全 文 ： 药理药化
收稿日期:2007-08-13;　修订日期:2007-11-21
基金项目:国家自然科学基金(No.30572379)
作者简介:顾伟梁(1981-),女(汉族),上海人 ,现为上海中医药大学在读
博士研究生 ,主要从事中药药理学研究工作.
＊通讯作者简介:陈长勋(1948-), 男(汉族),福建福州人 , 现任上海中医
药大学教授 ,博士生导师 ,主要从事中药药理学和心血管药理学科研教学
工作.
玄参对心室重构大鼠血管紧张素 Ⅱ
及其 1型受体基因表达的影响
顾伟梁 , 陈长勋＊ , 王　樱
(上海中医药大学 ,上海　201203)
摘要:目的 探讨玄参对心室重构大鼠血管紧张素Ⅱ (AngⅡ)及其 1型受体基因表达(AT1AmRNA)的影响。方法 采用
甲状腺素致大鼠心室重构及腹主动脉不完全结扎致大鼠心室重构两种动物模型 , 观察玄参对心脏指数(heartweightin-
dex, HWI)、心肌血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ , AngⅡ)、醛固酮(aldosterone, ALD)及血管紧张素Ⅱ受体 1型基因(AT1AmR-
NA)表达水平的影响 。结果 与模型组相比 , 玄参可显著降低动物 HWI, 降低心肌 AngⅡ , ALD含量 , 降低 AT1A mRNA的
过量表达。结论 玄参对心室重构具有明显的改善作用 , 其机制可能与抑制 AngⅡ , ALD生成和 AT1AmRNA表达有关。
关键词:玄参;　心室重构;　血管紧张素Ⅱ;　血管紧张素Ⅱ 1型受体;　基因表达
中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2008)07-1547-03
TheInfluenceofXuanshenontheConcentrationofAngⅡ andtheExpressionofAT1AmRNAinVentricularRemodelingRats
GUWei-liang, CHENChang-xun＊ , WANGYing
(Dept.ofPharmacology, ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine, Shanghai201203, China)
Abstract:ObjectiveToinvestigatetheinfluenceofXuanshenontheconcentrationofangiotensinⅡ (AngⅡ)andtheexpres-
sionofangiotesinⅡ receptor(Type1A)mRNA(AT1AmRNA)inventricularremodelingrats.MethodsTwoventricularremode-lingmodelswereestablished.Onewasinducedbythyroxinandtheotherwasinducedbyabdominalaorticstenosisinrats.The
heartweightindex(HWI), theAngⅡ andALDconcentration, andtheAT1A mRNAexpressionweredeterminedafteraperiodofXuanshenadministration.ResultsComparedwiththoseofventricularremodelingrats, theHWI, theconcentrationofAngⅡ and
ALDandtheexpressionofAT1AmRNAweredecreasedingroupstreatedwithXuanshen.ConclusionXuanshenhasanobviouslyeffectonpreventiveventricularremodeling.ThemechanismmayberelatedtothedeclineofAngⅡ andALDconcentrationand
