品采集
2008年 7月采集杨山冲尾矿废弃地 5 种类型结
皮,包括裸露区藻结皮(YA)、黄色真藓结皮(藓结皮,
YM)以及白茅、木贼和中华结缕草植物群落下的藻鄄
藓混合结皮(YI、YH和 YZ);采集铜官山尾矿废弃地
白茅群落下的藻鄄藓混合结皮(TI).同时,采集各类型
生物土壤结皮所对应的结皮下层的铜尾矿土样品.每
个样本 3点重复,每个重复 6 点混合.基于样方中植
物群落的垂直投影面积,用目测法测定植物群落的盖
度,随机选取样地 6株植物测定植被高度.
1郾 3摇 研究方法
1郾 3郾 1 铜尾矿土壤的理化性质分析 摇 采用 pH 计和
电导法测定尾矿土壤样品的 pH和电导率(尾矿W 颐
水V =1 g 颐 5 mL);样品(105依2) 益烘干测定其含水
量(基于样品湿质量计算);有机质采用烧失量法测
定,105 益烘干样品于马弗炉 550 益灼烧 6 h;总磷
(TP)采用硫酸鄄高氯酸消煮,钼蓝比色法测定;总氮
采用凯氏定氮法测定[33] .生物土壤结皮下铜尾矿土
壤基本理化性质见表 1[23] .
尾矿总重金属(As、Cd、Cu、Fe、Pb 和 Zn)采用
氢氟酸(40. 0% )、硝酸(68. 0% )和高氯酸(72郾 0% )
三酸消煮;DTPA 法 [5 mmol·L-1二乙烯三胺五乙
酸(DTPA),10 mmol·L-1 CaCl2和 100 mmol·L-1三
乙醇胺(TEA),pH 7. 3] 提取有效态重金属(25 益,
2 h)(尾矿W 颐 水V = 1 g 颐 2 mL),电感耦合等离子
体原子发射光谱法(ICP鄄AES)测定各重金属含量.
1郾 3郾 2 生物土壤结皮中微生物基因组 DNA 的提取
摇 基于十二烷基磺酸钠(SDS)鄄高盐法提取结皮样
品的总 DNA[19,34] .提取的 DNA 沉淀利用 70%乙醇
洗涤,悬浮于 50 滋L TE(10 mmol·L-1三羟甲基氨基
甲烷,1 mmol·L-1 EDTA,pH 8. 0),0. 8%琼脂糖凝
胶电泳检测.
6671 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 25 卷
表 1摇 生物土壤结皮下铜尾矿废弃地基本理化性质
Table 1摇 Physico鄄chemical properties of wastelands under crusts
样品类型
Sample
type
结皮类型
Crust type
含水量
Water content
(% )
烧失量
LOI
(g·kg-1)
总氮
TN
(mg·kg-1)
速效磷
AP
(mg·kg-1)
pH
YA 藻结皮 Algal crust 3. 71依0. 67a 5. 56依3. 94a 7. 55依2. 38a 0. 75依0. 56b 8. 44依0. 21c
YM 藓结皮 Moss crust 3. 37依0. 42a 5. 51依3. 71a 8. 43依1. 16a 1. 07依0. 75b 8. 38依0. 18bc
YZ 藻鄄藓混合结皮 Algal鄄moss crust 6. 91依1. 75b 10. 15依6. 09a 23. 18依9. 20b 0. 55依0. 51b 8. 29依0. 17bc
YI 藻鄄藓混合结皮 Algal鄄moss crust 8. 82依2. 65b 13. 71依4. 90a 41. 06依24. 26b 0. 82依0. 37b 8. 16依0. 13b
YH 藻鄄藓混合结皮 Algal鄄moss crust 13. 58依2. 58c 13. 37依6. 39a 41. 11依17. 89b 1. 20依0. 46b 8. 16依0. 15b
TI 藻鄄藓混合结皮 Algal鄄moss crust 17. 30依1. 65d 69. 24依10. 73b 184. 93依25. 69c 2. 31依1. 24a 7. 76依0. 17a
YA: 藻结皮 Algal crust; YM: 藓结皮 Moss crust; YZ: 杨山冲尾矿库中华结缕草群落 Z. sinica community in Yangshanchong wasteland; YI: 杨山
冲尾矿库白茅群落 I. cylindrica var. major community in Yangshanchong wasteland; YH:杨山冲尾矿库木贼群落 H. ramosissimum in Yangshanchong
wasteland; TI: 铜官山尾矿库白茅群落 I. cylindrica var. major community in Tongguanshan wasteland. 同列数据后不同小写字母表示差异显著
(P<0. 05) Different letters in the same column meant significant difference at 0. 05 level. 下同 The same below.
