全 文 ：第 2 9
20 0 1
卷
年
第
月
3 期 西北农林科技大学学报 (自然科学版 )
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2 9
J
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3
2 0 0 1
甘肃棘豆中苦马豆素的分离与鉴定
童德文 , 曹光荣 , 李绍君
(西北农林科技大学 畜牧兽医学院 , 陕西 杨陵 7 1 2 10 0)
〔摘 要 ] 用升华法从甘肃棘豆中分离到一种白色细针状结晶 ,经 T L C 、 M P 、 IR 、 M S 鉴定分析确定为苦马豆
素 ,经计算甘肃棘豆中的提取率为 14 限 / g 。
〔关键词〕 疯草 ;甘肃棘豆 ,苦马豆素 ;升华法
[中图分类号〕 5 5 5 6 . 9 [文献标识码〕 A 〔文章编号〕1 0 0 0 一 2 7 5 2 ( 2 0 0 1 ) 0 3一 0 0 5一 0 4
1 8 7 3 年美国首次报道 T 疯草病 ( l o e o d i s e a s e ) ,
1 90 5 年 M a sr h川试验证实了动物采食兰伯氏棘豆
和密柔毛黄蔑引起中毒 。 在随后的 70 多年里 ,人们
试图分离疯草毒素 ,但只有两项研究相对成功 , 一是
C au hc 从兰伯氏棘豆分离出一种物质 , 他描述这种
物质是一种稳定的多经基含氮有机化合物 ,具有吸
湿性 , 易溶于水而不溶于氯仿 、 乙醚和烃类溶剂 , 在
实验条件下可引起猫的疯草病图 ;二是 rF a sP 阁对密
柔毛黄蔑进行了广泛的化学成分研究 , 并分离出一
种碱性 、 吸湿性强的不纯物质 , 称为 L oc io n , 这种物
质的乙酞化产物及其酒石酸盐 、 柠檬酸盐都可 以引
起疯草病 , 但生物碱试剂检查没有得到肯定结果 。
1 9 7 5 年 H e r t l e y [`〕将灰苦马豆与斑荚黄蔑 、 绢毛棘
豆进行毒性比较试验 ,结果发现动物中毒后 , 不仅临
床症状一致 ,而且病理组织学变化也没有明显差异 ,
都表现出神经细胞和内脏细胞空泡变性 。 而动物灰
苦马豆中毒在形态学和生物化学方面的变化同安哥
斯牛和人类的一种甘露糖贰酶缺乏引起的遗传性溶
酶体贮积病— 甘露糖过多症 ( m a n on s id os i s )十分相似 。 2 9 7 9 年 e o l e g a t e 等 [5〕用甘露糖贰酶作为工
具 , 从灰苦马豆中分离出叫噪兹定生物碱— 苦马豆素 ( s w a i n s o n i n e , s w ) 。 1 9 5 2 年 M o l y n e u x 等 [` 〕以
C ol eg
a et 分离到的 Sw 为标准品从斑英黄茂中分离
出 SW 。 国内 1 9 8 9 年曹光荣等闺首次从黄花棘豆中
分离出 s w , 并测定出它的含量为 。 . 12 m g / g ; 丁伯
良e[] 测定出甘肃棘豆 中也含有 Sw , 但是迄今尚未
从甘肃棘豆中分离到 S W 。 近年来随着研究的深人
进行 , 人们还发现 S W 具有抗癌活性图 。 本研究试图
从甘肃棘豆中分离出 SW , 为进一步研究动物疯草
中毒和 S W 的抗癌作用奠定基础 。
1 材料与方法
1
.
1 材 料
甘肃棘豆 , 1 9 9 6 年 8 月采集于青海省泽库县西
卜沙乡 , 自然干燥后粉碎 , 置阴凉干燥处保存备用 。
SW 标准品 , 由美国农业部西部农业研究中心和 有
毒植物研究所 D a l。 R G a r d n e r 博士 和 R u s s e l l J
M o l y n e u x 博士提供 。
1
.
