全 文 ：厚荚相思树根瘤菌HJ06菌株的
16SrDNA全序列和nifA基因片段分析
吕成群 a,黄宝灵 a,庄培亮 a,武 波 b
(广西大学,a.林学院;b.生命科学与技术学院,南宁530005)
摘要:对厚荚相思(Acaciacrassicarpa)根瘤菌HJ06菌株的16SrDNA全序列和nifA基因片段进行了测定。结果表明，
HJ06菌株在以16SrDNA序列构建的系统发育树状图中位于根瘤菌属（ Rhizobium）分支中，与根瘤菌属各个种的相似
性达 95%以上；从 HJ06菌株克隆出的 585bpnifA基因片段与 Klebsielapneumoniae的同源性达到 99.3%，与
Klebsielaoxytoca的NifF,NifL,NifA,NifB蛋白基因的同源性为97.8%。
关键词:厚荚相思；根瘤菌；16SrDNA全序列；系统发育；nifA基因
中图分类号：Q523.8 文献标识码：A 文章编号：1005-3395(2006)01-0019-06
16SrDNAandnifAGeneSequenceAnalysisofRhizobium
StrainHJ06IsolatedfromAcaciacrassicarpa
LüCheng-quna,HUANGBao-linga,ZHUANGPei-lianga,WUBob
(a.ForestryColege,GuangxiUniversity;b.ColegeofLifeScienceandTechnology,GuangxiUniversity,Nanning530005,China)
Abstract：Thedeterminationofful-length16SrDNAsequenceandnifAgenesegmentsofrootnodulebacterium
strainHJ06isolatedfromAcaciacrassicarpashowedthatstrainHJ06hadabove95%similaritywiththegenus
Rhizobium.ThenifAgenesegmentsofHJ06have99.3%isogenesiswithnifAgenesofKlebsielapneumoniaeand
97.8%isogenesiswithgenesofNifF,NifL,NifAandNifBproteinsofK.oxytoca.
Keywords：Acaciacrassicarpa;Rhizobium;16SrDNAsequencing;Phylogeneticanalysis;nifAgene
相思树是热带亚热带豆科树种，除台湾相思
外，其余大多从澳大利亚、马来西亚等地引入我国。
相思树种生长快、产量高，有根瘤、具固氮作用，可
改良土壤，木材用途广，在我国热带、南亚热带地区
越来越受到重视[1]，目前已逐渐发展成为华南地区
短周期工业用材林的当家树种之一[2]。因此，有必要
开展对相思树种根瘤菌的生物学特性研究。过去对
根瘤菌的研究大多集中在与农业关系密切的豆科
作物、牧草的共生体上，对大量的豆科树种根瘤菌
的研究相对较少 [3]。而有关厚荚相思根瘤菌的16S
rDNA全序列测定和分析、nifA基因的研究目前尚
未见有报道。本文在前期研究工作的基础上，对该
树种根瘤菌的代表菌株HJ06的16SrDNA全序列
和nifA基因进行分析，以探讨厚荚相思根瘤菌的系
统发育学地位及nifA基因的同源性。
1材料和方法
1.1菌株
供试的根瘤菌菌株 HJ06分离自厚荚相思
（ AcaciacrassicarpaA.cunn.exBenth）根瘤，基因克
隆中的大肠杆菌菌株为 JM109，质粒载体为
pGEM-3Zf。
收稿日期：2005-06-14 接受日期：2005-12-01
基金项目：广西科学基金项目(桂科基0448005)；广西“ 十五”林业科学研究项目(林科字2002第19号)资助
热带亚热带植物学报 2006，14(1)：19-24
JournalofTropicalandSubtropicalBotany
1.2根瘤菌DNA提取
参照Wen﹠Tsong的快速提取法[4]提取根瘤菌
DNA。菌株用YMA液体培养基在28℃振荡培养至
对数生长期，10000×g离心收集菌体,用 1×TE
（ 10mmol/LTris-HCl,pH 7.6；1mmol/LEDTA,
pH8.0）缓冲液洗涤 2次，用裂解液（ 40mmol/L
Tris-HCl，20mmol/LNaAc，1mmol/LEDTA，1%
SDS）破壁，再用5mmol/LNaCl沉淀，上清液用等
体积的苯酚、苯酚/氯仿 /异戊醇（ 25：24：1）、氯仿
各抽提 1次。2倍体积无水乙醇、0.1倍体积
3mmol/LKAc沉淀，真空干燥，最后溶于 1×TE缓
冲液中。
1.316SrDNA的扩增
