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小花棘豆中毒对和田羊瘤胃溶纤维丁酸弧菌的影响



全 文 :西北农业学报 2015,24(12):40-45
Acta Agriculturae Boreali-occidentalis Sinica  doi:10.7606/j.issn.1004-1389.2015.12.006
网络出版日期:2015-12-21
网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20151221.1829.012.html
小花棘豆中毒对和田羊瘤胃溶纤维丁酸弧菌的影响
收稿日期:2015-01-10  修回日期:2015-06-12
基金项目:国家自然科学基金(31460678);新疆生产建设兵团博士资金专项(2008JC07)。
第一作者:贾琦珍,女,硕士,助理研究员,从事动物病理学研究。E-mail:xiaxue1984521@126.com
通信作者:王 帅,男,硕士,实验师,从事牧草资源开发利用研究。E-mail:wangshuaidky@126.com
贾琦珍1,2,陈根元2,3,邓 利3,王 帅2,3
(1.塔里木大学 生命科学学院,新疆阿拉尔 843300;2.新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室,
新疆阿拉尔 843300;3.塔里木大学 动物科学学院,新疆阿拉尔 843300)
摘 要 通过研究小花棘豆(Oxytropis glabra DC)对和田羊瘤胃溶纤维丁酸弧菌数量的影响,探讨小花棘豆
中毒对绵羊纤维素降解效率的影响。将12只和田羊随机分为对照组、试验Ⅰ组和试验Ⅱ组。试验组分别按
10g/kg和20g/kg的剂量饲喂小花棘豆,至典型临床症状出现为止。攻毒前及攻毒后每隔7d取瘤胃液,利
用巢式PCR技术检测瘤胃液中溶纤维丁酸弧菌数量的变化,并检测甘油三酯消失率和纤维素降解率。结果
显示,与对照组相比,试验羊瘤胃液中溶纤维丁酸弧菌数、甘油三酯消失率和纤维素降解率均极显著下降。试
验表明,小花棘豆中毒可显著影响和田羊瘤胃溶纤维丁酸弧菌数量和纤维素降解能力,且具有一定的时间和
剂量效应关系。
关键词 小花棘豆;和田羊;瘤胃;溶纤维丁酸弧菌
中图分类号 S823   文献标志码 A     文章编号 1004-1389(2015)12-0040-06
  和田羊是新疆和田地区的主要放牧品种,占
该地区绵羊存栏总数的70.97%,高度适应南疆
地区的荒漠性生态气候,具有耐热、耐旱和耐粗饲
等特点[1]。小花棘豆(Oxytropis glabra DC)是
和田地区广泛分布的有毒植物,因其具有根系发
达、抗逆能力强的特点,目前已成为和田草原的优
势种群。在牧草缺乏的冬春季,当放牧家畜大量
采食,就会引起中毒甚至死亡[2]。目前,和田羊小
花棘豆中毒已严重影响和田地区畜牧业的可持续
发展。但国内外对和田羊小花棘豆中毒的报道较
少,且集中在病理学[3]和血液生理生化指标[4-5]等
方面,小花棘豆中毒对绵羊瘤胃纤维素降解能力
的研究未见报道[6]。溶纤维丁酸弧菌 (Bu-
tyrivibrio fibrivolen)是反刍动物瘤胃内广泛存
在的一种纤维素降解菌,对瘤胃正常的发酵和代
谢具有重要意义。本试验拟通过研究小花棘豆中
毒和田羊瘤胃溶纤维丁酸弧菌数量以及纤维素降
解能力的变化,探讨小花棘豆中毒对和田羊降解
纤维素的影响,为和田羊小花棘豆中毒的进一步
研究及综合防治提供依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
小花棘豆2014年8月采集于新疆和田地区
策勒县恰哈乡,由塔里木大学动物科学学院草业
科学学科组鉴定。取植株的地上部分,阴干、保存
备用。
DNA提取试剂盒,普通PCR扩增试剂盒,均
为美国Thermo;甘油三酯消失率试剂盒,由中生
北控生物科技股份有限公司提供,其余试剂均为
国产分析纯;实验室用水为超纯水。
5331 型 PCR 仪,德 国 Eppendorf 公 司;
DYY-Ⅱ型电泳仪,北京六一仪器厂;GELDOC-
IT型凝胶成像分析仪,美国 UVP公司;VetTest
8008型生化分析仪,北京安普生化科技有限
公司。
1.2 试验动物
和田羊12只,2周龄,体质量为32kg±1.4
kg购自和田市策勒县。试验羊临床观察7d,驱
除体表及体内寄生虫后随机分为对照组、试验Ⅰ
组和试验Ⅱ组,每组4只。所有羊自由采食青干
草,每只每日补饲精料300g,试验组分别按10
g/kg和20g/kg的剂量饲喂小花棘豆草粉,每天
饲喂3次,饲喂时间为08:00-09:00、14:00-
15:00、19:00-20:00,自行采食完后饲喂青干草,
自由饮水。
1.3 瘤胃液的采集与处理