2 方 法
1
.
2
.
1 甘肃棘豆 中总生物碱的提取 称取甘肃棘
豆粉 5 0 0 9 , 用甲醇浸泡 3 次 ,每次 24 h ,合并甲醇
液 , 70 ℃ 减压浓缩至浸膏 , 1 m ol / L H CI 溶解后过
滤 , 滤液上 73 2 强酸性阳离子交换树脂 , 先用去离子
水洗脱 , 弃去洗脱液 , 后用 1 m ol / L N H 4O H 洗脱 ,
收集洗脱液 , 并挥发至干 , 即得总生物碱 1 29 . 43 9 。
1
.
2
.
2 S W 的分离 将总生物碱用 甲醇反复溶解 ,
过滤 , 挥干滤液后用氨性氯仿溶解 , 回收氯仿 , 残留
物与 6 0 ~ 3 2 5 拜g 硅胶研磨均匀后上硅胶 ( 2 5 0 拜g )
柱 , 氯仿、 甲醇 、 氨水 、 水体积比为 70 : 26 , 2 , 2 混
合溶剂洗脱 ,每 10 m L 收集 1 管 , 共 1 60 管 , 薄层层
析结合抑制 Q 一甘露糖贰酶活性监测 , 合并 同类部
分 ,挥干后在 90 ℃ , 一 0 . 0 94 P a 真空条件下升华 。
1
.
2
.
3 薄层 层析 ( T L C ) 硅 胶 G 湿法 铺 于
2 0 。m x s 。 m 玻璃板 , 活化后点样 , 氯仿 、 甲醇 、 氨
水 、 水体积比为 70 : 26 : 2 : 2 上行法展开 。 自然干
燥 ,先喷乙醉液 ,在加热板上加热约 1 m in 直到闻不
到乙醉味 , 取下薄板再喷 E hr ilc h ,s 液 , 加热到出现
[收稿 日期〕 2 0 0 1一 0 2一 1 9
〔基金项 目〕 国际科学基金资助 ( IF S , N 0 2 9 0 6一 1 ) ;国家自然科学基金资助项 目 ( 3 9 7 7 0 5 7 1 )
〔作者简介〕 童德文 ( 1 9 6 7一 ) , 男 , 安徽太湖人 ,讲师 , 博士 , 主要从事病理学和毒理学的教学和科研工作 。
DOI : 10. 13207 /j . cnki . jnwaf u. 2001. 03. 002
西北农林科技大学学报 ( 自然科学版 )第 29 卷
紫红色斑点为止 , 计算 R f 值 ,并与标准品对照 。
1
.
2
.
4 Q
一甘寡糖武酶活性抑制试验 用蒸馏水将
分析纯的对 一硝基酚配成 4 m m ol / L 的母液 ,再用蒸
馏水配成 1 0 , 2 5 , 5 0 , … … , 2 0 0 0 “ m o l / L 2 7 个梯度
浓度的对一硝基酚标准液 , 4 05 n m 比色 , 制作标准曲
线 。 50 拌L 羊血清 、 50 拌L 反应缓冲液 (0 . 2 m o L / L 乙
酸缓冲液 , p H 4 . 0) 、 50 拌L 收集液和 50 拌L 底物溶
液 (4 m m ol / L 对 一硝基苯基一 。 一D 一甘露糖贰 ) 混匀 ,
37 ℃ 水 浴 4 h , 加 人 1 . 8 m L 终 止 缓 冲 液
( 0
.
2 m o L / L甘氨酸 一氢氧化钠缓冲液 , p H 10 . 0 7 ) ,
每管设对照 ,对照管除底物溶液在终止反应后加外 ,
其他与测定管相同 , 充分混匀后 , 测定光密度 , 结果
查标准曲线 。
1
.
2
.