引物分为正向引物 F27（ 5-AGAGTTTGAT-
CATGGCTCAG-3）和反向引物 R1492（ 5-TACG-
GTTACCTTGTTACGACTT-3）。
PCR扩增总体积100μl，其中：10×PCRBufer
10μl,2.5mmol/LdNTP8μl,10μmol/L引物 F27
5μl,10μmol/L引物R14925μl,模板DNA100ng,
5UTaq酶1μl,ddH2O补至总体积100μl。
反应条件：95℃预变性5min，再以 96℃变性
30s、55℃退火45s、72℃延伸1.5min，30个循环，7
2℃延伸10min。
1.4nifA基因的扩增
PCR扩增nifA基因的正向引物P1：5-ACGG-
TGCTGGTACGCGGC-3，反向引物 P2：5-TTCG-
CGCACGTTTCCCGG-3。
PCR扩增总体积25μl，其中：10×Bufer2.5μl,
2.5mmol/LdNTP2.0μl,10pmol/L引物P11.25μl,
10pmol/L引物 P21.25μl,模板 DNA100ng,5U
Taq酶0.2μl,ddH2O补至总体积25μl。
反应条件：94℃预变性 6min，再以 94℃变性
1min、58℃退火 50s、72℃延伸 1min，35个循环，
72℃延伸6min。
1.5DNA克隆及测序
电泳回收PCR产物，回收的DNA片段与载体
连接，用电脉冲法转化大肠杆菌 JM109，在加有
X-gal、Amp和IPTG的LA抗性选择培养基平板上
选择白色转化子。挑取白色转化子，接种在加有
Amp(50μgml-1)的10mlLB液体培养基中，置于
37℃摇床培养过夜。然后重新提取质粒，验证白色
转化子是否含有PCR扩增产物。提取质粒DNA送
上海基康生物公司测序。
1.616SrDNA序列分析
将所测定的HJ06菌株的16SrDNA全序列输
入生物技术信息网页 htp:/www.ncbi.nlm.nib.gov/
进行序列分析及同源性比较，用 ClustalX和
Treecovnw软件绘制系统发育树状图。序列相似性
所用参比菌株及相应的索取号来自GenBank。
1.7nifA基因序列分析
将所测定的HJ06菌株的nifA基因序列输入生
物技术信息网页 htp:/www.ncbi.nlm.nib.gov/进行
序列分析及同源性比较，序列相似性所用参
比菌株来自 GenBank，索取号分别为：Klebsiela
pneumoniae（ X13303）、K.pneumoniae（ X02616）、K.
oxytoca(D00339)。
2结果和分析
2.116SrDNAPCR扩增及序列测定结果
菌株 HJ06PCR扩增所得 1.5kb左右的 16S
rDNA片段电泳检测结果见图 1，测定的全序列
图116SrDNA扩增、连接及EcoRⅠ酶切结果
Fig.1Theresultof16SrDNAPCR,linkandEcoRⅠenzymedigestion
M.1kbMarkers;1.16SrDNA扩增片段 16SrDNAPCR
segment;2.重组质粒Recombinantplasmid;3.重组体质粒/EcoRⅠ
Recombinantplasmid/EcoRⅠ.
20 热带亚热带植物学报 第14卷
（1445bp）结果见图2。
2.2HJ06菌株16SrDNA全序列的相似性和系统
发育
通过系统发育学分析得出各菌株间相似性及
系统发育树状图（ 图3）。从图3中可以看出在系统
发育树中土壤杆菌属（ Agrobacterium）与根瘤菌属
（ Rhizobium）的不同种在系统发育上互有交叉。
已知的根瘤菌属、种隶属于 α变形杆菌纲
（ Alphaproteobacteria）的 6个属中，包括：根瘤菌属
（ Rhizobium），中华根瘤菌属（ Sinorhizobium），中慢生
根 瘤 菌 属（ Mesorhizobium），慢 生 根 瘤 菌 属
（ Bradyrhizobium），固氮根瘤菌属（ Azorhizobium）和
另类根瘤菌属（ Allorhizobium）[5]。本研究得出的系统
发育图基本与这一分类结果相符合，可以将根瘤菌
及土壤杆菌分成七个分支。菌株HJ06位于土壤杆
菌属与根瘤菌属交叉的这一分支中，并与 R.
genosp.、R. tropici和Agrobacteriumrhizogenes构成
一个小分支。HJ06与Agrobacterium、Rhizobium属
各种的相似性分别为98.72% (Rhizobiumgenosp.)、
98.32%(R. tropici)、97.78%（ A. rhizogenes）、96.82%
（ R. leguminosarum）、96.56%（ R. etli）、95.57%（ R.
gallicum）、95.42%（ R. mongolense）、95.33%（ R.
