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樟叶越桔糖基转移酶VdUGT1基因克隆及序列分析



全 文 :Vol. 35 No. 6
Jun. 2015
第 35卷 第 6期
2015年 6月
中 南 林 业 科 技 大 学 学 报
Journal of Central South University of Forestry & Technology
收稿日期:2014-12-03
基金项目:云南省高校林下生物资源保护及利用科技创新团队项目;云南省优势特色重点学科生物学一级学科建设项目(50097505);
国家自然科学基金(21462040, 31460076)
作者简介:宋 健,硕士研究生 通讯作者:丁 勇,高级实验师,硕士生导师,E-mail:dingyong@swfu.edu.cn
引文格式:宋 健 ,熊 宏 ,朱东阳 ,等 . 樟叶越桔糖基转移酶 VdUGT1基因克隆及序列分析 [J].中南林业科技大学学报 , 2015, 35(6):
80-86.
Doi:10.14067/j.cnki.1673-923x.2015.06.015 http: //qks.csuft.edu.cn
糖基转移酶(glycosyltransferases,GTs;EC
2.4.x.y)是所有生物有机体中存在的专门负责催化
糖基化反应的酶,它能将活性糖基从供体分子转
移到受体分子上 [1]。植物中常见的糖基供体是尿
嘧啶核苷二磷酸(Uridine diphosphate,UDP)糖(葡
萄糖、半乳糖、木糖和鼠李糖等)[2-5],因此 GTs
也被称为尿嘧啶核苷二磷酸糖基转移酶(UDP-
glycosyltransferases,UGTs)。糖基化受体包括次
级代谢产物、激素、病原菌侵染物、以及内外源
毒性物质等植物小分子化合物 [4-5]。糖基化是植物
樟叶越桔糖基转移酶 VdUGT1 基因克隆及
序列分析
宋 健 1,熊 宏 1,朱东阳 2,赵 平 2,杜 维 1,刘小烛 1,丁 勇 1
(1. 西南林业大学生命科学学院,云南 昆明 650224;
2. 西南林业大学 西南山地森林资源保育与利用省部共建教育部重点实验室,云南 昆明 650224)
摘 要:根据樟叶越桔 Vaccinium dunalianum叶芽转录组测序实验获得的糖基转移酶 VdUGT1基因部分 cDNA
序列设计引物,采用 RACE-PCR技术克隆了全长 1 620 bp cDNA序列的 VdUGT1基因,包括 1 398 bp cDNA序
列的完整开放阅读框,推测编码由 465个氨基酸残基组成、相对分子质量为 50.89 kD的糖基转移酶 VdUGT1。
序列分析表明,VdUGT1理论等电点为 5.53,负电荷残基(Asp+Glu)总数为 53个,正电荷残基 (Arg+Lys)总
数为 41个,不稳定系数为 48.38,属于不稳定蛋白;其二级结构的主要构件为α-螺旋和随机卷曲,无跨膜结构域,
属于亲水性蛋白质。VdUGT1位于 C末端含有尿嘧啶核苷二磷酸糖基转移酶所特有 UDPGT功能域,推测与尿
嘧啶核苷二磷酸糖的结合有关。该研究为后期 VdUGT1的异源表达和功能研究奠定了基础。
关键词:樟叶越桔;尿嘧啶核苷二磷酸糖基转移酶;RACE;基因克隆;序列分析
中图分类号:S759.95;S663.9 文献标志码:A 文章编号:1673-923X(2015)06-0080-07
Cloning and sequence analysis of Glycosyltransferase gene VdUGT1 in
Vaccinium dunalianum
SONG Jian1, XIONG Hong1, ZHU Dong-yang2, ZHAO Ping2, DU Wei1, LIU Xiao-zhi1, DING Yong1
(1. College of Life Sciences, Southwest Forestry University, Kunming 650224, China; 2. Key Lab. for Forest Resources Conservation
and Use in Southwest Mountains of China, Ministry of Education, Southwest Forestry University, Kunming 650224, China)
Abstract: Based on the partial cDNA of gene VdUGT1 isolated by transcriptome sequencing from V. dunalianum in previous study,
the full-length cDNA comprised 1 620 nucleotides consisting of an open reading frame of 1398 nucleotides was cloned by RACE-PCR
from V. dunalianum. The open reading frame encoded a putative VdUGT1 comprising 465 amino acid residues with molecular weight of
50.89 kD and isoelectric point of 5.53. The sequence analysis showed that the total numbers of negative charged residues (Asp+Glu) and
charged residues (Arg+Lys) in VdUGT1 were 53 and 41, respectively. VdUGT1 with unstable coeffi cient 48.38 belongs to the unstable
protein. It was predictive VdUGT1 had no signal peptide and transmembrane structure. The main parts of predicted secondary structures
of VdUGT1 were α-helices and random coils. UDPGT domain, a characteristic functional domain of UDP-glycosyl- transferases existing
in the near C-terminus of VdUGT1 plays an important role in combining with UDP-sugar. The results established a foundation for the
heterologous expression and functional analysis of VdUGT1in the later period.
