全 文 ：Ｒesearch Paper 研究报告
微生物学报 Acta Microbiologica Sinica
54(5) :572 － 581;4 May 2014
ISSN 0001 － 6209;CN 11 － 1995 /Q
http:/ / journals． im． ac． cn /actamicrocn
doi:10. 13343 / j． cnki． wsxb． 2014. 05. 012
基金项目:农业部“十二五”公益性行业(农业)科研专项(201203062) ;国家自然科学基金(31201958，31072175)
* 通信作者。Tel /Fax:+ 86-29-87092429;E-mail:zhaobaoyu12005@ 163． com
作者简介:周启武(1987 －)，男，云南牟定人，硕士研究生，从事动物中毒病与毒理学研究。E-mail:zhqiwu1987@ 163． com
收稿日期:2013-09-13;修回日期:2013-12-27
小花棘豆和变异黄芪内生真菌显微分布及定量检测
周启武1，于龙凤1，路浩2，曹丹丹2，赵宝玉2*
1临沧师范高等专科学校农学系，云南 临沧 677000
2西北农林科技大学动物医学院，陕西 杨凌 712100
摘要:【目的】了解内蒙古阿拉善和宁夏天然草原的小花棘豆和变异黄芪不同组织中内生真菌 Undifilum
oxytropis的显微分布特点和含量分布规律。【方法】通过石蜡切片结合乳酸酚棉蓝染色法观察，采用实时荧
光定量 PCＲ(ＲT-qPCＲ)进行定量研究，获得各组织(茎、叶、种子和根)中内生真菌分布和含量。【结果】种子
中内生真菌主要定殖于种皮栅栏组织与薄壁组织两层的细胞间隙;叶片组织主要定殖于靠近气孔的表皮细
胞层，茎髓中内生真菌围绕于茎髓质维管束纵轴边缘的薄壁细胞层中;ＲT-qPCＲ的检测限为 0. 029 pg /ng 总
DNA，各采样点相应组织内生真菌含量不同，两采样点小花棘豆种子中 U． oxytropis含量均为最高，叶和茎相
反，两地变异黄芪为种子中最高，根最低，叶和茎相反。【结论】内生真菌寄生在植物组织时对宿主组织和细
胞类型均有选择性，生境对疯草中内生真菌的定殖和分布也有影响。
关键词:小花棘豆，变异黄芪，疯草，内生真菌，显微分布，荧光定量 PCＲ
中图分类号:X172 文章编号:0001-6209(2014)05-0572-10
疯 草 (Locoweed)是 指 含 有 苦 马 豆 素
(Swainsonine，SW) ，且能引起动物疯草中毒典型神
经学症状和病理学变化的有毒植物的统称［1］，目前
已成为全世界范围内影响草地畜牧业发展最严重的
毒草［2］。我国已发现的疯草类有毒植物共 47 种，其
中棘豆属(Oxytropis sp．)23 种，黄芪属(Astragalus
sp．)23 种，苦马豆属 1 种，对草地畜牧业构成严重
灾害的有 13 种［3］，其中小花棘豆(O． glabra)和变
异黄芪(A． variabilis)分别构成棘豆属和黄芪属类
疯草中对草地和畜牧业危害最严重的种类，仅这两
类疯草每年给我国畜牧业造成的直接经济损失高达
几百万元［3］。随着草场利用度增加、气候干旱、管
理滞后等人为和自然因素的影响，部分牧区出现草
地大面积沙化和毒草化，已直接威胁到我国内蒙古、
新疆等边疆少数民族地区的可持续发展。另一方
面，疯草能在草场沙化较严重的地带生长，具有耐干
旱、耐寒、耐贫瘠与耐盐碱等抗性［4］，可起到防风固
沙、固土护坡和水土保持等作用，还能增强土壤肥
力，极具重要的生态学价值［5］。因此，了解植物的
动物毒性和生态作用的特征和规律对如何科学地开
发利用疯草类植物的生物学价值就显得尤为重要。
内生真菌(Endophytic fungi)是指在其生活史中
某一段时期内或整个生命时期生活于植物组织内部，
对其宿主不引起明显疾病的一类真菌，还包括腐生真
菌、病原真菌和菌根菌［6］。内生真菌长期生活于疯草
组织内部，与宿主长期协同进化过程中，彼此形成了
周启武等:小花棘豆和变异黄芪内生真菌显微分布及定量检测． /微生物学报(2014)54(5)
互惠互利的共生关系，密切完成物质、能量及各种信
号分子等传递［7］。我国小花棘豆和变异黄芪主要生
长在陕西、内蒙古、宁夏、甘肃和新疆等省(区)的草
原、山地和荒漠、半荒漠地区，能够抵抗各种恶劣的生
存环境，这主要与疯草中感染了内生真菌有关［4，8 － 9］。
1999年，Braun首次从疯草(绢毛棘豆)中分离出内生
真菌并鉴定为对链格孢属(Alternaria sp．)真菌［10］;