图2 HJ0616SrDNA全序列
Fig.2 Full-length16SrDNAsequenceofstrainHJ06
第1期 吕成群等：厚荚相思树根瘤菌HJ06菌株的16SrDNA全序列和nifA基因片段分析 21
图3根瘤菌系统发育树状图
Fig.3Dendrogramofrhizobialphylogeny
22 热带亚热带植物学报 第14卷
yanglingense）、95.05%（ R.indigoferae）、95.22%（ R.
hainanense）、94.78%（ A.albertimagni）、93.52%（ A.
rubi）、92.35%（ R.undicola）、93.14%（ A.vitis）、
94.14% （ R. huautlense）、 95.92% （ R.
giardini）。
以16SrDNA序列的相似性为划分属的标准，
属内相似性不低于95%[6]，因此可以确定菌株HJ06
为隶属于Rhizobium属的种。
中华根瘤菌属（ Sinorhizobium）的 8个种 S.
medicae、S.meliloti、S.fredi、S.terangae、S.
saheli、S.kostiense、S.arboris、S.xinjiangensis构成
一个分支。
Mesorhizobium amorphae、 M.huakui、 M.
mediteraneum、M.ciceri、M.loti、M.chacoense、M.
tianshanense7种构成一个独立分支，形成中慢生根
瘤菌属。
4种慢生根瘤菌构成慢生根瘤菌属(Bradyrhi-
zobium)分支，包括 B.genosp.、B.liaoningense、B.
canariense、B.japonicum。
固氮根瘤菌属(Azorhizobium)的 A.caulinodans
构成一个独立分支。
图4nifA基因的扩增、连接及EcoRⅠ酶切结果
Fig.4TheresultofnifAPCR,linkandEcoRⅠenzymedigestion
M.1kbmarker;1.HJ06DNA扩增片段 HJ06DNAPCR
segment;2.重组质粒Recombinantplasmid;3.重组体质粒/EcoRⅠ
Recombinantplasmid/EcoRⅠ.
图5HJ06菌株nifA基因片段序列
Fig.5SequenceofHJ06nifADNAsegment
第1期 吕成群等：厚荚相思树根瘤菌HJ06菌株的16SrDNA全序列和nifA基因片段分析 23
最近的研究发现了第四个根瘤菌分支
Protebacteria门 α-亚纲 Methylobacterium（ 甲基杆
菌属）系统发育分支，此分支新种Methylobacterium
nodulans能利用甲醇生长，这在根瘤菌中是独一无
二的[7]。
另类根瘤菌属（ Alorhizobium）仅R.undicola一
种 ， 在 系 统 发 育 树 中 处 于 土 壤 杆 菌 属
（ Agrobacterium）与根瘤菌属（ Rhizobium）的交叉分
支中。
2.3HJ06菌株nifA基因片段PCR扩增结果和分析
从 HJ06菌株中扩增出 585bp左右的 nifA基
因PCR产物，电泳结果如图4。nifA基因DNA片
段序列见图5。
用BLAST程序对HJ06的nifA基因片段DNA
序列和 GenBank中已登录的 nifA基因 DNA序列
进行核苷酸同源性比较，结果发现HJ06的nifA基
因片段 DNA序列分别与 Klebsielapneumoniae
（ X13303）、Klebsielapneumoniae（ X02616）的同
源性达到 99.3%；与 Klebsielaoxytoca（ D00339）的
NifF,NifL,NifA,NifB蛋白基因的同源性为97.8%。
nif基因系指在结构和功能上与自生固氮的肺
炎克氏杆菌（ Klebsielapneumoniae）的 20个 nif基
因具有同源性的基因。nifA基因作为固氮基因的正
调节基因，已经从10多种固氮微生物中克隆出来
并完成了序列测定[8]，但厚荚相思根瘤菌的nifA基
因克隆和序列测定尚属首次。
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24 热带亚热带植物学报 第14卷