全 文 ：动物医学进展 ,2010 ,31(7):41-44
Progress in Veterinary Medicine
变异黄芪内生真菌 FEL1A 菌株固体培养条件优化
郭　伟 ,李勤凡＊ ,张美先 ,林　乐 ,荆新堂 ,王建华
(西北农林科技大学动物医学院 , 陕西杨陵 712100)
　　摘　要:对变异黄芪中分离得到的内生真菌 FEL1A 菌株进行了固体优化培养条件的探索 ,在不同温
度 、碳源 、氮源 ,初始 pH 条件下 ,检测 FEL1A 的生长情况。结果表明 ,FEL1A 生长的最适温度为20 ℃,初
始 pH 为 7.0;以燕麦片作为碳源时 FEL1A 生长最快 ,培养 20 d后菌落大小为 13.32 mm ±0.77 mm;蛋白
胨作为氮源时 FEL1A生长最快 ,培养 20 d后菌落增至 18.14 mm±0.64 mm 。
　　关键字:真菌培养;疯草;苦马豆素;固体优化
中图分类号:S859.87;S432.1 文献标识码:A 文章编号:1007-5038(2010)07-0041-04
　　疯草是一类重要有毒植物[ 1] ,由于在全世界范
围内分布广泛 ,给畜牧业造成了巨大的经济损失。
其主要有毒成分是有毒生物碱 ———苦马豆素
(sw ainsonine , SW)[ 2] 。从甘肃棘豆[ 3] , 冰川棘
豆[ 4] ,变异黄芪[ 5] 等疯草中已经成功分离到了 SW 。
现已证明 ,SW可作为免疫调节剂 、肿瘤转移及扩散
　　　收稿日期:2009-12-10　　　基金项目:国家自然科学基金项目(30871901);陕西省科技攻关项目(2008k02-06-2)
　　　作者简介:郭　伟(1984-), 女 ,河南灵宝人 , 硕士研究生 ,主要从事疯草内生菌研究。 ＊通讯作者
1 lo g2 ～ 3 lo g2之间 ,非特异性凝集率有所降低。统
计分析显示 ,B 、C 、D法测得的效价与 A 法差异不显
著 ,说明这 3种方法和国标法符合率高 ,对真实效价
不会产生偏差。但在小样本量检测时 ,为了降低因
非特异性造成的偏差 ,可以选择 B法或者 D法。
在日常检测中可以使用 B 法进行大样本量的
检测 。在进行课题研究等小样本 、高精度要求的检
测时 ,适宜使用 D法以更有效去除非特异性反应。
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Study on Removing the Nonspecific Agglutination
Factor of Duck Serum in IH of AIV
DENG Bo
1 , 2 , LI Kai-hang1 , XU E Xia1 ,SUN Quan-yun1
(1.Shanghai Center for An ima l D isease Con tro l , Shanghai , 201103 , China;2.Shanghai J iao Tong Univer sity , Shanghai , 200240 , China)
Abstract:The nonspecif ic agg lut inat ion react ion of the duck serum and the chicken red blood cell o ften oc-
curred in hemagg lutination inhibition to de tect A IV antibody ti ter in duck serum , thus inf luencing the ac-
curacy of antibody ti ter.To resolve this problem , using 10 mL/ L duck RBC s direct ly to assay and
50 mL/L chicken RBCs to adsorb at first we re both selected and compared.The f irst method dont need to
fo re t reat serum , and have the advantages of simple protocle and short time.Using 10 mL/ L duck RBCs
directly to assay can be applied in large sample examinations.If w e need mo re rigo rous data , using
50 mL/L chicken RBCs to adso rb at first w as more ef fective to remove the nonspecific reaction.