试验前及试验后每隔7d,在中午限制饲喂之
后(16:00-17:00)采集试验羊瘤胃液,直至试验
Ⅱ组和田羊出现死亡为止,共采瘤胃液7次。采
集方法为将试验羊保定后口腔插管抽取瘤胃液。
每只羊采集20mL,其中10mL于-80℃保存以
备溶纤维丁酸弧菌数量检测;另外10mL瘤胃液
进行体外培养,检测甘油三酯消失率和纤维素降
解率。
1.4 瘤胃溶纤维丁酸弧菌数量检测
1.4.1 瘤胃溶纤维丁酸弧菌DNA的提取 将
瘤胃液使用200目纱布过滤,然后将滤液12 000
r/min离心10min,弃去上清液,在沉淀中加入等
体积裂解液,振荡1min后在100℃下煮10min,
混合物12 000r/min离心10min,然后取上清液
再次12 000r/min离心10min,最后取约400μL
上清液作为PCR扩增模板。
1.4.2 引物设计与合成 引物的设计与合成参
考沈建昭等[7]的方法,具体设计见表1。引物经
Primer-Blast设计,由宝生物工程(大连)有限公
司合成。
表1 引物设计
Table 1 Primer design
项目
Item
引物序列5′→3′
Primer sequences
产物大小/bp
Product size
外引物
Extrinsic
primer
上游FP:TGTCGTGAGATGTTGGGTT
下游RP:CCTCCTTACGGTTGGGTC 387
内引物
Inner
primer
上游FP:ATTTCGGATGGGCACTCT
下游RP:GCTTCCCTTTGTTTACGC 127
1.4.3 巢式PCR反应体系和条件 以微生物
DNA为模板、以外引物进行PCR扩增,其反应程
序为94℃预变性10min;94℃变性40s,54℃
退火30s,72℃延伸30s,反应30个循环,72℃
最终延伸7min。再以扩增产物为模板、以内引
物进行巢式第 2 轮 PCR 扩增,其反应程序为
94℃预变性10min;94℃变性40s,52.4℃退
火30s,72℃延伸30s,反应30个循环,72℃最
终延伸5min。然后琼脂糖凝胶电泳检测 PCR
扩增终产物。巢式PCR反应体系见表2。
表2 巢式PCR反应体系
Table 2 Nested PCR reaction system
项目
Item
体积/μL
Volume
PCR Master  12.5
模板DNA Template DNA  5.0
上游引物/(10μmol/L) Forward primer  0.5
下游引物/(10μmol/L) Reverse primer  0.5
ddH2O 6.5
合计Total  25.0
1.4.4 溶纤维丁酸弧菌数量测定 采用凝胶成
像系统采集琼脂糖电泳图像,BandScan 5.0分析
条带灰度值,并计算溶纤维丁酸弧菌数量。
1.5 纤维素降解率测定
准确称取一定质量的纤维素,用已知质量的
80目尼龙袋包好后放入瘤胃液中培养。培养结
束后取出尼龙袋,用水洗净,65℃烘至恒量。纤
维素降解率计算公式为:纤维素降解率=(培养前
纤维素质量-培养后纤维素质量)/培养前纤维素
质量×100%。
1.6 甘油三酯消失率测定
按照试剂盒说明书,使用全自动生化仪测定。
甘油三酯消失率=(初始量-测定时间的量)/初
始添加量×100%。
1.7 数据分析
使用SPSS 16.0软件中 One-Way ANOVA
方法对试验数据进行单因素方差分析。
2 结果与分析
2.1 引物的可靠性验证
由图1可知,外引物在400bp下方出现387
bp左右的条带,内引物在200bp下方出现127
bp左右的条带,与试验设计的目的条带大小相
符,表明引物设计良好。
2.2 溶纤维丁酸弧菌巢式PCR检测结果
通过2次巢式PCR扩增,产物经琼脂糖凝胶
电泳检验,扩增产物专一且在 100bp左右(图
2)。扩增产物克隆后测序,将测得序列与DDBJ/
EMBL/GenBank DNA数据库序列的同源性进行
分析。结果获得127bp的有效序列,该序列与溶
纤 维 丁 酸 弧 菌 (Butyrivibrio fibrisolvens)
WH-1(EU684229)的16SrRNA 序列有100%
的序列相似性。结果表明,所检测的是目的溶纤
维丁酸弧菌,而且引物扩增的特异性良好。
·14·12期 贾琦珍等:小花棘豆中毒对和田羊瘤胃溶纤维丁酸弧菌的影响
2.3 小花棘豆中毒对溶纤维丁酸弧菌数量的影响
由表3可以看出,小花棘豆中毒可显著影响
和田羊瘤胃液溶纤维丁酸弧菌数量,其中对照组
和田羊试验期内溶纤维丁酸弧菌数量无明显变
化,试验组和田羊瘤胃液中溶纤维丁酸弧菌数量
均呈下降趋势。攻毒前14d试验组和田羊溶
纤维丁酸弧菌数量较对照组差异不显著,第21天
  M.Marker;1.外引物 Extrinsic primer;2.内引物 Inner
primer
图1 引物PCR电泳图
Fig.1 Electrophoresis of PCR products