theinhibitionofAT1AmRNAexpression.Keywords:Xuanshen;　Ventricularremodeling;　AngⅡ;　AT1AmRNA;　Geneexpression
　　心室重构(VentricularRemodeling)涉及心肌肥大 、心肌重量
增加 、心腔容积增大 、心室形状改变和心肌间质纤维化 [ 1] 。对各
种心室重构动物模型的研究发现 , 心室重构并非是一种生理性
的 、良性的 、适应性的代偿过程 , 而是一种可导致心功能严重损害
的病变过程。因此在心室重构的初期即进行有效的干预意义
重大。
神经内分泌因子是心室重构发生与发展的重要因素 ,其中血
管紧张素Ⅱ(AngⅡ)是公认的核心因子 ,且 AngⅡ随着心力衰竭
的进展而升高 [ 2] 。因此寻找对 AngⅡ过度激活有抑制作用的药
物 , 对防治心室重构具有重要的现实意义。
玄参为玄参科多年生草本植物玄参的根 , 是著名的传统中
药。始载于《神农本草经》, 列为中品 , 性寒 , 味苦 、甘 、咸 , 可入肺
经 、胃经 、肾经 , 具有滋阴 、降火 、生津 、凉血 、解毒等功效。现代药
理研究发现玄参在心血管系统具有广泛而重要的药理作用 ,而玄
参抗心室重构的实验研究尚未见报道。
本实验采用甲状腺素致大鼠心室重构和腹主动脉缩窄致大
鼠心室重构两种动物模型 ,并以血管紧张素Ⅱ (AngⅡ)及其 1型
受体基因表达(AT1AmRNA)为切入点 , 观察玄参对心室重构大鼠
血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)及其 1型受体基因表达(AT1AmRNA)的
影响 , 并阐明其可能的抗心室重构的作用机制。
1　器材与方法
1.1　动物 SD大鼠 ,雄性 , 体重 220 ～ 250 g, 购于中科院上海实
验动物中心 ,合格证号 SCXK(沪)2003-0003, 饲养于上海中医
药大学实验动物中心 SPF级动物实验室。
1.2　仪器 DL-50RC-L离心机(上海中科生物医学高科技开
发有限公司);SN-682放射免疫 γ计数器(中国科学院上海原
子核研究所日环仪器厂);FJ-200高速分散均质机(上海标本模
型厂);754型紫外可见分光光度计(上海第三分析仪器厂);PCR
仪(ABI美国应用生物有限公司 , 型号:PCRSYSTERM 9700);电
泳仪(复旦科技 ,型号:FR-250);凝胶成像(上海天能科技有限
公司 , 型号:Tanon2500);Biohit移液枪 、Eppendorf移液枪 。
1.3　药品试剂 玄参(批号:060913), 产地浙江 , 上海养和堂中
药饮片有限公司;L-甲状腺素(L-Thy)(产品批号:1131479),
Sigma公司;卡托普利(批号:060804), 上海衡山药业有限公司;
血管紧张素Ⅱ试剂盒(批号:20061230), 北京北方生物技术研究
所;考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒(批号:20070104), 南京建成试
剂公司;醛固酮放免试剂盒(批号:061220), 北京北方生物技术
研究所;2 ×PCRMasterMix(批号:2007040822), 上海欣百诺生
物科技有限公司;RevertAidtTM FirstStrandcDNASynthesisKit,
K1622 (批号:00022047), Fermentas公司 ,上海中晶代理 。
1.4　玄参药液制备 玄参用 8倍量水煎煮 3次 , 每次微沸 30
min,合并滤液浓缩 , 冷藏备用。实验用量按每千克给予的生药量
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LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2008 VOL.19 NO.7 时珍国医国药 2008年第 19卷第 7期
计算。
1.5　模型制备及分组给药
1.5.1　抗 L-甲状腺素致大鼠心室重构观察 选用 220 ～ 250 g