Key words:AI;nonspecific ag glutination facto r;duck strum
DOI :10.16437/j.cnki.1007-5038.2010.07.008
抑制剂 、抗病毒和细胞保护剂等药物使用 ,并且其作
为新的抗癌药物有着极其诱人的开发前景[ 6] 。SW
近年来受到国内外众多学科的广泛关注 ,虽然已经
人工合成了 SW ,但是 SW 人工合成步骤较复杂 ,且
存在同分异构体 ,纯化较为困难 ,产量低 ,生产成本
高 ,以致 SW纯品价格昂贵。近年来 ,人们开始关注
疯草内生菌的研究 ,国内外学者成功地从甘肃棘
豆[ 7-8] 、小花棘豆[ 9] 、茎直黄芪[ 10] 等疯草中分离到了
产SW 的内生真菌[ 11-12] 。与疯草植物来源及人工合
成SW 相比 ,内生真菌合成SW 具有受限条件少 、生
产效率高及成本低廉等潜在优势。
FEL1A 是从变异黄芪新分离的一株产 SW 内
生真菌 ,它除了在菌株分离中使用 PDA 培养基之
外 ,尚未进行培养特性方面的研究 。本试验对这一
菌株进行了固体优化培养条件的探索 ,为液体发酵
培养 ,大量生产 SW 准备条件 。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　试验菌株　FEL1A 菌株是分离自变异黄芪
的内生真菌 ,由西北农林科技大学临床实验室提供 ,
菌株用 PDA 培养基培养 20 d后供接种用。
1.1.2　主要试剂　葡萄糖(CK),蔗糖(AR),燕麦
片(食用品),可溶性淀粉(BR)等。
1.2　方法
1.2.1　培养基的制备　参照文献[ 13] 制备。基础
培养基:硫酸镁 0.5 g , 磷酸二氢钾 1 g , 氯化钾
0.5 g ,硝酸钠2.0 g ,硫酸亚铁 0.01 g ,葡萄糖 20 g ,
琼脂 20 g ,加去离子水 1 000 mL ,溶解 ,高压灭菌后
备用;不同碳源的培养基:将基础培养基中的葡萄糖
分别用 5种碳源(蔗糖 、可溶性淀粉 、乳糖 、燕麦片 、
葡萄糖)代替 ,配制成不同碳源的培养基;不同氮源
的培养基:将基础培养基中的硝酸钠分别用 8 种氮
源(蛋白胨 、酵母粉和豆粉 、硫酸铵 、硝酸钠 、氯化铵 、
牛肉膏 、尿素)代替 ,配制成不同氮源的培养基;不同
初始 pH 的培养基:将基础培养基的原料分装至 6
个三角瓶内 ,分别用1 mol/ L盐酸和1 mo l/L氢氧化
钠调节为 6个初始 pH(5.0 、5.5 、6.0 、6.5 、7.0 、7.
5)的培养基 ,过滤除菌后备用 。
1.2.2　接种方法　PDA 培养基培养的 FEL1A 菌
种用打孔器切成圆饼状的菌饼放置在不同培养基
上 ,每皿放 3个[ 7] ,每种培养基做 3个重复 。
1.2.3　培养条件对菌落生长的影响
1.2.3.1　培养温度对菌落生长的影响　基础培养
基上接种 FEL1A 菌种 ,分别置于 3个温度(20 ℃、
4 ℃、-20 ℃)和室温下培养 20 d ,每个温度做 3个
重复。
1.2.3.2　不同碳源对菌落生长的影响　选择不同
碳源(蔗糖 、可溶性淀粉 、乳糖 、燕麦片 、葡萄糖)的培
养基 ,接种 FEL1A 菌种 ,每种碳源培养基做 3个重
复 ,20 ℃恒温培养 20 d ,测量菌落大小。
1.2.3.3　不同氮源对菌落生长的影响　选择不同
氮源(蛋白胨 、酵母粉和豆粉 、硫酸铵 、硝酸钠 、氯化
铵 、牛肉膏 、尿素)的培养基 ,接种 FEL1A 菌种 ,每
种氮源培养基做 3 个重复 ,20 ℃恒温培养 20 d ,测
量菌落大小 。
1.2.3.4　培养基初始 pH 对菌落生长的影响　选
择不同初 pH 的培养基 ,接种 FEL1A 菌种 , 每个
pH 梯度做 3个皿 ,20 ℃恒温培养 20 d ,测量菌落大
小 。
1.2.4　菌落生长的观察与测量　培养的第 2天起
开始观察菌落形态 ,并每两天用游标卡尺在平皿背
面固定菌落边缘 3个菌丝生长点为基点 ,测量菌落
直径 ,每个菌落测量 3次 ,共 9个菌落 ,计算平均值 、
标准误 ,制作菌落的生长曲线图 。
2　结果
2.1　培养温度对菌落生长的影响
培养 2 d后观察到有菌丝萌发和生长 ,为乳白