时,试验组Ⅱ和田羊溶纤维丁酸弧菌数量显著低
于对照组,但试验Ⅰ组与对照组差异不显著;第
28天时,试验Ⅰ组和田羊溶纤维丁酸弧菌数量显
著低于对照,试验Ⅱ组和田羊溶纤维丁酸弧菌数
量极显著低于对照组;第35天起试验组和田羊溶纤
维丁酸弧菌数量均极显著低于对照组,其中试验Ⅱ组
和田羊溶纤维丁酸弧菌数量显著低于试验Ⅰ组。
  M.Marker;1.对照组 Control group;2.试验Ⅰ组 Test
groupⅠ;3.试验Ⅱ组 Test groupⅡ
图2 巢式PCR产物电泳图
Fig.2 Electrophoresis of nested PCR products
表3 小花棘豆中毒和田羊瘤胃液溶纤维丁酸弧菌数(珔x±s)
Table 3 The numbers of Butyrivibrio fibrivolenin rumen of O.glabra DC poisoning Hetian sheep
时 间
Time
对照组
Control group
试验Ⅰ组
Test groupⅠ
试验Ⅱ组
Test groupⅡ
第7天 Day 7  2.57±0.39aA  2.63±0.45aA  2.59±0.43aA
第14天 Day 14  2.49±0.47aA  2.14±0.36aA  2.05±0.39aA
第21天 Day 21  2.51±0.34aA  2.01±0.20abA  1.84±0.35bA
第28天 Day 28  2.60±0.56Aa  1.87±0.38ABb  1.21±0.26Bc
第35天 Day 35  2.58±0.63Aa  1.49±0.22Bb  0.96±0.17Bc
第42天 Day 42  2.61±0.70Aa  1.08±0.20Bb  0.86±0.14Bc
注:同行不同小写字母表示差异显著(P<0.05),不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。下表同。
Note:Different smal letters in the same raw is significant difference(P<0.05),different capital letters is extremely significant difference
(P<0.01).The same as folows.
表4 小花棘豆中毒和田羊瘤胃液纤维素降解率(珔x±s)
Table 4 Celulose degradtion rate in rumen of O.glabra DC poisoning Hetian sheep
时间
Time
对照组
Control group
试验Ⅰ组
Test groupⅠ
试验Ⅱ组
Test groupⅡ
第7天 Day 7  45.75±5.16aA  44.13±4.47aA  44.80±4.89aA
第14天 Day 14  44.50±5.02aA  38.96±4.62abA  34.78±4.75bA
第21天  Day 21  45.15±4.71Aa  31.35±3.98Bb  28.06±3.14Bb
第28天 Day 28  43.26±4.36Aa  26.74±3.10Bb  20.65±3.34Bb
第35天  Day 35  44.84±5.13Aa  24.19±4.33Bb  17.14±3.25Bc
第42天 Day 42  45.22±6.10Aa  22.28±3.24Bb  13.18±2.27Cc
·24· 西 北 农 业 学 报 24卷
2.4 小花棘豆中毒对和田羊纤维素降解率的
影响
由表4可知,对照组和田羊纤维素降解率无
明显变化,试验组和田羊纤维素降解率均有不同
程度的下降。攻毒第14天时试验Ⅱ组和田羊纤
维素降解率即显著低于对照组;从第21天起试验
组和田羊纤维素降解率均极显著低于对照组。这
种趋势一直持续到试验结束。
2.5 小花棘豆中毒对甘油三酯消失率的影响
由表5可知,试验组和田羊瘤胃液中甘油三
酯消失率均有不同程度的下降,而且与溶纤维丁
酸弧菌的变化趋势一致。攻毒第21天时试验组
和田羊甘油三酯消失率均显著低于对照组;第
28天时试验组和田羊甘油三酯消失率均极显著
低于对照组。表明小花棘豆中毒可通过影响瘤胃
中溶纤维丁酸弧菌的数量从而降低甘油三酯降
解率。
表5 小花棘豆中毒和田羊瘤胃液甘油三酯消失率(珔x±s)
Table 5 Triglyceride disappearance rate in rumen of O.glabra DC.poisoning Hetian sheep
时间
Time
对照组
Control group
试验Ⅰ组
Test groupⅠ
试验Ⅱ组
Test groupⅡ
第7天 Day 7  53.62±7.37aA  54.67±8.06aA  53.98±7.79aA