Key words: Vaccinium dunalianum; UDP-glycosyltransferase; RACE; gene cloning; sequence analysis
81第 35卷 中 南 林 业 科 技 大 学 学 报
小分子化合物较普遍的一种修饰反应,可以改变
受体分子的化学稳定性、亲水性、转运性、亚细
胞定位,有助于其在细胞内和生物体内的运输和
贮藏 [6]。UGTs具有多种生物活性与功能,可催化
多种底物,其在植物生长发育、代谢调节、解除
内外源毒素毒性、以及次生代谢产物合成与贮存
等方面发挥重要功能 [7]。
樟叶越桔 Vaccinium dunalianum为杜鹃花科
Ericaceae越桔属 Vaccinium植物。Zhao[8]等发现云
南省野生樟叶越桔是一种富含熊果苷(arbutin,
对 -羟基苯 -β-D-吡喃葡萄糖苷)及其衍生物的
特殊资源植物。天然熊果苷是植物体内的对苯二
酚和 UDP葡萄糖在 UGTs成员之一熊果苷合成酶
(arbutin synthase)(EC2.4.1.-)的催化下生物合
成而来。推测樟叶越桔中存在高活性表达的糖基
转移酶 VdUGT家族,并提示酶基因及其表达产物
在该植物生长发育中具有某种重要的、不可或缺
的生物学功能。
UGTs在拟南芥 Arabidopsis thaliana[6]、蛇根
木 Rauwolfi a serpentina[9]、小立碗藓 Physcomitrella
patens 和江南卷柏 Selaginella moellendorffii[10]、
山葡萄 Vitis amurensis[11]、水稻 Oryza sativa ssp.
Japonica[12]、以及鹰嘴豆 Cicer arietinum[13]等物种
中都有一定的研究,所对应的基因均已被克隆并
测序。但目前尚无樟叶越桔糖基转移酶及其基因
的相关报道。本研究根据前期樟叶越桔叶芽转录
组测序实验得到的 VdUGT1基因部分 cDNA序列
设计引物,结合 RACE-PCR技术克隆了 VdUGT1
基因全长 cDNA序列,并对 VdUGT1蛋白特性进
行了分析。
1 试验材料与方法
1.1 试验材料与试剂
供试樟叶越桔 Vaccinium dunalianum Wight
叶芽材料采自云南省楚雄彝族自治州武定县高
桥镇唐家村(海拔 2 100 m,北纬 25°57′、东经
102°24′)。取樟叶越桔新鲜叶芽置于液氮中速冻,
带回实验室后保存于 –80℃冰箱中备用。
植物总 RNA提取试剂盒购自 Omega公司,
RACE-PCR试剂盒购自 Clontech公司,逆转录试
剂和 pMD18-T载体购自宝生物工程有限公司,
胶回收试剂盒购自天根生化科技有限公司,其他
相关试剂购自昆明滇工科技有限公司,大肠杆菌
DH5α为本实验室保存菌种。
1.2 试验方法
1.2.1 总 RNA提取与检测
参照朱东阳等 [14]方法提取樟叶越桔叶芽总
RNA,分别用紫外分光光度计法和 1.2%琼脂糖凝
胶电泳法检测总 RNA样品的纯度和完整性。
1.2.2 樟叶越桔 VdUGT1基因全长 cDNA克隆
根据本课题组前期樟叶越桔叶芽转录组测序
获得的 VdUGT1基因部分 cDNA序列设计 RACE
引物,引物合成由上海生物工程有限公司完成。
3-RACE引物包括反转录引物Adaptor-Oligo(dT)
17:5-CCAGTGAGCAGAGTGACGAGGACTCGA