1郾 3郾 3 基因组 DNA 的 nifH 基因扩增 摇 利用巢式
PCR对基因组的 nifH 基因片段进行扩增[27] . 第一
轮扩增引物为 FGPH19 和 PolR[35-36],第二轮扩增引
物为 PolF(含 GC夹板:CGCCCGCCGCGCCCCGCGC鄄
CCGGCCCGCCGCCCCCGCCCC)和 AQER[36] . 50 滋L
扩增体系包括:2 滋L 基因组 DNA 的 1 颐 50 稀释液
(50 ~ 100 ng ), 5 滋L 10 伊 PCR 缓 冲 液 ( 100
mmol·L-1 Tris鄄HCl, pH 9; 500 mmol·L-1 KCl),
1郾 5 mmol·L-1 MgCl2,上下游引物 0. 5 mmol·L-1,
200 mmol·L-1 dNTPs和 2. 5 U 的 Taq DNA 聚合酶
(Transgen).取 2 滋L一轮扩增产物作为二轮扩增的
模板.扩增条件为:94 益预变性 3 min,30 个循环为
94 益变性 1 min,55 益(一轮扩增)和 48 益(二轮扩
增)分别退火 1 min,72 益延伸 2 min最后 72 益延伸
5 min.同时设置阴性对照(无 DNA). PCR 反应的产
物用 1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测. 各样品的 PCR 产
物多管合并后用于后续 DGGE分析,以减少 PCR过
程的偏好性对 nifH基因多样性的影响.
1郾 3郾 4 结皮 nifH基因的 DGGE 分析摇 制备 8% (W /
V)的聚丙烯酰胺凝胶(37. 5 颐 1)(Amresco),变性剂
梯度为 40% ~65% (100%的变性剂含有 7 mol·L-1
的尿素和体积分数为 40%的去离子甲酰) (Amres鄄
co).以 1伊TAE 作为缓冲液,经检测的合并 PCR 产
物上样 30 滋L 进行 DGGE 分离. 60 益100 V 电压电
泳 16 h ( Bio鄄Rad). 聚丙烯酰胺凝胶采用 SYBR
Green I 于室温染色 20 min,凝胶成像系统观察拍
照.对于显著条带进行切带处理,DNA 溶于 30 mL
TE(10 mmol·L-1 Tris,1 mmol·L-1 EDTA, pH 8. 0)
缓冲液 24 h.以溶解的 DNA 产物(5 mL)作为模板,
PolF和 AQER为引物,对 nifH 基因片段进行扩增,
通过进一步的 DGGE分析确定片段的纯度和位置.
1郾 3郾 5 克隆、测序和 nifH 基因的系统发育分析 摇 利
用试剂盒将 PCR的纯化产物连接到 PEASY T1 克隆
载体(Transgen),连接产物转化到大肠杆菌(Esche鄄
richia coli).转化细胞接种于含氨苄青霉素的 LB 平
板,37 益12 h 培养后,挑取白色单克隆,以 PolF 和
AQER为引物扩增,选取 PCR 产物检验为阳性的克
隆进行测序 ( Sangon). 测序结果于 NCBI 上进行
Blast比对分析,获取相似性最高序列以及相似性最
高的可培养近缘种. 利用 Mega 4. 0 中的邻接法
(neighbor鄄joining)建立固氮微生物 nifH 基因的系统
发育树.
1郾 4摇 数据处理
采用 SPSS 16. 0 软件进行方差分析(ANOVA).