2003年又从密柔毛黄芪、绢毛棘豆和蓝伯氏棘豆分离
出能够产生苦马豆素的内生真菌(Embellisia
sp．)［11］;随后的研究发现，疯草内生真菌(Undifilum
oxytropis)在苦马豆素合成过程中起着主导作用，是疯
草类植物中苦马豆素的主要来源，而且疯草内生真菌
感染后可以明显增强宿主抵抗盐碱、高温、高寒等逆
境的能力［12 － 16］。仅 10多年时间，国内外学者已从不
同生境的多种疯草中分离获得产苦马豆素 SW的内
生真菌，并对内生真菌与疯草间的互作关系进行了研
究，发现疯草内生真菌与疯草抗逆性及疯草毒素的产
生有密切关系［7］。目前，已证实能够产生疯草毒素的
内生真菌主要有埃里砖格孢属真菌(Embellisa sp．)、
镰刀孢属真菌(Fusarium sp．)和疯草内生真菌(U．
oxytropis)三类［3］。但有关内生真菌在疯草组织中的
定殖特点及数量分布研究较少。
本研究旨在通过石蜡切片结合乳酸酚棉蓝染色
法，观察小花棘豆和变异黄芪各组织中内生真菌的
显微分布形态及特点，并采用实时荧光定量 PCＲ 法
(ＲT-qPCＲ)检测各组织中内生真菌 U． oxytropis 的
含量，为了解我国疯草内生真菌多样性和分布规律，
为疯草与内生真菌互作关系研究提供基础资料。
1 材料和方法
1. 1 材料
1. 1. 1 植物样品:新鲜健康的小花棘豆和变异黄芪
地上部分全草及其茎、叶、种子和根等样品 2011 年
7 ～ 8 月采集于内蒙古阿拉善左旗和宁夏银川的天
然草地(表 1)。样品幼嫩组织放入 FAA 固定液 B
液中，较老组织放入 FAA 固定液 A 液瓶中固定，带
回实验室用于组织石蜡切片制作;同时将相应组织
放入装有变色硅胶的保鲜袋中脱水处理，带回实验
室用于内生真菌 ＲT-qPCＲ检测。
表 1． 植物样品采集坐标及其生长环境
Table 1． Locations and Growth situation of plants sampled
plant / location GPS(No．) altitude /m phenological period land forms and soil
Oxytropis flabra
(BayanHot in Inner Mongolia )
38°49 805″
105°42 021″ 1593 fruiting stage
dandelion，plantain，MAO grass，
wheatgrass，brown calcic soil
Oxytropis flabra
(Yinchuan in Ningxia )
38°29 870″
106°08 288″ 1108 flowering fruit stage
grass lawn，wheatgrass，bitter Herbs，
thermopsis lanceolata，，grey soil
Astragalus variabilis
(Jilantai in Inner Mongolia )
38°49 813″
105°41 983″ 1599 flowering fruit stage
wheatgrass，MAO grass，grit，
Gobi Desert，brown calcic soil
Astragalus variabilis
(AoLun Prague in Inner Mongolia )
40°26 874″
106°12 878″ 1036 fruiting stage
wheatgrass，MAO grass，Gobi Desert，
grit，brown calcic soil
1. 1. 2 标准菌株:本实验室从疯草中分离并保存在
国家微生物菌种保藏中心的可产疯草毒素的内生真
菌 U． oxytropis CICC2493，在 PDA 培养基上复壮后
的纯培养物作为 ＲT-qPCＲ检测的标准菌株。
1. 1. 3 主要仪器:普通光学显微镜(重庆光电)、显
微照相机(MOTIC)、干湿两用培养箱(DGP-9057B-
2，上海福玛)、切片机(Leica ＲM2016，德国)、毛笔、
摊 片 机、超 低 温 冰 箱 (SANYO MEDICAL
FＲEEZEＲ)、高速冷冻离心机(SIGMA 3K15)、普通
PCＲ 仪(Bio-Ｒad)、超微量分光光度计(Bio-Tek
Epoch)、实时荧光定量 PCＲ 仪(Bio-Ｒad-IQ5)，全自
动凝胶成像系统(SYNGENE)等。
1. 1. 4 主要试剂:5% NaOH溶液(自配)、乳酸酚棉