第14天 Day 14  54.15±8.31aA  47.84±7.92aA  46.60±8.86aA
第21天 Day 21  52.38±7.65aA  40.31±7.53bA  37.86±7.94bA
第28天 Day 28  53.90±9.14Aa  36.04±7.81Bb  32.35±6.16Bb
第35天 Day 35  54.77±7.86Aa  31.43±6.43Bb  25.94±6.25Bb
第42天 Day 42  55.35±8.24Aa  32.08±5.75Bb  23.09±5.18Cc
3 讨 论
3.1 小花棘豆中毒对和田羊溶纤维丁酸弧菌的
影响
溶纤维丁酸弧菌在瘤胃中广泛分布,对反刍
动物瘤胃正常的发酵和代谢具有重要意义。研究
表明,该菌具有较高的纤维素降解能力,也具有异
构化和氢化不饱和脂肪酸的功能,其作用十分重
要。溶纤维丁酸弧菌在瘤胃中降解纤维素的代谢
产物多为次级代谢菌的底物,如果其作用受到抑
制,其他细菌的正常代谢也将受到影响。本试验
研究发现饲喂小花棘豆可导致和田羊瘤胃溶纤维
丁酸弧菌数量极显著下降,其原因可能为小花棘
豆毒性物质抑制溶纤维丁酸弧菌的生长。王新
峰[8]研究表明绞股蓝皂甙可显著抑制波尔山羊瘤
胃溶纤维丁酸弧菌的生长,但胡明[9]研究发现苜
蓿皂甙对内蒙古半细毛羊瘤胃溶纤维丁酸弧菌无
明显影响,而王晓霞等[10]研究表明粮中添加无患
子皂甙还可显著提高瘤胃中溶纤维丁酸弧菌的数
量。以上研究表明植物活性成分可对瘤胃溶纤维
丁酸弧菌产生显著影响。小花棘豆化学成分复
杂,含有生物碱、皂甙、黄酮等多种活性成分,王帅
等[6]前期研究表明小花棘豆生物碱可显著影响和
田羊瘤胃微生物数量,本试验中溶纤维丁酸弧菌
数量的下降是小花棘豆单一物质的影响还是多种
活性物质的共同作用,还需要进一步研究证实。
3.2 小花棘豆中毒对和田羊瘤胃液纤维素降解
率的影响
反刍动物虽可利用粗饲料,但其本身并不能
分解纤维素,需依赖于瘤胃内栖居的纤维素降解
菌,主要包括产琥珀酸拟杆菌、黄化瘤胃球菌、白
色瘤胃球菌和溶纤维丁酸弧菌[11]。本试验研究
结果表明小花棘豆中毒可显著降低和田羊瘤胃液
对纤维素的降解率,其原因可能与小花棘豆中毒
导致溶纤维丁酸弧菌数量下降有关。上官京
等[12]研究表明产琥珀酸拟杆菌可有效降解秸秆
等同质异晶体纤维素,是目前研究纤维素酶最重
要的瘤胃菌株,而黄化瘤胃球菌和白色瘤胃球菌
均可有效降解植物细胞壁成分,并可产生木聚糖
酶降解木聚糖,从而在纤维素降解中发挥作
用[13]。王帅等[6]研究发现小花棘豆生物碱可显
著降低和田羊瘤胃中纤维素降解菌数量从而影响
纤维素降解率;王新峰[8]、胡明[9]研究发现外源皂
甙可明显影响波尔山羊和内蒙古半细毛羊瘤胃纤
维素降解菌数量,表明小花棘豆中毒导致的纤维
素降解能力下降可能与试验羊瘤胃纤维素降解菌
的数量减少有关。另外作为瘤胃微生态环境中重
要的组成部分,原虫对维持瘤胃内环境稳定具有
不可替代的作用。Coleman[14]研究认为纤毛虫可
显著影响瘤胃对纤维素的降解作用,瘤胃去除纤
·34·12期 贾琦珍等:小花棘豆中毒对和田羊瘤胃溶纤维丁酸弧菌的影响
毛虫后可导致绵羊纤维素降解率降低50%左右;
王新峰[8]、胡明[9]研究发现外源皂甙可通过抑制
波尔山羊和内蒙古半细毛羊瘤胃中原虫的数量来
影响纤维素降解率;王帅等[6]和张尚昆等[15]均研
究发现小花棘豆中毒可显著降低和田羊瘤胃中纤
毛虫数量,表明小花棘豆可通过抑制瘤胃内纤维
素降解菌和相关原虫而影响和田羊对纤维素的利
用,但其作用机理仍需要进一步研究。
3.3 小花棘豆中毒对和田羊瘤胃液甘油三酯消
失率的影响
研究表明,溶纤维丁酸弧菌为具有降解甘油
酯的菌株,能够降解甘油酯为甘油和脂肪酸。
Kocaman等[16]认为溶纤维丁酸弧菌主要以细胞
结合的形式降解甘油酯,继而进一步氢化、降解和
利用。由于溶纤维丁酸弧菌代谢类型多样,可降
解磷脂,故在牧草脂类的降解中作用较大。本试
验中饲喂小花棘豆导致溶纤维丁酸弧菌数量显著
下降,试验羊瘤胃中甘油三酯降解率显著下降,表
明二者间具有显著的效应关系。沈建昭等[7]研究
发现瘤胃原虫的数量与组成也可影响甘油三酯消
失率,其原因可能与原虫对溶纤维丁酸弧菌的吞
噬有关。另外,小花棘豆毒性成分还可显著影响
和田羊机体血脂含量[5],可能会导致甘油三酯消
失率降低。综上所述,小花棘豆中毒与瘤胃甘油
三酯消失率的关系较为复杂,其对溶纤维丁酸弧
菌产生主要影响作用的方式、剂量等未见研究报
道。因此,小花棘豆中毒对溶纤维丁酸弧菌的影
响规律和机制还需深入研究。
4 结 论
小花棘豆中毒可显著降低和田羊瘤胃液中的
溶纤维丁酸弧菌数量,并导致和田羊纤维素降解
率和甘油三酯消失率的下降。表明小花棘豆中毒
可显著影响和田羊瘤胃溶纤维丁酸弧菌数量和饲