利用凝胶成像系统(Tanon)分析 DGGE 指纹图谱,
并根据条带的有无和强度计算各样品 nifH 基因片
段的 Shannon多样性指数[37] .利用 CANOCO 4. 5 进
行典型对应分析(CCA),探讨结皮中固氮微生物多
样性(DGGE指纹图谱)与非生物环境因子(包括土
壤水分含量、烧失量、总氮、速效磷、pH 以及总量和
有效态重金属)之间的相关性,Monte Carlo检测中 P
<0. 05 表明影响显著. 基于尾矿生物土壤结皮中
nifH基因片段的多样性,利用 MVSP V 3. 1 软件采
用非加权组平均法(UPGMA)对结皮样品进行聚类
分析.
DGGE图谱得到的 17 条 nifH 基因序列提交
Genbank 数据库,得到的序列号为 GU236911 ~
GU236927.
2摇 结果与分析
2郾 1摇 铜尾矿废弃地植物群落特征和基质理化性质
杨山冲铜尾矿废弃地主要植物群落包括藻结
皮、黄色真藓结皮、白茅群落、中华结缕草群落和木
76716 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 詹摇 婧等: 铜尾矿废弃地生物土壤结皮固氮微生物多样性摇 摇 摇 摇 摇 摇
表 2摇 植物群落基本特征
Table 2摇 Basic characteristics of vegetation investigated
样品类型
Sample
tyepe
植被盖度
Vegetation cover
(% )
植被高度
Vegetation height
(cm)
YA 5 ~ 10 0. 1 ~ 0. 2
YM 10 ~ 20 0. 2 ~ 1. 0
YZ 10 ~ 30 3 ~ 7
YI 60 ~ 90 40 ~ 80
YH 20 ~ 30 18 ~ 45
TI 80 ~ 90 70 ~ 110
贼群落.维管植物群落下废弃地表层形成明显的藻鄄
藓混合结皮.从表 2 可以看出,藻结皮(YA)和藓结
皮(YM)的高度和盖度显著低于微管植物群落. 与
弃置 19 年的杨山冲尾矿废弃地相比,弃置 30 年的
铜官山尾矿废弃地微管植物(白茅)群落具有高的
植被高度和盖度.杨山冲废弃地藻结皮(YA)和藓结
皮(YM)下铜尾矿的土壤含水量和总氮显著低于微
管植物群落下的藻鄄藓混合结皮(YZ、YI、YH和 TI),
微管植物群落的发育促进了废弃地土壤养分(N)和
有机质(C)的积累(表 1). 与杨山冲铜尾矿废弃地
维管植物群落下的藻鄄藓混合结皮(YZ、YI 和 YH)
相比,铜官山废弃地藻鄄藓混合结皮下的铜尾矿土壤
表现出高的含水量、有机质、总氮以及速效磷,这与
铜官山废弃地长的恢复时间、高的植被高度和盖度
相一致(表 1 和表 2).
摇 摇 对生物土壤结皮下铜尾矿中重金属的分析表
明,Fe、Cu 和 Zn 含量最高,分别为 57. 8 ~ 102郾 1
g·kg-1、564. 9 ~ 1736郾 4 mg·kg-1和 238. 1 ~ 320. 8
mg·kg-1 (表 3). DTPA 提取态 Cu 含量最高,为
12郾 67 ~ 58. 73 mg·kg-1,其次为 Zn(6. 56 ~ 19. 62
mg·kg-1)和 Fe(8. 26 ~ 17郾 47 mg·kg-1),As 和 Cd
含量较低.杨山冲废弃地 Cu 和 Zn 总量及有效态含
量高于铜官山废弃地(除尾矿裸地的总 Zn 含量低
于铜官山).
图 1摇 生物土壤结皮中 nifH基因的 DGGE指纹图谱
Fig. 1摇 DGGE profiles of nifH genes in biological soil crusts.