GCTCAAGC(dT)17-3,接头外侧和内侧引物分
别为 AP-Outer:5-CCAGTGAGCAGAGTGACG-3′
和 AP-Inner:5-GAGGACTCGAGCTCAAGC-3′,
特异性外侧和内侧引物分别为 3′-GS-Outer:
5 ′-GCCCTTCTACCAAGTCCAG-3 ′ 和 3 ′-GS-
Inner:5-CACCCTCACCGTAAATCGC-3′,第一链
cDNA合成按照 RNA反转录试剂盒说明书进行操
作。二轮 PCR反应程序为:94℃预变性 3 min;
94℃变性 30 s,53℃退火 30 s,72℃延伸 1 min,
35个循环;72℃延伸 10 min。
根 据 VdUGT1 基 因 已 知 EST 和 3′RACE-
PCR 克 隆 的 3′ 末 端 cDNA 序 列, 设 计 5′-
RACE 特 异 性 巢 式 引 物 5′-GS-Outer:
5′-CAAGAACCCGCCCGTACCCGT-3′ 和 5′-GS-
Inner:5′-GAGGGTAGTTTGGGTATTGGACGG-3′,
按照 RACE试剂盒说明书进行操作。第一轮
Touchdown-PCR反应程序为:94℃预变性 3 min,
94℃变性 30 s,78℃退火 30 s,72℃延伸 2 min,
8个循环,每个循环退火温度降低 1℃;94℃变性
30 s,70℃退火 30 s,72℃延伸 2 min,30个循环。
第二轮 PCR反应程序为:94℃预变性 3 min;94℃
变性 30 s,70℃退火 30 s,72℃延伸 1 min,35个
循环;72℃延伸 10 min。
1.2.3 PCR产物检测、回收、T/A克隆与测序
P CR产物在 1.2%的琼脂糖凝胶上电泳检测,
回收目的片段并连接到 pMD18-T载体上,将重组
子转化大肠杆菌 DH5α感受态细胞,随机筛选白
色菌落,由上海生工生物工程技术服务有限公司
完成阳性克隆测序。
1.2.4 VdUGT1的生物信息学分析
采用 NCBI提供的 ORF fi nder程序分析基因
开放阅读框;DNAMAN构建 ORF核苷酸序列并
推导其氨基酸序列;利用 ExPASy ProtParam程
序分析氨基酸的残基数目与组成、相对分子质
宋 健,等:樟叶越桔糖基转移酶 VdUGT1基因克隆及序列分析82 第 6期
量、理论等电点和稳定性;利用 NCBI Blast程
序对推导的蛋白质进行相似性比较,Clustalx2和
Jalview软件对同源性高的序列进行多序列比对,
MEGA4.1分子进化遗传分析软件通过邻位相连法
(Neighbor-joining)构建系统发生树,系统树每个
统计学显著性分析以自展法(Boot-strp)进行检验,
重复 1 000次 [15];使用 Siganal V4.0 (http://www.
cbs. dtu.dk/services/SignalP-2.0/)分析蛋白信号肽;
使 用 TMHMM(http://www.cbs. dtu.dk/services/
TMHMM) 和 Proscale(http://www.expasy.org/cgi-
bin/protscale.pl)分别检测其跨膜结构和亲水 /疏水
性特性;利用 SOPMA程序(http://npsapbil.ibcp.fr/
cgi-bin/npsa_automat.pl? page=/NPSA/ npsa_sopma.