蓝染液(自配)、FAA固定液(A液和 B液，自配)、中
性树胶(国药集团化学试剂有限公司)、EasyPureTM
Plant Genomic DNA Kit (北 京 全 式 金)、2 ×
TransStartTM Top Green qPCＲ SuperMix(北京全式
金)、限制性内切酶 AvaⅡ(纽英伦，北京)等。
1. 2 石蜡切片法检测疯草内生真菌
1. 2. 1 材料预处理:取出 FAA 固定液中保存的植
物组织，分别将幼嫩和较老的组织放入 50%和 70%
酒精中分别洗涤 3 次，每次 1. 5 h，以充分去除组织
中的固定液。
1. 2. 2 各组织石蜡切片制作:①将组织依次放入
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Qiwu Zhou et al． /Acta Microbiologica Sinica(2014)54(5)
70%至 100%的梯度酒精逐级脱水，然后常规透明;
②透明完毕放入 38 － 40℃左右的干湿两用培养箱，
逐渐加入适量石蜡屑，至蜡屑不能溶解并与二甲苯
形成糊状物为止，调节温度为 60℃鼓风干燥蒸发二
甲苯，然后放入纯蜡中，每隔 2 h 换一次纯蜡(共 3
次)，完成渗蜡，并包埋;③修块后采用切片机(Leica
ＲM2016，德国)切片，厚度 15 μm －20 μm，用毛笔和
刀片小心取下平整连续的蜡带于摊片机水槽中
(48℃)，使组织薄片自然摊开在载玻片上，编号后
放入烤片槽中(68℃)烤片 15 min，然后移入 72℃烘
片箱内烘烤 20 min。④取出切片进行脱蜡和醇化;
⑤滴加乳酸酚棉蓝染液依组织切片厚度适当调整时
间染色为 5 － 15 min，然后进行组织脱水与透明;⑥
封片观察。
1. 3 Ｒeal-time qPCＲ法检测疯草内生真菌
1. 3. 1 反应体系的建立及优化:取已纯化回收的
U． oxytropis CICC2493 真菌 PCＲ 产物 2 μL，通过超
微量分光光度计测定浓度，调整浓度后进行 6 － 8 次
10 倍连续梯度稀释，作为标准样品。应用 U．
Oxytropis 真 菌 特 异 性 引 物 ITS5 (5-
GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3)和 OＲ1 (5-
GTCAAAAGTTGAAAATGTGGCTTG-3)［17］扩增菌株
5. 8S rDNA-ITS区段，引物由南京金斯瑞科技有限
公司合成。
通过实时 PCＲ仪(IQ5;Bio-Ｒad)进行荧光定量
PCＲ扩增，体系为:模板(标准 DNA /阴性对照)3 μL
/ 0 μL，ITS5 和 OＲ1 各 1 μL，2 × TransStartTM Top
Green qPCＲ SuperMix 12. 5 μL，Passive Ｒeference
Dye 0. 5 μL，加 ddH2O水补足 25 μL。反应条件为:
94℃欲变性 3 min;94℃ 15 s，58℃ 30 s，72℃ 40 s，
共 40 个循环。反应结束后检测 PCＲ 产物，并使温
度从 55℃开始以 0. 5℃ /10 s的幅度上升到 95℃，至
PCＲ产物完全解链，期间每间隔 10 s检测一次荧光
信号。根据反应的 Ct值、最高荧光值以及熔解曲线
等对引物反应浓度、最佳退火温度及扩增效率进行
优化，以扩增 Ct 值在 15 － 35 之间，扩增效率接近
100%为最佳反应。
1. 3. 2 标准曲线制作:通过 1. 3. 1 进行反应体系的
建立及优化，确定标准 DNA 梯度浓度、引物浓度和
最佳反应条件，在最佳(相同)反应条件下进行 ＲT-
qPCＲ扩增，同时设置不加模板的阴性对照，每个反
应体系重复 3，由 IQ5 软件自动生成标准曲线和方
程以建立 Ct值与内生真菌浓度之间的线性关系。
1. 3. 3 疯草内生真菌的 ＲT-qPCＲ 检测:(1)组织
基因组 DNA提取:①随机选取各采样点 3 个重复的
小花棘豆和变异黄芪茎、叶、种子等组织在液氮中充
分研磨，称取 30 mg左右粉末于 1. 5 mL 无菌 EP 管
中;②按 Plant Genomic DNA Kit 试剂盒提取各组织
基因组总 DNA。即首先加入 250 μL 的 ＲB1 溶液，
震荡摇匀后加入 30 μL 10% 的 SDS 和 15 μL 的
ＲNase A，充分摇匀后于 55℃水浴 15 min;水浴完毕
12000 × g离心 10 min，吸取上清于干净的 EP管中，