的雄性 SD大鼠 50只 , 随机分为 5组 , 每组 10只 , 分别为:正常
组 、模型组 、卡托普利组 、玄参小剂量组和玄参大剂量组。除正常
组外 , 各组连续 7 d腹腔注射 L-甲状腺素 0.25 mg· kg-1·
d-1 , 1次 /d,造成心室重构模型;正常组腹腔注射等量生理盐水。
各给药组在给予 L-甲状腺素后灌胃给予卡托普利 40 mg· kg-1
或玄参水煎液 13.5, 27g· kg-1;正常组 、模型组灌胃给予等量蒸
馏水。连续灌胃给药 9 d后 , 于处理前禁食不禁水 12 h, 然后取
血和心肌进行各项分析。
大鼠心肌肥厚指数的测定:大鼠称体重(BW)后腹主动脉取
血。快速打开胸腔取心脏 , 去除心房组织 , 分离左 、右心室 , 生理
盐水漂洗去血 , 用滤纸吸干表面水分 , 电子天平准确称取左心室
重量和全心重量。 计算左心室重量 /体重(LVW/BW)、全心重
量 /体重(HW/BW),分别记为左心室肥厚指数(LVWI)、全心肥
厚指数(HWI)。
心肌组织 AngⅡ含量测定:取大鼠的心肌组织约 200 mg,加
入 2 ml生理盐水在冰浴环境中快速匀浆 , 3 500r· min-1离心 10
min,取上清 200μl加生理盐水 800 μl,制备成 2%的心肌组织匀
浆 , 按血管紧张素Ⅱ试剂盒说明书及考马斯亮蓝蛋白测试盒说明
书进行操作测定 AngⅡ及蛋白浓度。结果以每毫克蛋白中的
AngⅡ含量表示。
1.5.2　抗腹主动脉缩窄致大鼠心室重构观察 大鼠用戊巴比妥
钠 30mg/kg腹腔注射麻醉 , 仰位固定 , 打开腹腔 , 钝性分离腹主
动脉 , 用内径为 0.5mm的银夹不完全结扎左右肾动脉之间的腹
主动脉 , 使之外径狭窄至 0.5mm, 制备压力超负荷性心室重构模
型。假手术组动物仅分离腹主动脉后不做结扎。术后肌肉注射
青霉素 1×104U· kg-1· d-1 , 共 3 d,预防感染。
造模后 2周手术组大鼠随机分组 , 每组 10只。给药 1次 /d,
连续给药 8周。玄参小剂量组灌胃给予玄参水煎液 13.5 g·
kg-1;玄参大剂量组灌胃给予玄参水煎液 27 g· kg-1;卡托普利
组灌胃给予卡托普利水溶液 40 mg· kg-1;假手术组和模型组大
鼠灌胃给予等量蒸馏水。
心脏指数:给药 8周后 , 动物称重 , 颈动脉取血处死后 , 快速
打开胸腔 , 分离心脏称重如前 “大鼠心肌肥厚指数的测定”项下
所述。
心肌组织 AngⅡ含量测定:取大鼠的心肌组织测 AngⅡ含
量 , 步骤如前 “心肌组织 AngⅡ含量测定”项下所述。
血清醛固酮(ALD)含量测定:取血 , 静置 1 h后 , 3 500 r/min
离心 10min取上清液 ,按醛固酮试剂盒说明书进行操作。
心肌组织 AngⅡ受体 1型基因(AT1A mRNA)的表达水平观
察:提取总 RNA及逆转录反应:每组取 5个心肌标本 ,每个约 100
mg, Trizol试剂盒提取总 RNA,取 2 μg总 RNA逆转录合成 cDNA
, -20 ℃保存。所有引物均由上海生物工程技术有限公司合成。
表 1　β -actin, AT1A引物序列
基因 基因库编号 上下游引物序列 5※ 3 目的片段长度(bp)
β -actin AGGCCCCTCTGAACCCTAAG 500
TGCCACAGGATTCCATACCC
AT1A NM 030985 CTACCCTCTACAGCATCATC 320
AAGGCGAGACTTCATTGG
PCR反应:以稀释 10倍后的 cDNA为模板 ,用目的基因引物
进行 PCR反应 , 同时设 β -actin作为内参 , 并根据实测的基因的
mRNA丰度建立最佳循环数 ,优化反应条件。在冰上配制如下反
应体系 。见表 2。
表 2　PCR反应体系配制表 μl
2 ×PCR
MasterMix
AT1A
sensePrimer
(10 μm)
AT1A
anti-sensePrimer
(10 μm)
Betaactin
sensePrimer
(10 μm)
Betaactinanti
-sensePrimer
(10μm)
ddH2O
10 1 1 0.1 0.1 7.8