html)预测蛋白质序列的二级结构;使用 NCBI提
供 的 Conserved Domain Search (CD-Search) 服
务 器(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/
wrpsb.cgi)进行蛋白功能域分析。
2 结果与分析
2.1 樟叶越桔 VdUGT1基因 cDNA全长克隆
本实验获得的樟叶越桔叶芽总 RNA的 28S和
18S rRNA条带清晰完整,亮度比约为 2∶ 1,无
弥散拖尾且点样孔无污染,总 RNA的 A260/A280
值处于 1.8~ 2.0之间。以提取的总 RNA反转录合
成的第一链 cDNA为模板进行 RACE-PCR扩增,
得到樟叶越桔 VdUGT1基因 3末端 cDNA和 5末
端 cDNA(图 1),经回收主条带、TA克隆测序长
度分别为 1 315 bp和 242 bp,最终拼接得到樟叶越
桔 VdUGT1基因全长 cDNA序列为 1 620 bp。
2.2 序列分析
克隆的樟叶越桔 VdUGT1基因 mRNA序列
长 1 620 bp,包括 57 bp 5UTR、1 398 bp ORF和
165 bp 3UTR,推测编码由 465个氨基酸组成的
VdUGT1蛋白。VdUGT1基因 ORF序列及其推导
的蛋白序列如图 2所示。蛋白质理化性质分析结
果显示 VdUGT1蛋白相对分子质量为 50.89 kD,
氨基酸总数为 465个,理论等电点为 5.53,负电
荷残基(Asp+Glu)总数为 53个,正电荷残基
(Arg+Lys)总数为 41个,不稳定系数为 48.38,
推测 VdUGT1属于不稳定蛋白质。
M为 DNA2000分子量标准
图 1 樟叶越桔VdUGT1基因 3’RACE(A)和 5’ RACE(B)
PCR产物琼脂糖凝胶电泳图
Fig.1 Agrose gel electrophoresis analysis of VdUGT1
3’RACE (A) and 5’ RACE (B) PCR products
图 2 VdUGT1 ORF核苷酸序列及其推导的氨基酸序列
Fig.2 Nucleotide and deduced amino acid sequences of VdUGT1 ORF
同源性分析结果显示 VdUGT1与枸杞 Lycium
barbarum(LbUGT,AB360632.1)、 蛇 根 木 R.
Serpentine(RsUGT,AJ310148.1)、番茄 Solanum
lycopersicum(SlUGT,XM_004231159.1)等的糖
83第 35卷 中 南 林 业 科 技 大 学 学 报
基转移酶之间具有 48%~ 64%的序列同源性,其
中与枸杞 LbUGT和蛇根木 RsUGT同源性分别高
达 64%和 63%。类似于其他物种的糖基转移酶,
樟叶越桔 VdUGT1位于 C末端含有尿嘧啶核苷二
磷酸糖基转移酶所特有 UDPGT功能结构域 PSPG
CpGT(仙客来,AB294396.1);FkUGT(连翘,AB524715.1);FvGT(野草莓,XM_004306644.1);HpUGT(绿毛山柳菊,EU561016.1);LbUGT(枸
杞,AB360632.1);MtGT(苜蓿,XM_003626508.1);RcUGT(蓖麻,XM_002533865.1);RsUGT(蛇根木,AJ310148.1);SgUGT2(罗汉果,
HQ259621.1);SgUGT3(罗汉果,HQ259622.1);SlGT(番茄,XM_004231159.1);VvGT(葡萄,XM_002280887.2);PSPG box:高保守结构域
图 3 VdUGT1和其他植物 GTs的氨基酸序列比对
Fig.3 Alignment of deduced amino acid sequences of VdUGT1 and GTs gene from other plants
box(图 3)。对图 3中显示的不同物种的 GTs进