YA: 藻结皮 Algal crust; YM: 藓结皮 Moss crust; YI: 杨山冲尾矿库
白 茅 群 落 I. cylindrica var. major community in Yang鄄
shanchong wasteland; YZ: 杨山冲尾矿库中华结缕草群落 Z. sinica
community in Yangshanchong wasteland; YH: 杨山冲尾矿库木贼群落
H. ramosissimum in Yangshanchong wasteland; TI: 铜官山尾矿库白茅
群落 I. cylindrica var. major community in Tongguanshan wasteland.
a ~ q: 切胶测序条带 The bands excised. 下同 The same below.
2郾 2摇 DGGE指纹图谱和 nifH 基因多样性分析
铜尾矿废弃地生物结皮中 nifH 基因的 DGGE
指纹图谱见图 1. 不同类型生物土壤结皮表现出不
同的条带分布.裸地藻结皮(YA)和中华结缕草群落
下的藻鄄藓混合结皮(YZ)的 nifH 基因条带(13 条)
最多.各结皮中 nifH 基因的 Shannon 多样性指数见
图 2. 杨山冲废弃地 3 种类型生物结皮中,藓结皮
(YM)的 nifH 基因多样性最低;4 种维管植物群落
下的藻鄄藓混合结皮中,以植被高度和盖度最低的中
华结缕草群落(YZ)下的生物结皮 nifH 基因多样性
最高.铜官山尾矿库具有高的植被高度和盖度的白
茅群落(TI)下的生物结皮 nifH基因多样性最低(表
2 和图 2).
2郾 3摇 DGGE指纹图谱的典型对应分析(CCA)和聚
类分析
CCA分析表明,铜尾矿的土壤含水量、有机质、
总氮、总磷、pH以及重金属对尾矿生物结皮中nifH
表 3摇 生物土壤结皮下铜尾矿废弃地重金属总量和有效态含量
Table 3摇 Concentration of total and available heavy metals in wastelands under crusts
样品类型
Sample
tyepe
总重金属
Total heavy metal (mg·kg-1)
As Cd Cu Fe Pb Zn
DTPA鄄提取态重金属
DTPA鄄extractable heavy metal (mg·kg-1)
As Cd Cu Fe Pb Zn
YA 195. 44 2. 67 1728. 23 60884 17. 35 238. 09 0. 02 0. 02 40. 54 11. 49 1. 56 14. 70
YM 220. 44 3. 23 1736. 43 65356 21. 78 285. 78 0. 03 0. 05 49. 40 8. 26 1. 22 17. 42
YZ 155. 96 2. 90 768. 76 61933 24. 01 317. 49 0. 04 0. 08 22. 83 9. 00 1. 22 18. 79
YI 221. 54 3. 49 857. 64 59030 32. 16 320. 77 0. 05 0. 08 32. 11 10. 79 1. 43 17. 72
YH 167. 38 3. 18 1031. 68 57750 36. 05 300. 59 0. 04 0. 10 58. 73 17. 99 1. 42 19. 62
TI 128. 69 1. 64 564. 85 102079 87. 38 259. 70 0. 04 0. 02 12. 67 17. 47 1. 93 6. 56
8671 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 25 卷
图 2摇 生物土壤结皮中 nifH基因的 Shannon多样性指数
Fig. 2摇 Shannon index of nifH genes in biological soil crusts.
图 3摇 生物土壤结皮的聚类分析(UPGMA)
Fig. 3摇 Cluster analysis of crusts (UPGMA).
基因多样性的影响均不显著(P>0. 05).基于生物土
壤结皮中固氮微生物的群落结构,不同植物群落下
结皮样品的聚类分析见图 3.藓结皮(YM)与其他类
型生物结皮,包括裸地表面的藻结皮(YA)以及维管
植物群落下的藻鄄藓混合结皮(YI、YH、YZ 和 TI)表
现出最大的差异性.此外,铜官山尾矿库维管植物群
落下的藻鄄藓混合结皮(TI)与杨山冲尾矿库植物群
落下的藻鄄藓混合结皮(YI、YH 和 YZ)的固氮微生
物群落呈现低的相似性,可能与两尾矿库不同的恢
复时间和成土母质有关.
2郾 4摇 系统发育分析
DGGE图谱中 nifH基因片段(336 bp)的测序、比
对分析表明(表 4),铜尾矿生物土壤结皮中固氮微生
物的近缘种多为未培养细菌和蓝藻(Cyanobacteria),
然而大多数基因序列(82. 4%)与 Genbank 中这些未
培养微生物却表现出低的相似性(<90%).这些基因
序列可能代表了某些新的固氮微生物类群.