加入 100 μL PB1 溶液，摇匀冰浴 5 min后 12000 × g
离心 5 min;再吸取上清于干净的 EP 管中，加入
375 μL溶液 BB1 充分混匀后全部混合液加入吸附
柱中，12000 × g 离心 1 min，弃去流出液并加入
500 μL 溶液 12000 × g 离心 1 min，再先后两次加入
WB1 适量 12000 × g 离心 1 min;最后，将吸附柱置
于一干净的 EP 管中，在柱的正中央加入 60 μL 预
热(60℃)的 EB，室温稍静置后 12000 × g 离心
1 min，洗脱 DNA即可。
(2)ＲT-qPCＲ检测:①为准确测定和表示疯草
组织中 U． oxytropis的含量(pg /ng总 DNA)，首先通
过超微量分光光度计测定各组织基因组 DNA浓度;
②分别以小花棘豆和变异黄芪各组织总 DNA 为模
板，在最佳扩增条件下对内生真菌含量进行 ＲT-
qPCＲ检测，同时观察熔解曲线并检测荧光信号;③
检测完毕，将每个样品对应的 Ct值带入标准曲线方
程，计算各组织中内生真菌的含量(pg /ng)。
1. 3. 4 ＲT-qPCＲ扩增产物特异性与重复性评价:
为避免非特异性扩增或引物二聚体对检测结果的影
响，本研究在 PCＲ扩增反应结束后进行熔解曲线分
析，以区分 PCＲ产物与本底或引物二聚体与本底结
合发出的荧光。并应用特异性的限制性内切酶 Ava
Ⅱ对 PCＲ 产物进行水解酶切，通过凝胶电泳检测
PCＲ产物是否具有特异性的酶切位点，来验证 PCＲ
反应的特异性。同时在对每个样品(包括标准样品
和阴性对照)进行测定时，均设定同一样品的 3 个
重复检测，以验证检测结果的重复性。
2 结果和分析
2. 1 内生真菌石蜡切片检测结果
在小花棘豆叶片组织的表皮层中，内生真菌分
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周启武等:小花棘豆和变异黄芪内生真菌显微分布及定量检测． /微生物学报(2014)54(5)
布自然、菌丝体弯曲度小，主要在细胞间隙，有部分
菌丝体横穿两层细胞中间，菌丝体出现分叉现象
(图 1-A)。在茎髓质中，内生真菌菌丝体沿髓质细
胞纵向排列分布，粗细均匀，弯曲度小，有时菌丝体
穿过茎髓细胞横断面到达细胞另一侧，多条菌丝同
时在细胞横断面相遇时出现分叉现象，在周围发现
菌丝团(图 1-B)。在种子中内生真菌数量较多，菌
丝体粗细均匀，较短，弯曲度较大，无分叉，且主要分
布在种脐周围的种皮栅栏组织与薄壁组织两层的细
胞间隙，胚体部分未见到内生真菌菌丝体(图 1-C)。
图 1． 内生真菌在小花棘豆不同组织部位的显微分布(400 ×)
Figure 1． Microscopic distribution of endophyte fungi in different tissues of O． glabra DC(400 ×)． A:Hyphae distribution in leaf;B:
Hyphae distribution in stem;C:Hyphae distribution in seed．
内生真菌在变异黄芪叶、茎和种子中的显微分
布特点与小花棘豆相应 3 种组织中的分布类似但也
有差异(图 2)。变异黄芪叶片组织中的菌丝体分布
明显较少，菌丝较细，弯曲度较大(图 2-A);茎髓质
观察到和小花棘豆菌丝分布相同的特点，但也发现
变异黄芪茎组织中有的内生真菌同时横向排列在两
层细胞间的数个细胞周围，呈波浪形(图 2-B);种子
中内生真菌主要分布于种皮中间层(薄壁组织层)
与外皮层(栅栏组织层)和内皮层(致密的软细胞组
织或胚乳层)的两层细胞间(致密软组织细胞层或
薄壁层)，而在胚体层未见内生真菌分布(图 2-C)。
图 2． 内生真菌在变异黄芪不同组织部位的显微分布(400 ×)
Figure 2． Microscopic distribution of endophyte fungi in different tissues of A． variabilis(400 ×)． A:Hyphae distribution in leaf;B:
Hyphae distribution in stem;C:Hyphae distribution in seed．
2. 2 标准曲线的制作
通过最佳体系和反应条件摸索后，将引物浓度
调整为 ITS5 和 OＲ1 各 0. 5 μL，其他体系不变，总体
积 25 μL;反应条件为:95℃ 30 sec，95℃ 5 sec，60℃