　　配制完毕 , 放入 PCR仪中进行如下反应:95℃预变性 5 min;
进行 29个循环:95℃变性 30 s;55℃退火 30 s;72℃延伸 40 s;
72℃最后延伸 10min。
琼脂糖凝胶电泳检测:配制 1.5%的琼脂糖凝胶 , PCR产物 3
μl,上样缓冲液 2 μl, 120V电压电泳 30 min。用凝胶分析软件
Tanon2500, 根据条带强度进行积分计算分析读取数据 , 以 AT1A/β -actin作为心肌组织 AT1AmRNA表达的半定量指标。
1.6　统计学处理 实验数据以 x±s表示 ,采用 Excel统计软件进
行 t检验 , 用直线回归分析双变量相关性。以 P< 0.05, P<
0.01分别表示统计学意义显著和非常显著。
2　结果
2.1　玄参对 L-甲状腺素致大鼠心室重构的影响
2.1.1　对心脏指数的影响 模型组 LVWI, HWI分别比正常组显
著性升高(P<0.01);在腹腔注射 L-甲状腺素的同时 , 玄参大剂
量组和卡托普利组灌胃 9 d后 , LVWI和 HWI与模型组相比显著
降低(P<0.01)。玄参小剂量组的 LVWI、HWI与模型组比较无
显著性差异(P>0.05)。结果见表 3。
2.1.2　对心肌组织 AngⅡ含量的影响 与正常组动物相比 ,模型
组动物心肌组织中的 AngⅡ含量显著性升高(P<0.01), 玄参大
剂量组和卡托普利组灌胃 9d后 , 与模型组比较左心室心肌组织
中 AngⅡ的含量显著降低(P<0.01);玄参小剂量组左心室心肌
组织中 AngⅡ与模型组比较无显著性差异(P>0.05)。 结果
见表 3。
表 3　玄参对 L-甲状腺素致大鼠心室重构的影响 ( x±s)
组别 剂量 LVWI/mg· g-1 HWI/mg· g-1 AngⅡ /pg· (mgprot)-1
正常 - 2.38±0.10＊＊ 3.13 ±0.11＊＊ 34.96±10.64＊＊
模型 - 3.19±0.16 4.24 ±0.19 66.27±2.80
卡托普利 40 mg· kg-1 2.85±0.15＊＊ 3.89 ±0.23＊＊ 50.58±9.81＊＊
玄参小剂量 13.5 g· kg-1 3.12±0.28 4.13 ±0.34 62.33±11.75
玄参大剂量 27.0 g· kg-1 2.87±0.21＊＊ 3.84 ±0.33＊＊ 59.40±6.05＊＊
　　与模型组比较 , ＊P<0.05, ＊＊P<0.01;n=10
2.2　玄参对腹主动脉缩窄致大鼠心室重构的影响
2.2.1　对心脏指数的影响 与假手术组比较 , 模型组心脏指数显
著增加(P<0.01)。与模型组比较 , 玄参大剂量组和卡托普利组
心脏指数显著性降低(P<0.05或 P<0.01),玄参小剂量组心脏
指数虽有下降 , 但差异不显著(P>0.05)。结果见表 4。
2.2.2　对醛固酮(ALD)、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)含量的影响 与
假手术组比较 ,模型组 ALD、AngⅡ含量显著增加(P<0.01)。与
模型组比较 ,玄参小 、大剂量组 、卡托普利组均能显著性降低其含
量(P<0.01)。结果见表 4。
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时珍国医国药 2008年第 19卷第 7期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2008VOL.19 NO.7　
表 4　玄参对腹主动脉缩窄致大鼠心室重构的影响 ( x±s)
组别 剂量 LVWI/mg· g-1 HWI/mg· g-1 ALD/ng· ml-1 AngⅡ /pg· (mgprot)-1
假手术 - 2.16±0.22＊＊ 2.73±0.24＊＊ 0.93±0.18＊＊ 43.02±4.84＊＊
模型 - 2.80±0.18 3.40±0.22 1.26±0.22 48.44±2.90
卡托普利 40 mg· kg-1 2.34±0.18＊＊ 2.93±0.18＊＊ 0.88±0.21＊＊ 39.79±3.82＊＊