基于 DGGE 图谱中 nifH 基因序列在 Genbank
中的近缘种以及具最高相似度的可培养近缘种,构
建铜尾矿废弃生物土壤结皮中固氮微生物的系统发
育树(图 4).铜尾矿生物土壤结皮中大多数 nifH 基
因序列(94. 1% )属于蓝藻,仅一条 nifH 基因序列属
茁鄄变形菌(Proteobacteria) .其中,属于蓝藻门的条带
c、j、k、l、m、o 和 p 存在于所有结皮样品中(图 1).
nifH基因片段属于 茁鄄变形菌门的条带 q 仅明显存
在于木贼群落下的藻鄄藓混合结皮(YH)中(图 1).
从尾矿生物土壤结皮 nifH 基因片段与基因库
已知类群微生物的比对(表 4)和系统发育分析(图
4 )可以看出,在蓝藻序列中,13条序列(条带a ~ c,
表 4摇 DGGE图谱中 nifH基因序列的比对分析
Table 4摇 Identification by NCBI BlastN of nifH gene sequences retrieved from DGGE bands
条带
Band
登录号
Accession
number
不可培养近缘种
(序列号)
Uncultured closest
match (Accession no. )
相似度
Identity
(% )
可培养近缘种 (序列号)
Cultured closest match (Accession no. )
相似度
Identity
(% )
a GU236912 DQ142865 89 丝状嗜热蓝藻 Filamentous thermophilic cyanobacterium DQ471425 86
b GU236913 DQ142865 89 瘦鞘丝藻 Leptolyngbya sp. AY768415 87
c GU236914 DQ142865 88 丝状嗜热蓝藻 Filamentous thermophilic cyanobacterium DQ471425 86
d GU236915 AJ716380 96 蓝丝藻 Cyanothece sp. CP001344 86
e GU236916 DQ520379 88 瘦鞘丝藻 Leptolyngbya sp. AY768415 87
f GU236917 AY601046 86 蓝丝藻 Cyanothece sp. CP001344 83
g GU236918 EF988376 91 鱼腥藻 Anabaena variabilis CP000117 82
h GU236919 DQ520379 88 瘦鞘丝藻 Leptolyngbya sp. AY768415 87
i GU236920 AJ716380 87 丝状嗜热蓝藻 Filamentous thermophilic cyanobacterium DQ471425 86
j GU236921 DQ520379 88 丝状嗜热蓝藻 Filamentous thermophilic cyanobacterium DQ471425 87
k GU236922 DQ520379 88 丝状嗜热蓝藻 Filamentous thermophilic cyanobacterium DQ471425 87
l GU236923 DQ142865 89 瘦鞘丝藻 Leptolyngbya sp. AY768415 87
m GU236924 DQ520379 88 丝状嗜热蓝藻 Filamentous thermophilic cyanobacterium DQ471425 86
n GU236925 DQ520379 88 丝状嗜热蓝藻 Filamentous thermophilic cyanobacterium DQ471425 86
o GU236926 DQ520379 88 丝状嗜热蓝藻 Filamentous thermophilic cyanobacterium DQ471425 86
p GU236911 DQ142865 88 丝状嗜热蓝藻 Filamentous thermophilic cyanobacterium DQ471425 86
q GU236927 DQ982853 95 茁鄄变形菌 Beta proteobacterium EF626686 94
96716 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 詹摇 婧等: 铜尾矿废弃地生物土壤结皮固氮微生物多样性摇 摇 摇 摇 摇 摇
图 4摇 生物土壤结皮中 nifH基因的系统发育树
Fig. 4 摇 Neighbour鄄joining tree depicting the polygenetic rela鄄
tionships among the nifH genes.