色雪花状 ,以后逐渐生长 ,边缘变致密 ,颜色加深变
为灰色。培养 20 d后菌落颜色整体为灰色 ,边缘新
生成菌丝为乳白色 。
测量菌落直径的结果显示 ,随着培养时间增长 ,
菌丝长度逐渐增长 ,培养至 20 d时最长;在 20 ℃和
室温下培养真菌生长较快 , 20 d 时菌落大小为
20.78 mm ±0.21 mm , 室温下为 16.11 mm ±
0.36 mm 。在 4 ℃和-20 ℃条件下培养 ,生长缓慢
(图 1)。
2.2　菌落在不同碳源培养基的生长情况
培养的第 2天起每两天观察菌落形态 ,菌落形
态与不同温度下培养的菌落形态相似 。
测量菌落的直径结果显示 ,所有碳源中以燕麦
片为碳源时菌落生长速度最快培养至 20 d时达到
13.32 mm±0.77 mm ,可溶淀粉为碳源生长最慢 ,
培养至 20 d 时菌落直径为 10.77 mm ±0.91 mm
(图 2)。
从中可以看出变异黄芪内生菌 FEL1A 对碳源
利用比较广泛 ,对单糖 、寡糖 、多糖均能利用 ,在培养
特性上与其他大型真菌具有相似之处 ,这就为疯草
内生菌开发利用提供了基础资料 。
42 动物医学进展　2010 年　第 31 卷　第 7 期(总第 205期)
　　　　图 1　不同温度下菌落的生长曲线　　　　　　　　　　　　　图 2　不同碳源下菌落的生长曲线
Fig.1　Grow th curve of mycelia wi th dif ferent tem perature　　　　　Fig.2　Grow th curve of mycelia wi th dif ferent carbon sou rces
2.3　菌落在不同氮源培养基的生长
不同氮源培养基上接种的 FEL1A菌种 ,在 20 ℃
恒温培养 ,菌落在不同的氮源培养基上形态差异较
大。
蛋白胨:最初土黄色 ,毛毡状 ,背面为黄色 ,菌落
较低 ,厚度不均匀 ,培养后期菌落变为粉末状 。
　　酵母膏:最初近圆形 ,疏松绒毛状 ,正面褐色 ,背
面为橙黄色 ,菌落较高约为 6 mm ～ 7 mm ,厚度均
匀 ,培养后期成红细胞状 。
牛肉膏:最初黄色 , 近半球形 ,毛毡状 ,背面为黄
色 ,菌丛较低 ,厚度不均匀 ,培养后期菌落变为粉末状。
　　豆粉:最初菌落成球状 ,致密边缘整齐 ,黄色后
期变化不大。
氯化铵 、硫酸铵和硝酸钠:最初菌落生长不明
显 ,后期菌落干涸 ,中间黑色边缘乳白色 ,生长缓慢 。
第 2天起每两天测量一次菌落大小 ,从结果可
以看出在蛋白胨培养基上生长最快 ,培养至 20 d时
菌落大小为 18.14 mm±0.64 mm ,牛肉膏培养基和
豆粉培养基上生长较快培养至 20 d时菌落大小分别
为牛肉膏培养基上是 18.21 mm±0.71 mm ,豆粉培
养基上为 16.90 mm ±0.33 mm 。而氯化铵 、硫酸铵
和硝酸钠做为氮源时菌落生长缓慢(图 3)。
图 3　不同氮源培养基上菌落的生长曲线
Fig.3　G row th cu rve of m ycelia w ith dif f erent ni t rogen sources
2.4　培养基起始 pH 对菌落生长的影响
经过初始 pH 不同的培养基的培养 , 20 d 后测
量菌落直径 ,从结果看出菌落在起始 pH 为 7.0的
培养基中生长最快 , 培养 20 d 后菌落大小为
9.92 mm ±0.67 mm(图 4)。
图 4　不同初始 pH 对菌落生长的影响
Fig.4　Effect of dif f erent pH on my celia production
3　讨论
目前研究表明 ,不同疯草内生真菌所需的最适
生长温度不同 ,李彦忠报道[ 14] 近年来发现的一种棘
豆内生真菌在 PDA 培养基上 18 ℃生长最快 ,25 ℃
即停止生长;黄芪中提取的一株内生真菌在 22 ℃生
长最快 , 30 ℃以上即停止生长;时东方等[ 7] 研究发
现棘豆中的一种内生真菌在 20 ℃生长速度最快。
疯草中不同内生真菌对温度适应不同 ,多数属嗜温
真菌。对变异黄芪 FEL1A 菌株培养条件做了研究 ,
本试验选择了内生真菌生长的最佳温度 20 ℃, 实
