全 文 ：　　辽宁大学学报
　　　自然科学版
第 35卷　第 3期　 2008年
JOURNALOFLIAONINGUNIVERSITY
　　　　　NaturalSciencesEdition
　　　　　　Vol.35　No.3　 2008
HPLC法测定小花棘豆中野决明碱含量的研究
康平利＊ ,姜玉春 ,邢志强 ,李　凯
(辽宁大学 化学院 ,辽宁 沈阳 110036)
摘　要:目的 建立小花棘豆中主体毒性物质野决明碱含量的 HPLC测定方法.方法 采用高效液相色谱法 ,
色谱柱:ODS-C18(250mm×4.0mm, 5μm);柱温为 30℃ .流动相 A∶甲醇 , 流速为 0.4mL· min-1;流
动相 B:0.5%柠檬酸钠 +0.5%磷酸二氢钠 , 流速为 0.6 mL· min-1;检测波长为 254 nm.结果 野决明碱
含量与对应的色谱峰面积在 0.005 ～ 0.04mg.mL-1范围内具有良好的线性关系 , r=0.996 1;平均回收率
为 101.91%,精密度为 RSD=0.42%(n=5).结论 本方法可有效地用于测定小花棘豆中野决明碱的含量 ,
是一种准确 、灵敏 、可靠的分析方法.
关键词:HPLC;小花棘豆;野决明碱.
中图分类号:R917　　文献标识码:A　　文章编号:1000-5846(2008)03-0271-03
　　小花棘豆(OxytropisglabraDC)俗称醉马草 ,
系豆科(Leguminosae)棘豆属多年生草本植物.民
间用作关节痛 、牙痛 、神经衰弱及皮肤瘙痒等疾病
的治疗 ,具有麻醉 、镇静 、止痛之功效.该植物广泛
分布于我国内蒙 、陕西 、宁夏 、新疆等省区的沙漠
草原 ,具有根系发达 ,耐干旱等特点.此草具有不
良气味 ,在正常情况下 ,牲畜不愿采食.每逢旱年 ,
其它牧草生长不良时 ,此草却极为茂盛.牲畜一旦
采食即逐步成瘾 ,专觅该草 ,从而造成大批家畜中
毒死亡 [ 1] .因此 ,能否解决家畜的小花棘豆中毒
问题 ,直接关系到小花棘豆分布地的畜牧业发展.
此外 ,小花棘豆虽是毒草 ,同时又具有很高的营养
价值(含粗蛋白 12% ～ 17%),如能去毒利用 ,可
为干草地区开发一种优良饲草 ,具有巨大的经济
效益和社会效益.
国内早在 20世纪 70年代就开始了小花棘豆
的研究 ,近期的研究发现小花棘豆中的生物碱大
多具有较强生理活性[ 2] .生物碱或含生物碱的提
取物已广泛用于医药领域 ,该类生物碱具有抗癌 、
抗心率失调 、抗微生物 、抗溃疡 、升高白细胞等多
方面的药理作用 ,特别是该类化合物较强的抗癌
活性已引起人们很大的兴趣.因此对生物碱进行
快速 、灵敏 、可靠的定性 、定量分析一直是受人瞩
目的研究课题 [ 3] .其中 HPLC法由于其具有较高
效的分离效能 ,较宽的适用范围及条件优化的灵
活性等优点在生物碱分析中得到广泛应用 [ 4] .
小花棘豆中毒性物质野决明碱的含量是衡量
不同地区小花棘豆毒性的重要指标 ,对其进行定
量的方法也有一些 ,但未见有关利用 HPLC方法
对其进行测定的报道.本文主要就小花棘豆的总
生物碱的提取及其中的有毒成分———野决明碱的
HPLC分析进行了研究 [ 5, 6] .
1　材料与方法
1.1　实验材料
1.1.1　主要仪器
高效液相色谱仪 , 525型紫外检测器(美国科
学仪器公司);分析之星数据处理系统.CXF-500
超声波除气仪(北京清华大学);80-2型离心沉
淀机(上海手术器械厂);ZX-1型旋片式真空泵
＊ 作者简介:康平利(1969-),男 ,辽宁沈阳人 ,实验师 ,从事色谱仪器的应用与研究.
　收稿日期:2007-12-05
(沈阳真空泵厂);AD-1型全自动微量天平(美
国 PE公司).
1.1.2　主要试剂
甲醇 、乙醇 、乙腈为色谱纯;柠檬酸钠 、磷酸二
氢钠 、氯仿 、硫酸均为分析纯.野决明碱标样(上
海博蕴生物公司).
1.1.3　小花棘豆
小花棘豆地上部分由沈阳药科大学天然药物
室提供.
2　方法与结果
2.1　色谱条件
色谱柱 ODS-C18(250 mm×4.0 mm),检测
波长 254 nm;流动相 A液:甲醇 ,流速:0.4 mL/
min;流动相 B液:0.5%柠檬酸钠 +0.5%磷酸二
氢钠;流速:0.6 mL/min;柱温:30 ℃.
2.2　小花棘豆生物碱的提取
称取 100 g粉碎好的小花棘豆 , 置于 1 000
mL的浸取装置中 , 再加入 500 mL混合浸取液
(3%稀 H2SO4和 40%乙醇混合液),加热浸取
120min,滤出滤液 ,然后加入 300 mL浸取液 ,再
次回流浸取 60min,合并溶液 ,弃去残渣.实验中
总计浸取 500 g小花棘豆.浸出液用离心分离(2
500r/min),将不溶于酸的酸性物质和蛋白质除
去.将离心液蒸馏 ,回收乙醇 ,最后得 1 000 mL的
浸取液.用浓氨水调节浸取液酸度 ,当 pH=1 ～ 2
时 ,又有大量酸性物质析出 ,离心分离 (2 500 r/
min),得到小花棘豆生物碱溶液 ,用浓氨水调 pH
至 8 ～ 10,再用氯仿多次萃取 ,合并氯仿溶液 ,减
压回收氯仿得生物碱.挥发至干得生物碱 7.28g,
提取率为 1.46%.