Bootstrap值重复 5000 次,>50 的在图中标出 Bootstrap values were
based on 5000 runs and were shown above 50;括号中为登录号 Value in
the bracket was the accession no.
e, h ~ p)为丝状蓝藻,与瘦鞘丝藻属(Leptolyngbya)
的 nifH 基因片段表现出相对较高的相似性,2 条序
列(条带 d和 f)和 1 条序列(条带 g)分别属于蓝丝
菌属(Cyanothece)和鱼腥藻属(Anabaena). 然而,本
研究中的 nifH 基因片段与已知类群的蓝藻还存在
较远的遗传距离.
3摇 讨摇 摇 论
本研究利用 PCR鄄DGGE 技术对铜尾矿废弃地
生物土壤结皮中 nifH基因的多样性进行探讨.结果
表明,铜尾矿废弃地表面的藻结皮、藓结皮及藻鄄藓
混合结皮中主要固氮类群为蓝藻,而异养固氮微生
物较少.铜尾矿废弃地土壤有机质含量低、养分贫
瘠,固氮蓝藻能够适应其干旱和盐碱环境,实现碳和
氮的固定和利用,从而提高自身以及环境中有机质
和氮的含量[18,20-21] .
从废弃地生物土壤结皮中 nifH 基因序列的分
析可以看出,除条带 d 和 f 与单细胞蓝丝藻属具有
高的同源性以外,其他固氮蓝藻均属于丝状蓝藻
(表 4).所得蓝藻片段与其他环境中的丝状蓝藻表
现出较远的系统发育距离,可能代表了适应尾矿废
弃地这种特殊基质的自养固氮微生物类群. 本研究
中的近缘蓝藻包括鱼腥藻属和瘦鞘丝藻属,其中与
无异形胞的瘦鞘丝藻具有高相似性的蓝藻(条带 b、
e、h和 l)是废弃地生物土壤结皮主要固氮微生物类
型(表 4).刘梅等[23]以蓝藻引物对铜尾矿结皮中的
蓝藻群落分析也表明,无异形胞的微鞘藻属(Micro鄄
coleus)和瘦鞘丝藻属是铜尾矿生物土壤结皮中的主
要蓝藻类型. 然而,科罗拉多高原的生物土壤结皮
nifH基因的分析表明,结皮中的固氮微生物主要为
念珠藻(Nostoc)等含异形胞蓝藻[12] . 沙漠等干旱环
境也发现有大量的含异形胞蓝藻,包括鱼腥藻属、念
珠藻属、伪枝藻属(Scytonema)和眉藻属(Calothrix)
等[14] .而念珠藻是贫瘠、干旱和半干旱环境中广泛
存在的固氮类群[12,14] .但本研究中并未检测到念珠
藻. Zhao等[2]认为,只有当苔藓发育到一定的植被
盖度时,固氮念珠藻才参与形成生物结皮.早期的生
物土壤结皮以微鞘藻属为主[12],而念珠藻等类型蓝
藻倾向于出现在结皮发育后期[22] .铜尾矿生物土壤
结皮的培养分析表明,维管植物群落下的结皮中有
念珠藻属蓝藻的存在[23],但其固氮性能有待进一步
研究.此外,Kidron 等[38]认为,伪枝藻属、念珠藻等
含异形胞蓝藻通常出现在湿润的环境中. 铜尾矿废
弃地不稳定的演替阶段和干旱条件可能导致其不利
于含异形胞的固氮蓝藻的生存和繁殖.
除固氮蓝藻外,废弃地生物结皮中固氮微生物
还包括变形菌(条带 q).变形菌是高原、沙漠等生态
系统生物土壤结皮的重要组成[5,12,24] . Zhan 和
Sun[19]研究发现,变形菌和蓝藻是杨山冲和铜官山
尾矿废弃地的主要固氮微生物类群,但其不同于生
物土壤结皮,废弃地以变形菌而非蓝藻占大多数.
对不同类型生物土壤结皮的比较可以看出,与
藻结皮和藻鄄藓混合结皮相比,藓结皮的固氮蓝藻多
样性最低(图 2),这可能与藓结皮低的水分和养分
含量以及苔藓分泌物的影响有关. Zhao 等[2]认为,
以蓝藻为主的生物土壤结皮潜在的氮输入显著高于
以苔藓为主的结皮.在尾矿废弃地生态恢复过程中,
随着苔藓盖度的增加,废弃地表面蓝藻的盖度和多
样性降低.