行系统发生分析,结果显示樟叶越桔 VdUGT1
与 罗 汉 果 SgUGT2(HQ259621.1) 和 SgUGT3
(HQ259622.1)聚为一分支(图 4)。
信号肽是分泌性蛋白 N端的一段氨基酸序列,
是指导分泌性蛋白合成的最重要因素,一般有 16~
26个氨基酸残基,在完成自己的功能后被切除 [16]。
VdUGT1蛋白信号肽分析结果显示,最大 C值
(原始剪切位点的分值)为 0.144,位于第 51个
氨基酸残基;最大 Y值(综合剪切位点的分值)
为 0.058,位于第 46个氨基酸残基;最大 S值(信
号肽的分值)为 0.217,位于第 10个氨基酸残基;
平均 S值为 0.102,位于第 1~ 45位氨基酸残基
之间;综合计算信号肽存在的可能性值为 0.009,
信号锚定的可能性值为 0.001,第 17~ 18位氨基
酸残基之间的剪切的值为 0.004。推测樟叶越桔
VdUGT1为非分泌性蛋白。蛋白质跨膜结构域预
测结果(图 5)显示 VdUGT1肽链不存在蛋白质
跨膜结构域,位于细胞膜外。
宋 健,等:樟叶越桔糖基转移酶 VdUGT1基因克隆及序列分析84 第 6期
疏水性一方面可以为二级结构预测结果提供
参考,另一方面还可以为结构域以及功能域的划分
提供依据 [17]。通过疏水性分析樟叶越桔 VdUGT1
蛋白质中疏水性最大值是 2.286, 位于第 115位氨
基酸残基处;亲水性最大值是 -2.264,位于第 189
位氨基酸残基处;综合分析其亲水性氨基酸均匀
分布在整个肽链中,没有明显的疏水区域(图 6)。
结合蛋白质性质和跨膜结构域分析结果,推测樟
叶越桔 VdUGT1为非分泌性的可溶性蛋白质,其
在细胞质中合成后不经运转,直接分布在细胞质
特定部位发挥其功能。
图 5 VdUGT1蛋白跨膜结构域预测
Fig.5 Prediction of transmembrane regions of VdUGT1
图 6 VdUGT1蛋白质疏水性和亲水性分析
Fig.6 Prediction of VdUGT1 protein hydroPhobicity and hydroPhilicity profi le
蛋白质分子的多肽链通常折叠和盘曲成比较
稳定的空间结构,形成比较稳定的二级结构,进
一步才能完成活性功能域构象的构建,以完成特
定的生命活动。VdUGT1蛋白质二级结构预测结
果(图 7)显示其由 43.01%的 α-螺旋、5.81%的
β-转角、14.19%的 β-折叠和 36.99%的随机卷曲
组成。可见 α-螺旋和随机卷曲构成了 VdUGT1
蛋白的主要二级结构。VdUGT1蛋白结构功能域
分析结果表明其含有 PLN00164、PLN03015、
UDPGT、MGT和 COG1819等多种功能域,其中
图 4 VdUGT1和其他植物 GTs的进化树分析
Fig.4 Phylogenetic analysis of VdUGT1 and other plant GTs
85第 35卷 中 南 林 业 科 技 大 学 学 报
位于 C末端含有尿嘧啶核苷二磷酸糖基转移酶所
特有 UDPGT功能域,推测与尿嘧啶核苷二磷酸糖
(UDP-sugar)的结合有关 [18]。
3 结 论
GTs为高度分歧的多源基因家族,根据蛋白酶
的催化特性、氨基酸序列相似性、以及有无保守结
构 /功能域,目前已将其分为 96个家族 [19-20]。其中,
糖基转移酶家族 1(GT1),又称 UGTs,是 GTs
中的最大家族 [4-5],可催化激素、类黄酮、以及像
杀虫剂和除草剂等外源物质等次生代谢产物的糖
基化 [13]。目前已在拟南芥 Arabidopsis thaliana中发
现有 120个 UGTs基因 [6],在江南卷柏 Selaginella
moellendorffi i和小立碗藓 Physcomitrella patens中
分别发现有 142个和 21个 UGTs基因 [10],在‘黑
比诺’Pinot Noir葡萄 Vitis vinifera中发现有 99个