验室常用冰箱的温度(4 ℃, -20 ℃)和室温 4个温
度 ,以便为 FEL1A内生真菌的培养和冻存提供了依
据 ,从中可以看出 ,变异黄芪 FEL1A 在室温就能很
好的生长 ,20 ℃培养时生长最好 ,属嗜温真菌。
43郭　伟等:变异黄芪内生真菌 FEL1A 菌株固体培养条件优化
据报道大多数真菌都在弱酸下生长较好 ,时东
方等[ 7] 研究发现甘肃棘豆中的一种产苦马豆素内生
真菌在初始 pH 6.5条件下生长最快 ,本试验中不同
初始 pH(5.0 、5.5 、6.0 、6.5 、7.0 、7.5)条件下培养的
结果差异不明显 。时东方等[ 7] 研究发现棘豆中的一
种内生真菌对玉米粉的利用较好 ,本实验中从对碳
源的利用中可以看出 , FEL1A 菌对燕麦片利用比较
好 ,可能由于燕麦片和玉米粉中含有丰富的维生素 ,
氨基酸 ,并且无机元素中 Ca 、P 、Fe、Zn 、Mn 的含量
都比较高 ,有利于内生菌的生长。时东方等研究的
内生菌对酵母膏的利用较好差异明显 , FEL1A 对氮
源的利用的结果表明 ,以蛋白胨做为氮源的培养基
中生长最好 ,酵母膏和豆粉次之 ,可能是棘豆属和黄
芪属内生真菌的种属不同[ 15] ,对营养条件和环境条
件的要求也不一样。另外 ,试验中发现该内生真菌
对尿素 、硫酸铵和硝酸钠等不含氨基酸的氮源不能
很好的利用 ,对蛋白胨 、牛肉膏等含氨基酸的有机氮
可以很好的利用。变异黄芪 FELL1A 固体优化培
养的最适温度为 20 ℃,最佳氮源为蛋白胨 ,最佳碳
源为燕麦片 ,最适合的 pH 为 7.0 ,可为其他疯草内
生菌的固体优化培养以及液体发酵培养提供参考 。
内生真菌的培养方面 ,固体优化培养是一种直观
可靠的研究方法 ,既可以很直观的观测真菌的生长情
况 ,包括菌落的大小 、颜色及菌落的厚度等 ,又可以随
着时间的变化监测菌落生长曲线。同时固体优化培
养也存在不足 ,很难得到大量菌丝体 ,不便于真菌代
谢产物的检测。在试验过程中 ,最好固体培养和液体
发酵培养相结合进行 ,以弥补单个培养方式不足 ,提
供更为全面可靠的实验数据。
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(Co llege o f Veter inary Med icine , Northwest A &F Univer sity ,Yang lin g , Shaanxi , 712100 , China)
Abstract:To mass produce SW by endophy te selected f rom Astragalus variabi l is named FEL1A.The study
explored promot ing endophy tes cul ture condit ions , those are temperature , carbon source , ni t ro gen source
and ini tial pH .The results show ed that the best grow th conditions in the test we re temperature for 20 ℃
and the init ial pH for 7.0.Oatmeal as carbon source of mycelia g row th w as the fastest among dif ferent car-
bon sources in culture medium , coming to 13.32 mm±0.77 mm leng th of mycelia af ter 20 day s.Peptone as
nit rog en source achieved the fastest grow th , achieving 18.14 mm±0.64 mm af ter 20 day s.
Key words:fungal cul ture;locow eed;sw ainsonine;optimization of so lid
44 动物医学进展　2010 年　第 31 卷　第 7 期(总第 205期)