在本研究中,相对于杨山冲尾矿库维管植物白
茅、木贼和中华结缕草群落下的铜尾矿,铜官山尾矿
库白茅群落下的铜尾矿具有高的养分含量和接近中
性的 pH环境,能够为结皮中的固氮微生物提供更
好的生存条件.然而,铜官山生物土壤结皮表现出更
低的固氮微生物多样性(图 2).研究表明,结皮中蓝
藻的多样性受到基质 pH、颗粒组成、有机质和速效
氮含量等影响[4,15],但本研究尾矿土壤的 pH、水分、
0771 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 25 卷
有机质和养分含量(N 和 P)、有效态和总重金属浓
度对固氮微生物多样性的影响并不显著,这与 Bhat鄄
nagar等[14]对塔尔沙漠的研究结果相一致. 尾矿废
弃地不同于沙漠的原因是其高的重金属含量. 有研
究认为,非共生固氮微生物对重金属较为敏
感[16-17,39] .相对于其他研究区域,铜尾矿废弃地重
金属 Cu、Zn和 Fe含量较高可能对固氮微生物的多
样性产生影响[16] .本研究中重金属对结皮固氮微生
物的影响不显著,可能与铜尾矿生物土壤结皮中固
氮蓝藻对长期的重金属环境形成的强耐受性有关.
采样选择在雨水充沛的季节,尾矿蓝藻处于较好的
生长和代谢状态,这在一定程度上可能减轻土壤重
金属对固氮蓝藻的不利影响.此外,尽管铜尾矿废弃
地土壤总重金属含量较高,其生物有效部分可能不
足以对微生物的固氮作用产生抑制[40] .
铜尾矿废弃地生物土壤结皮中主要固氮微生物
为蓝藻,植物群落发育引起植被高度和盖度的变化
会改变废弃地表面的光照、温度和水分,从而影响结
皮中蓝藻的发育和繁殖. 铜官山尾矿废弃地低的固
氮蓝藻多样性很可能与白茅群落高的植被高度和盖
度有关. Evans等[41]认为,干旱生态系统植物群落的
改变会引起林荫盖度增加,凋落物质量下降以及数
量提高,从而对生物土壤结皮中的蓝藻产生不利影
响. Billings等[11]认为,维管植物群落的改变能够通
过改变土壤有机碳的形态和有效性而影响固氮微生
物.而 Nagy等[5]研究表明,生物土壤结皮中原核生
物的多样性不受植物冠层的影响. 杨山冲尾矿废弃
地表层以砂质为主,不利于水分和温度的保持,但其
表面形成的藻结皮较黄色真藓结皮和维管植物群落
下的藻鄄藓混合结皮具有高的固氮蓝藻多样性.尽管
尾矿裸地养分贫瘠,但其栖息地环境的不稳定性和
多样性为固氮蓝藻提供了更多的微环境. Bhatnagar
等[14]认为,与非砂质的植被覆盖土壤相比,砂质或
裸露的土壤固氮蓝藻群落组成更为丰富.
4摇 结摇 摇 论
铜尾矿废弃地表面生物土壤结皮中的固氮微生
物包括蓝藻和 茁鄄变形菌,并以蓝藻为主. 3 种类型生
物结皮中,裸地表面的藻结皮的固氮微生物多样性
最高,其次为维管植物群落下的藻鄄藓混合结皮,苔
藓结皮的固氮蓝藻多样性最低. 铜尾矿废弃地自然
生态恢复过程中维管植物群落的发育通过改变废弃
地表面的光照、水分等条件影响生物土壤结皮中固
氮微生物的多样性. 铜尾矿废弃地养分和重金属含
量对生物结皮中固氮微生物群落的影响并不显著.
这些新的固氮类群对废弃地环境的良好适应性有待
于进一步研究.
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作者简介摇 詹摇 婧,女,1986 年生,博士研究生.主要从事恢
复生态学研究. E鄄mail: zhanjmyx@ sina. com
责任编辑摇 肖摇 红
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