5 SW 的鉴定 T L C (方法同 1 . 2 . 3) 、 熔点
( M P
, 熔点测定仪测定 ) 、 红外光谱 ( IR , 澳化钾压
片 ) 、质谱 ( M S , 直接进样 , 汽化温度 2 3 0 ℃ , 0 . 9 8 1
m i n 扫描 3 0 次 ) 。
2 结 果
2
.
1 T L C 和 。 一甘露糖贰酶活性抑制试验结果
T L C 检测结果表现为 , E hr ilc h 、 液显色后 ,
25 ~ 43 管 ( 工 ) 的 洗脱液有一紫色斑 点 , fR 值 为
0
·
60
。
6 5一 7 9 管 ( I ) 的洗脱液有一紫红色斑点 ,
fR 值为 0 . 4 , 与标准品的斑点颜色和 fR 值完全一
致 。 106 ~ 12 0 管 ( , ) 的洗脱液有一紫红色斑点 ,
fR 值为 0 . 12 。 a 一甘露糖贰酶活性抑制试验结果表现
为 , 硅胶柱层析洗脱液 I 、 I 部分对 a 一甘露糖贰酶
活性有较强的抑制作用 , 而 皿部分的抑制作用相对
较弱 。 升华 l 部分得到白色细针状结晶 70 m g ,植物
中的提取率为 14 拌g / g 。
.2 2 S w 的鉴定结果
2
.
2
.
1 T L C 和 M P 鉴定 结果 E h r l i e h 、 液显色
后 ,在 R f 值为 0 . 4 处有一紫红色斑点 ,与标准品完
全一致 。 测定的 M P 为 1 4 4 ~ 1 4 5 ’ C 。
2
.
2
.
2 I R 鉴定结 果 IR~ ( K B r 压片 , c m 一 ` ) :
3 4 14
.
7 0
,
3 3 7 6
.
4 1 ( 一 O H 吸 收峰 ) ; 3 0 6 0 . 4 2 ,
2 9 4 2
.
4 0 , 2 8 8 6
.
3 2 ( C H 吸 收 峰 ) ; 2 7 9 7 . 9 5 ~
2 7 2 4
.
5 5 ( oB h lm
a n b a n d ) ; 1 0 7 3
.
78 ( C 一 O 吸收
峰 ) (图 1 ) 。 图 1 中 2 7 9 7 . 9 5~ 2 7 2 4 . 5 5 ( B o h lm a n
b a n d )说明样品中存在着 t r a n s C H一 N 吸收 , 与 S W
的两环结构相符合 , S W 的其他基团 的吸收 , 如经
基 、碳氢 、 碳氧吸收峰在图 1 中均可见到 。
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* * *
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: 2 0: 4 4 2 00 0
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95
一
9 0 一
85
一
80
一
7 5 州
一
州
7 0
一
6 5
一
3 0 0 0 2 0 0 0 1 0 0 0
波数 / c ,们一 ’
T a b le
图 1 甘肃棘豆中分离出的白色细针状结晶的 IR
IR o f e r y s t a l o f w h it e n e e d le s is o la t e d fr o m 0
.
k a ” s u e” 5 15 B u n ge
第 3期 童德文等 : 甘肃棘豆中苦马豆素的分离与鉴定
2
.
2
.
3 MS 鉴定结果 MS (m / e ) : 1 7 3(分子离子
峰 ) ; 1 5 5 (1 7 3一 H ZO ) ; 1 38(1 5 5一 OH ) ; 1 1 6 (1 38一
H ZO一 4H ) ; 9 6 , 8 4 , 7 2 , 4 3 (均为母核裂解峰 ) (图 2 ) 。
质子裂解合理 , 而且 与 M ol y en u x 等 6j[ 和曹光荣
等川报道的质谱图相符 。
经 T L C 、 M P 、 I R 、 M S 鉴定分析 ,确定所分离到
的结晶为 s w 。
` 。 。 〕
。 拐。 司
口 1里6 。 刁
叠“ 。 ) 、 3 … 臀
1 6
1 3 8
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1 5 5
/ 厂
/
1 0 0 1 2 0 1 4 0 1 6 0 1 8 0
质 /荷 t匕 M a s s / C h a rg e
3 讨论与结论
图 2 甘肃棘豆中分离出的白色细针状结晶的 M S
T
a
b l
e 2 M S
o f e r y s t a l o f w h i t e n e e d le s is o la t e d f r o m 0
.