15 sec，72℃ 40 sec，共 40 个循环;反应结束后检测
荧光信号频率不变。
标准菌株 U． oxytropis 的 PCＲ 产物浓度为
410. 238 ng /μL，进行 6 次 10 倍梯度稀释，浓度依次
为 41. 0238 ng /μL，4. 1024 ng /μL，0. 4102 ng /μL，
0. 0410 ng /μL，0. 0041 ng /μL 和 0. 0004 ng /μL，并
以这 6 个标准浓度的 DNA 为模板进行 PCＲ 扩增，
反应结束后由 IQ5 自动生成标准曲线和溶解曲线
(图 3)。
由图 3-A可知，本次 PCＲ定量检测时熔解曲线
上形成单一整齐的产物峰，且都相对集中在一个位
置上，即熔解温度为 88℃，说明无非特异性扩增产
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图 3． 标准菌株 DNA扩增产物熔解曲线(A)与标准曲线
(B)
Figure 3． Dissociation curve of PCＲ products (A)and standard
curve of endophytic DNA (B)．
物出现，引物设计、浓度及反应条件均较理想。从图
3-B可知，本次扩增反应的扩增效率 E = 98. 5%，说
明该反应体系和条件较理想;各浓度梯度间反应的
相关性系数 Ｒ2 = 0. 999，说明标准差都在 0. 2 范围
内;截距为 15. 247。故得出内生真菌的 DNA 起始
浓度对数值与 Ct值之间的线性方程为 y = － 3. 358
x + 15. 247，其中 y为扩增反应 Ct值，x为内生真菌
DNA起始浓度的 log10值。
2. 3 内生真菌 ＲT-qPCＲ检测结果
小花棘豆和变异黄芪各组织总 DNA 浓度见表
2，根据各组织总 DNA 浓度及标准曲线制作梯度浓
度关系，对全部组织总 DNA 进行 10 倍稀释。将稀
释后的各组织样品按制作标准曲线的反应体系和条
件进行 SYBＲ Green I 的荧光定量 PCＲ 扩增，通过
Bio-Ｒad-IQ5 进行小花棘豆和变异黄芪各组织内生
真菌含量定量检测时，扩增反应曲线和熔解曲线相
对较平滑，统一性较好，特异性强，结果可信，并通过
软件导出内生真菌检测结果。根据该反应下得出的
标准曲线方程和样品稀释处理方法，即可根据以下
公式计算出样品中内生真菌的含量，单位为 pg /ng
总 DNA浓度(表 2)。
内生真菌含量(pg /ng 总 DNA)=
15． 247 － Ct
3． 358 × C总DNA
× 10 × 1000
本研究应用前期提取纯化的标准菌株 PCＲ 产
物作为标准 DNA，适当稀释后进行梯度倍比稀释制
作标准曲线，由于本次制作标准曲线的最低浓度为
0. 0004 ng /μL，每个 PCＲ 反应体系用量为 3 μL，因
此本次定量检测的最低极限为 0. 029 pg /ng 总
DNA。
表 2． 各植物组织总 DNA扩增 Ct值和真菌含量(pg /ng)
Table 2． Total DNA，Ct value and endophyte concentrations in
different locoweed tissues (pg /ng)
plant tissue
total DNA /
(ng /μL)
Ct
value
amount
O． flabra Leaf 8. 617 25. 00 1. 4420
BayanHot Stem 17. 898 24. 59 0. 9223
Seed 10. 669 23. 73 2. 7803
A． variabilis Leaf 15. 002 23. 08 3. 0972
Jilantai Stem 6. 857 24. 35 2. 8326
Seed 18. 061 21. 57 7. 2460
Ｒoot 14. 889 24. 06 1. 5943
O． flabra Leaf 6. 258 24. 45 2. 9037
Yinchuan Stem 7. 266 22. 79 7. 8060
Seed 8. 192 21. 64 15. 2334
A． variabilis Leaf 13. 483 22. 11 6. 7056
AoLun Prague Stem 14. 748 21. 15 11. 8406
Seed 7. 082 21. 18 24. 1556
Ｒoot 9. 836 22. 62 6. 4793
由表 2 可知，本次所检测的全部样品中内生真