2.3　标准工作曲线的绘制
用微量天平准确称取 2.50 mg标样 ,加入 25
mL甲醇溶解 ,配制成 0.10 mg/mL的生物碱标准
储备液.配制浓度分别为 0.005mg/mL;0.01 mg/
mL;0.02 mg/mL;0.03 mg/mL;0.04 mg/mL标准
甲醇溶液 10mL.以峰面积(Y)对进样量(X)进行
线性回归 ,得回归方程:Y=1.16×107X-8.27 ×
10
3 ,相关系数 r=0.996 1;线性范围 0.019 ～ 0.
580μg.
2.4　样品的测试
取提取的小花棘豆生物碱 1.02 mg用 10 mL
甲醇溶解后(浓度为 0.102 mg/mL)直接注入液
相色谱仪 ,进样量为 10 μL.得到色谱图 ,见图 1.
用标准物质(野决明碱)的色谱图对比 ,照上述的
色谱条件 ,外标法进行测定 ,保留值法定性 ,很容
易确定样品的色谱图中的 3号色谱峰(保留时间
tR=8.04min;峰面积 Area=62 457)就是所要分
析的野决明碱.以外标法定量 ,计算出野决明碱的
量为 0.061 μg,进一步计算得到野决明碱在小花
棘豆中的含量为 0.086%,在小花棘豆生物碱中
的含量为 5.98%.
3-野决明碱　　　　1, 2, 4-未鉴定化合物
3-thermopsine　　 1, 2, 4-unidentifiedcompounds
图 1　小花棘豆生物碱的 HPLC图
2.5　精密度试验
用微量进样器分别进 20 μL(液相色谱仪的
定量管为 10 μL)0.102 mg/mL小花棘豆生物碱
甲醇溶液 ,同样的色谱条件 5次测定 ,求得峰面
积 , RSD为 0.42%.
2.6　回收率试验
取 0.102 mg/mL小花棘豆生物碱甲醇溶液
加入等体积的 0.02 mg/mL野决明碱标准溶液 ,
同样的色谱条件 10μL进样 5次测定 ,测定结果
的回收率为 101.91%,
3　讨论
3.1　浸取液选择
人们常用醇 、苯 、稀酸浸取生物碱 ,鉴于苯毒
性较大 ,稀酸沸点较高 ,易破坏有机化合物 ,故我
们选择稀 H2SO4和乙醇混合浸取液(3%H2SO4 +
40%乙醇),实验结果表明浸取效果很好 ,兼有酸
浸 、醇浸两特点.乙醇不仅降低了浸取温度(85
℃),同时在沸腾时也起到了充分搅拌的作用.
3.2　流动相选择
对于 ODS-C18键合反相色谱 ,普遍存在色谱
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峰的展宽拖尾 ,导致分离效能低 ,这主要缘于生物
碱结构中碱性氮原子与固定相未键合酸性硅醇基
的相互作用 ,即使是所测生物碱在较低浓度下 ,仍
常产生峰漂移及峰对称性差等现象 [ 7] .针对此缺
陷 ,流动相中缓冲盐[ 8]的使用 ,本文比较以甲醇
与无机盐(0.5%柠檬酸钠 +0.5%磷酸二氢钠;
1%柠檬酸钠 +1%乙氰;2%柠檬酸钠 +1%乙
氰)溶液为流动相 ,以 3号峰与 4号峰的分离系数
来考查流动相的性能 ,得出以甲醇与无机盐(0.
5%柠檬酸钠 +0.5%磷酸二氢钠)为流动相的分
离系数最大 ,获得很好的分离效果.
3.3　工作波长选择
注射进 10μL浓度为 0.02mg/mL生物碱标
样 ,改变检验器波长 ,选择色谱峰面积最大时对应
的波长 ,最后选择 254nm为工作波长.
参 考 文 献 :
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DeterminationofThermopsineContentin
OxytropisGlabraDCbyHPLC
KANGPing-li, JIANGYu-chun, XINGZhi-qiang, LIKai
(ColegeofChemistry, LiaoningUniversity, Shenyang110036, China)
Abstract:　ObjectiveToestablishamethodforthedeterminationoftheprimarypoisonoussubstance-ther-
mopsineinoxytropisglabraDCbyHPLC.MethodsAnalyseswerecariedoutonODS-C18(250 mm×4.0
mm, 5 μm)column.MobilephaseA:methanol, theflowrate0.4 mL· min-1;mobilephaseB:0.5% so-
diumcitrate+0.5% sodiumdihydrogenphosphate, theflowrate6mL·min-1.Thecolumntemperaturewas
30 ℃.TheUVdetectionwavelengthwassetat254nm.ResultsThestandardcurvewaslinearintherangeof
0.005 ～ 0.04 mg· mL-1 , thecorespondingcorelationcoeficientr=0.9961;theaveragedrecoverieswas
101.91% andtheprecisionRSDwas0.42%(n=5).ConclusionsThemethodisaccurate, sensitive, andre-
liable.AnditcouldbeavailablyappliedtodeterminethermopsinecontentinoxytropisglabraDC.
Keywords:　HPLC;OxytropisglabraDC;Thermopsine.
(责任编辑　李　超)
273　　　　　　第 3期　　　　　　　　　康平利 ,等:HPLC法测定小花棘豆中野决明碱含量的研究