UGTs基因 [21],在水稻 Oryza sativa ssp. Japonica
中发现有 213个 UGTs基因 [12],在鹰嘴豆 Cicer
arietinum中发现有 96个 UGTs基因 [13],所对应
的基因全序列或部分序列已被克隆并测序。本课
题组前期工作开展了樟叶越桔叶芽转录组测序分
析研究,通过 COG功能分类分析获得了至少 53
条樟叶越桔糖基转移酶基因 EST序列。本研究
通过 RACE-PCR技术克隆了一个全长 1 620 bp
mRNA序列的樟叶越桔糖基转移酶基因,命名为
VdUGT1,具有真核生物 mRNA典型的 Poly(A)
尾巴结构和完整的 ORF区域。
氨基酸序列分析发现来自不同植物的已知
UGTs在 C末端均具有 1个由 44个氨基酸残基组
成的与底物供体 UDP-sugar结合密切相关的高保
守性的特征模体(signature motif),称为 PSPG
蓝色:α-螺旋;红色:β-折叠;绿色:β-转角;粉红色:随机卷曲
图 7 VdUGT1蛋白二级结构预测
Fig.7 Secondary structure prediction of deduced VdUGT1 protein
模 体(Plant Secondary Product Glycosyltransferase
Motif),推测与 UDP-sugar 的结合有关 [19-20]。
本研究克隆获得的 VdUGT1基因推测编码的
由 465个氨基酸残基组成的樟叶越桔糖基转移
酶 VdUGT1在 381-384位氨基酸残基间同样具有
UGTs特征模体—PSPG模体(图 3),保守序列
为 WAPQIEVLSHGSTGGFLSHCGWNSTIESVVH
GVPIIAWPLYA EQ,决定了糖基供体结合位点的
微环境。另外,在 VdUGT1蛋白的 N-末端结构域
(N-Terminal Domain,NTD)第 18位(图 3)有
1个保守的组氨酸残基,推测与存在于其他植物
UGTs的 NTD中的保守的组氨酸残基一样,可提
供碱性微环境(如 OH和 NH等),对糖基供体和
受体分子之间的结合起催化作用,有助于糖基受
体去质子化,接受来自于糖基供体分子上的末端
异构中心的亲核攻击,这也是 UGTs催化糖基转移
反应的基础 [13,22]。
UGTs的亚细胞定位研究表明,UGTs一般为
可溶性蛋白质 [3]。在植物细胞中不同组分的 UGTs
活性反应实验证明,绝大多数 UGTs是在细胞质
基质中才表现出活性 [23-24]。本研究根据蛋白质信
号肽预测和跨膜结构域分析结果推测樟叶越桔
VdUGT1为非分泌性的可溶性蛋白质,其在细胞
质中合成后不经运转,直接分布在细胞基质特定
部位发挥其功能。不同种类的 UGTs可能定位于不
同细胞或同一细胞的不同细胞器,以催化不同底
物的糖基转移反应 [22]。Hefner等 [9]研究表明在 74
种天然或合成化合 物中,有 45个化合物可以被蛇
根木糖基转移酶 RsUGT糖基化,表明 UGTs的底
物专一性较低。UDPG和对苯二酚在植物体内可
被 UGTs成员之一熊果苷合成酶催化生成熊果苷,
宋 健,等:樟叶越桔糖基转移酶 VdUGT1基因克隆及序列分析86 第 6期
因其能够竞争性抑制酪氨酸酶活性从而抑制黑色
素的形成,熊果苷被国际公认为21世纪天然、低毒、
高效的皮肤美白剂,是皮肤美白化妆品中理想的
活性添加成分。本课题组 Zhao等 [8]研究发现在樟
叶越桔幼嫩叶芽中熊果苷衍生物含量占植物材料
干重的 22%,推测在樟叶越桔中存在高活性表达
的 UGTs。本研究成功从樟叶越桔中分离得到糖基
转移酶基因家族中的 VdUGT1基因全长 cDNA序
列,推导的糖基转移酶 VdUGT1属于 UGTs家族
的一个新成员。VdUGT1是否具有与其他 UGTs类
似的多底物接受特性,则需要开展异源表达和功
能验证等深入研究。
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[本文编校:吴 彬 ]