菌的 DNA浓度均在检测限(0. 029 pg /ng)以上，比
较发现，不同组织部位内生真菌含量不同，但两个采
样点小花棘豆的种子中内生真菌含量均为最高，茎
和叶相反，总体上采自银川的小花棘豆各组织内生
真菌含量均比采自巴彦浩特镇的小花棘豆各组织中
高;两采样点变异黄芪各组织中内生真菌的含量分
布不相似，但种子均为最高，根最低，叶和茎正好相
反，且总体呈现出采自敖伦布拉格镇的变异黄芪各
组织内生真菌含量均高于吉兰泰采样点变异黄芪的
相应组织(图 4)。
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周启武等:小花棘豆和变异黄芪内生真菌显微分布及定量检测． /微生物学报(2014)54(5)
图 4． 不同疯草组织部位内生真菌含量
Figure 4． Endophyte concentrations in different locoweed tissues．
2. 4 ＲT-qPCＲ检测的特异性与重复性试验
反应结束后各取 PCＲ 反应液 5 μL 于 1. 2%的
琼脂糖凝胶上电泳，在凝胶成像系统中观察到约为
600 bp的扩增条带(图 5-A)，与预期片段大小一致，
说明本次 PT-qPCＲ 反应均扩增获得真菌目的基因
片段。同时电泳检测限制性内切酶 Ava II的水解产
物情况(图 5-B) ，其中泳道 1、3、5、7、9 为经过 Ava II
水解的 U． Oxytropis 真菌 ＲT-qPCＲ 扩增产物，发现
阳性扩增 PCＲ 产物(580 bp)被内切酶水解成两个
大小约为 380 bp和 200 bp的片段(泳道 1 和 3) ;泳
道 2 和 4 为未经内切酶水解的 ＲT-qPCＲ产物，条带
整齐，大小均匀;此外，本研究选取实验室从疯草中
分离获得的其它优势菌株(Alternaria sp．，Fusarium
sp．和 Aspergillus sp． 真菌)的 PCＲ 产物进行酶切水
解(泳道 6，8 和 10)，发现限制性内切酶 Ava II 不能
水解除 U． oxytropis(泳道 5，7 和 9)外其他真菌的
ITS基因序列，本次 ＲT-qPCＲ检测技术对疯草中 U．
oxytropis的检测特异性较强。
表 3． ＲT-qPCＲ检测不同样品内生真菌
含量的重复性试验
Table 3． Ｒeproducibility testing of ＲT-qPCＲ for endophyte
concentrations in different tissues
sample and
mean
Ct Mean
1 2 3
Ave STD VC
sample 1 24. 24 24. 71 24. 82 24. 59 0. 17 0. 56%
sample 2 23. 62 23. 41 24. 17 23. 74 0. 22 0. 97%
sample 3 25. 41 24. 09 25. 51 25. 00 0. 45 0. 85%
sample 4 21. 18 21. 49 22. 04 21. 57 0. 23 0. 79%
sample 5 23. 75 23. 87 24. 44 24. 02 0. 30 0. 95%
sample 6 23. 92 23. 88 24. 38 24. 06 0. 16 1. 14%
sample 7 21. 82 23. 18 24. 25 23. 08 0. 63 0. 77%
图 5． ＲT-qPCＲ产物(A)及限制性内切酶水解产物(B)
凝胶电泳
Figure 5． Agarose gel of ＲT-qPCＲ products (A)and restriction
enzyme AvaII digest pruductsv (B)．
从检测结果中随机选取平行样品测定的 Ct 值
分析发现(表 3) ，除样品 7 的 3 次重复结果的标准
差(STD =0. 63)大于 0. 50 外，其余样品重复测定值
间的标准差均小于 0. 50，说明样品检测的重复性较
好，这与较高的扩增效率相符合;从变异系数发现本
次检测过程中各样品测定值间的变异系数均较小，
775
Qiwu Zhou et al． /Acta Microbiologica Sinica(2014)54(5)
说明本次 ＲT-qPCＲ 过程中样品处理较好或检测方
法的重复性较高。
3 讨论
石蜡切片技术在植物科学研究领域扮演着十分
重要的角色，通过结合乳酸酚棉蓝染液可以很好地
研究植物组织内生真菌感染情况及微观分布形态。