k a n s u e n s i s B u n g e
SW 的抗癌活性奠定了基础 。
e o l e g a t e 等 [ 5〕首次报道分离 s w 的方法是 , 用
热乙酸乙醋索氏提取 24 h ,水溶部分上强酸性阳离
子交换柱 , 收集稀氨水洗脱部分 ,浓缩后的残留物上
药用琼脂糖凝胶 C L 一 6 B ,用氯化钠梯度洗脱 , 产物用
氨性氯仿提取 , 回收溶剂后用氯仿 /乙醚结晶和重结
晶 ,得到白色针状结晶。 在国内 , 曹光荣等川报道的
方法是 ,将植物样品用酸水浸泡 2 次 , 每次 12 h , 酸
滤液过阳离子交换柱 ,倾出树脂 , 用去离子水洗至中
性 , 晾干后用体积分数 10 %氨水调 p H g ~ 1 0 , 然后
上柱 ,先用氯仿后用丙酮洗脱 , 浓缩丙酮洗脱液的总
生物碱 。 总生物碱经硅胶柱层析 , 用氯仿 、 丙酮 、体积
分数 17 % 氨水体积比为 8 2 . 5 : 15 . 5 : 2 洗脱 ,每 5
m L 收集 1 份 , T L C 结合 a 一甘露糖贰酶活性抑制试
验结果 , 合并同类并浓缩 ,分离出苦马豆素单体 。 本
研究用升华法首次从甘肃棘豆中分离得到 SW 纯
品 , 提取率为 14 拌g / g , 并通过 T L C 、 M P 、 IR 、 M S 对
其结构进行了鉴定 , 为进一步研究动物疯草中毒和
关于 Sw 抑制 Q 一甘露糖贰酶活性的作用机制 ,
oD ilr gn 等 l0[ 〕的研究认为 , s w 的阳离子同甘露糖基
的阳离子在构型上的相似性及其对 a 一甘露糖贰酶
的高度亲和性 , 从而抑制了 a 一甘露糖贰酶的活性 ,
结果使大量的低聚糖聚积在溶酶体内 , 导致细胞 、 特
别是神经细胞的空泡变性 , 动物出现一系列神经症
状 。 本研究在监测硅胶柱层析后洗脱液时 ,选用了以
对一硝基苯基一 a 一 D 一甘露糖贰为底物的 a 一甘露糖贰酶
活性抑制试验 ,结果发现 , 氨性氯仿提取物过硅胶柱
分离 , T L C 检测到 I 、 I 、 1 3 个单体成分 , R f值分
别为 0 . 6 0 , 0 . 4 4 和 0 . 1 2 , 其中 I 、 l 部分对 a 一甘露
糖贰酶活性有较强的抑制作用 , 而 皿部分的抑制作
用相对较弱 。 l 部分经过鉴定为 S W ,其余两部分可
能是柱层析分离时有交叉 , 还含有 S W , T L C 检测不
出 , 而 a 一甘露糖贰酶活性检测较为敏感 , 体现出有
抑制作用的缘故 。 至于这两部分的结构有待于进一
步纯化和鉴定 。
〔参考文献〕
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西北农林科技大学学报 (自然科学版 ) 第 92 卷
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s o la t e d f r o m
S w a in s o an
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《西北农林科技大学学报 )}( 自然科学版 )编辑部
2 0 0 1 年 5 月