料利用率,而且具有一定的时间和剂量效应关系。
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Effects of Oxytropis glabra DC Poisoning on Butyrivibrio
fibrivolenin Rumen of Hetian Sheep
JIA Qizhen1,2,CHEN Genyuan2,3,DENG Li 3 and WANG Shuai 2,3
(1.Colege of Life Science,Tarim University,Alar Xinjiang 843300,China;2.Key Laboratory of Tarim Animal Husbandry
Science and Technology,Xinjiang Production &Construction Corps,Alar Xinjiang 843300,China;
3.Colege of Animal Science,Tarim University,Alar Xinjiang 843300,China)
Abstract The study is to investigate the effects of Oxytropis glabra DC poisoning on Butyrivibrio
fibrivolen number in rumen,and to reveal the toxicity mechanism of O.glabra DC in future.12He-
tian sheep were divided into three groups(the control group and experimental groupⅠ,Ⅱ),and two
experimental groups were fed with O.glabra DC at 10g/kg and 20g/kg respectively everyday during
the test period.The sheep consumed the forages freely until typical symptoms appeared.Before and
after 7days of chalenge test,rumen liquid was colected and Butyrivibrio fibrivolen number were
test with nested PCR,then triglyceride disappearance rate and celulose degradation rate were meas-
ured.The results demonstrated that the number of Butyrivibrio fibrivolen,triglyceride disappear-
ance rate and celulose degradation rate in experimental groups were significantly lower than in normal
control group.O.glabra DC poisoning had remarkable effects on Butyrivibrio fibrivolen number in
rumen of Hetian sheep,which was related to time and dosage.
Key words Oxytropis glabra DC;Hetian sheep;Rumen;Butyrivibrio fibrivolen
Received 2015-01-10    Returned 2015-06-12
Foundation item The National Natural Science Foundation of China(No.31460678);Doctoral Fund
of Xinjiang Production &Construction Corps(No.2008JC07).
First author JIA Qizhen,female,master,assistant research felow.Research area:animal pathology.
E-mail:xiaxue1984521@126.com
Corresponding author WANG Shuai,male,master,experimentingist.Research area:forage develop-
ment and utilization.E-mail:wangshuaidky@126.com
·54·12期 贾琦珍等:小花棘豆中毒对和田羊瘤胃溶纤维丁酸弧菌的影响