内生真菌广泛地存在于自然界高等植物与低等植物
的根、茎杆、叶鞘、等器官和组织的细胞或细胞间
隙［18］。但在任何一种植物组织中都存在着一些无
法通过人工培养条件培养出来的内生真菌，因此通
过熟练的组织切片染色技术可以很好地检测植物组
织带菌情况，从而更客观地评价植物内生真菌多样
性并认识内生真菌在宿主组织细胞间的自然生长状
况。
研究植物组织内生真菌显微分布形态有助于阐
明内生真菌定殖组织、入侵通路、生态位的竞争以及
共生关系等机制。本研究为了更好地观察到小花棘
豆和变异黄芪各组织中内生真菌的组织分布情况以
及显微形态特征，在植物样品采集后立即装入 FAA
固定液中，通过抽真空使固定液充分渗入组织达到
更好地杀死组织细胞。在制作疯草植物组织石蜡切
片时，对不同植物及组织的脱水、透明、切片厚度、染
色时间等进行了大量摸索，而且为了很好地观察内
生真菌菌丝体在植物细胞间的自然分布形态，切片
时均选择与组织细胞或纤维长轴平行切面进行。观
察发现，种子中内生真菌主要定殖于种皮栅栏组织
与薄壁组织两层的细胞间隙，这与 Oldrup 等［19］在
斑荚黄芪(Astragalus lentiginousus)中发现的结果一
致;叶片中主要定殖于靠近气孔的表皮细胞层，茎髓
中内生真菌围绕于茎髓质维管束纵轴边缘的薄壁细
胞层中，这与周启武等［20］通过临时装片技术观察到
的结果相符。
虽然我国疯草内生真菌的研究还处于起步阶
段，但已涉及疯草内生真菌的分离鉴定［21 － 22］、活性
功能菌株的筛选［23 － 26］、功能菌株发酵培养条件的优
化［27 － 28］以及疯草内生真菌与宿主植物间相互作用
关系［29 － 31］等方面的研究。2010 年，Cook 等［17］首次
建立了 ＲT-qPCＲ检测疯草内生真菌的方法，并测定
了我国内蒙古小花棘豆中内生真菌含量同时与苦马
豆素浓度进行了比较［32］。除此之外，我国尚未报道
过实时荧光定量 PCＲ 技术检测疯草内生真菌的研
究。
本研究选取 U． oxytropis真菌特异性引物，成功
建立了 ＲT-qPCＲ 技术对我国小花棘豆和变异黄芪
各组织中产苦马豆素内生真菌(U． oxytropis)含量
进行了测定分析，检测限达到 0. 029 pg /ng 总 DNA。
此方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好等特点，
可信性优于组织分离法和染色法。本试验以小花棘
豆和变异黄芪植株各组织为研究对象，分别从各采
样点随机选取 3 个重复植株进行内生真菌检测，发
现被检组织中均存在内生真菌，且两个采样点小花
棘豆内生真菌含量均为种子最高，叶和茎相反，这可
能与内生真菌借助种子发芽后通过种皮进行垂直传
播的方式有关，但总体上银川采样点小花棘豆各组
织内生真菌含量均比巴彦浩特采样点小花棘豆相应
组织高;两个采样点变异黄芪内生真菌含量组织分
布种子均为最高，根最低，这可能说明变异黄芪组织
中的内生真菌主要来源或寄生于种子中，叶和茎正
好相反，且叶中内生真菌的菌丝体分布特点与小花
棘豆叶片中内生真菌的菌丝分布明显不同，有可能
与两者叶片结构相差较大有关，但总体上敖伦布拉
格镇变异黄芪各组织内生真菌含量均高于吉兰泰镇
变异黄芪的相应组织。
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Microscopic distribution and quantitative detection of
endophytic fungus Undifilum oxytropis from Oxytropis
glabra DC and Astragalus variabilis
Qiwu Zhou1，Longfeng Yu1，Hao Lu2，Dandan Cao2，Baoyu Zhao2*
1Department of Agriculture，Lincang Teachers’College，Lincang 677000，Yunnan Province，China
2College of Veterinary Medicine，Northwest A＆F University，Yangling 712100，Shaanxi Province，China
Abstract:［Objective］The characteristics of microscopic distribution and content of Undifilum oxytropis were observed