玄参小剂量 13.5 g· kg-1 2.72±0.24 3.28±0.27 0.87±0.15＊＊ 40.00±1.88＊＊
玄参大剂量 27.0 g· kg-1 2.57±0.25＊ 3.13±0.30＊ 0.79±0.11＊＊ 37.17±4.30＊＊
　　与模型组比较 , ＊P<0.05, ＊＊P<0.01;n=10
2.2.3　对心肌组织 AT
1A mRNA表达水平的影响 AT1A mRNA电
泳图(图 1)经分析统计后的结果如表 5所示:与假手术组比较 ,
模型组 AT1AmRNA含量显著增加(P<0.01)。与模型组比较 ,玄
参小 、大剂量组 、卡托普利组 AT1A mRNA含量显著降低(P<
0.01)。
图 1 　AT1A电泳图
表 5　玄参对腹主动脉缩窄大鼠 AT1AmRNA表达的影响( x±s)
组别 剂量 ratioofAT1AmRNA/β -actinmRNA
假手术 - 0.60±0.10＊＊
模型 - 1.76±0.15
卡托普利 40 mg· kg-1 0.67±0.09＊＊
玄参小剂量 13.5 g· kg-1 1.01±0.06＊＊
玄参大剂量 27.0 g· kg-1 0.79±0.04＊＊
　　与模型组比较 , ＊P<0.05, ＊＊P<0.01;n=5
2.3　各指标间相关性分析 结果见表 6。
表 6　各指标间相关性分析
相关性
(r)
甲状腺素造模
AngⅡ
腹主动脉缩窄造模
AngⅡ AT1AmRNA
LVWI 0.97 0.26 0.82
ALD - 0.97 0.87
3　讨论
心脏指数是一项病理学指标 ,是反映左心功能不全程度较为
准确的指标 , 所以采用动物心室重构模型时 ,可用心脏指数来评
价左心功能不全的严重程度 [ 3] 。本实验结果揭示玄参水提液能
显著降低两种模型动物左心和全心指数增加 ,对防治心室重构意
义明显。
AngⅡ具有较强的致心肌纤维化的作用 , 它可以通过 AT1受
体的介导直接作用于心脏成纤维细胞引起胶原合成的增加 [ 4] ,
促进心室重构 , 加速心力衰竭。 AT1是一个含有 7个跨膜肽链的
膜蛋白 , 可通过 G蛋白耦联途径介导 AngⅡ的作用 [ 5] 。 AT1亚型
又进一步分为AT1A和 AT1B, 其中 AT1A占 90%左右 , 是 AngⅡ作用
于心血管系统的主要受体亚型 [ 6] 。
本实验观察到甲状腺素致心室重构大鼠的AngⅡ与其左心
指数呈明显正相关(r=0.97)。玄参水提液明显降低心脏指数 ,
降低 AngⅡ含量 , 其作用机制可能与其直接抑制 AngⅡ的生成
有关。
腹主动脉缩窄所致心室重构大鼠的心肌 AngⅡ浓度与其
左心指数虽无明显相关性(r=0.26), 但 AT1A mRNA表达与
左心指数相关性较明显(r=0.82), 玄参水提液明显降低腹主
动脉缩窄所致心室重构大鼠的心脏指数 、AT1A mRNA表达和
心肌 AngⅡ浓度 , 其作用机制可能与其降低 AT
1AmRNA表达 ,
间接阻断 AngⅡ对心脏的作用有关 , 从而达到防治心室重构
的目的。
Rombousts等 [ 7]认为 ALD可能通过上调 AngⅡ 1型受体
(AT1)的表达 , 使 AngⅡ促进心脏成纤维细胞胶原合成的效应
得以增强 。另有证据显示 ALD增加了血管内血管紧张素转
化酶(ACE)的表达 , 从而导致 AngⅡ的含量增加 [ 8] 。本次实
验观察到 ALD与 AngⅡ(r=0.97), 及 AT1A mRNA(r=0.87)
均呈明显的相关性 , 证实了上述说法 。 玄参可明显降低 ALD
含量 , 这可能也是其抑制 AngⅡ含量增加从而防治心室重构
的作用机制之一 。
玄参抗心室重构的作用值得进一步研究 , 其作用机制还有待
进一步地阐明。
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LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2008 VOL.19 NO.7 时珍国医国药 2008年第 19卷第 7期