and quantified in different tissues of Oxytropis glabra and Astragalus variabilis from natural grasslands of Inner Mongolia
and Ningxia Province． ［Methods］Distribution of fungal endophyte was obtained in all the tissues (stems，leaves，seeds
and roots)of O． glabra and A． variabilis though paraffin section and staining method of lactic acid phenol cotton blue;
and content of fungal endophyte was determined though Ｒeal time-qPCＲ． ［Ｒesults］ Endophytc fungi were observed
mainly within the gap between the palisade tissue and parenchymatous tissue of seed coat in seed，mainly colonized in the
superficial cells layer near stoma in the leaves，and in pith of stem mainly plants in the parenchymatous tissue around the
edge of the vertical axis of the vascular bundle． There was an obviously difference in concentration of U． oxytropis in the
plants collected in different locations． The content of U． oxytropis was highest in all seeds of O． glabra，while it was
opposite in stems and leaves of two sampling points． Similarly，the content of U． oxytropis was highest in seeds，it was
lowest in roots，and stems and leaves were opposite in A． variabilis from two sampling points． The detection limit was
0. 029 pg /ng total DNA by Ｒeal time-qPCＲ． ［Conclusion］When endophytic fungi infected the tissues of plants，there
was selectivity to the tissues and cell type of host，and the colonization and distribution were influenced by habitats in
fungal endophytes of locoweeds．
Keywords:Oxytropis glabra DC，Astragalus variabilis，locoweed，endophytic fungi，microscopic distribution，real-time
qPCＲ
( 本文责编: 王晋芳)
Supported by the Special Fund for Agro-scientific Ｒesearch in the Public Interest (201203062)and by the National Natural Science Foundation of
China (31201958，31072175)
* Corresponding author． Tel /Fax:+ 86-29-87092429;E-mail:zhaobaoyu12005@ 163． com
Ｒeceived:13 September 2013 / Ｒevised:27 December 2013
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