全 文 ：樟叶越桔熊果苷合成酶基因 ＶｄＡＳ１的克隆及序列分析∗
杜　 维１ꎬ 丁　 勇１∗∗ꎬ 朱东阳２ꎬ 尹继庭２ꎬ 刘小烛１ꎬ 赵　 平２∗∗
(１ 西南林业大学生命科学学院ꎬ 昆明　 ６５０２２４ꎻ ２ 西南林业大学西南山地森林资源保育
与利用省部共建教育部重点实验室ꎬ 昆明　 ６５０２２４)
摘要: 根据樟叶越桔 (Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ ｄｕｎａｌｉａｎｕｍ) 叶芽转录组测序获得的熊果苷合成酶基因 ＶｄＡＳ１部分 ＥＳＴ序
列设计引物ꎬ 结合 ＲＡＣＥ￣ＰＣＲ技术获得 ＶｄＡＳ１基因全长 １ ５７７ ｂｐ ｃＤＮＡ序列ꎮ 其完整的开放阅读框推测编
码由 ４７５个氨基酸残基组成的 ＶｄＡＳ１ 蛋白ꎬ 理论相对分子量为 ５２􀆰 ２２ ｋＤꎬ 等电点 ｐＩ ＝ ５􀆰 ７４ꎬ 负电荷残基
(Ａｓｐ＋Ｇｌｕ) 总数为 ５３个ꎬ 正电荷残基 (Ａｒｇ＋Ｌｙｓ) 总数为 ４５ 个ꎬ 不稳定系数为 ３７􀆰 ９３ꎬ 属稳定性蛋白质ꎮ
生物信息学分析表明 ＶｄＡＳ１与枸杞的糖基转移酶相似率高达 ７４％ꎬ 其二级结构主要构件为 α￣螺旋和随机
卷曲ꎬ 不存在跨膜区ꎬ 属于亲水性蛋白质ꎬ 并结合信号肽预测结果推测 ＶｄＡＳ１ 直接锚定在细胞基质中行
使功能ꎮ 该研究为后期 ＶｄＡＳ１的异源表达和功能研究奠定了基础ꎮ
关键词: 樟叶越桔ꎻ 熊果苷合成酶ꎻ 基因克隆ꎻ 生物信息学分析
中图分类号: Ｑ ７５　 　 　 　 　 　 文献标志码: Ａ　 　 　 　 　 　 　 文章编号: ２０９５－０８４５(２０１５)０１－０７１－０７
Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＶｄＡＳ１ Ｇｅｎｅ
ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ ｄｕｎａｌｉａｎｕｍ (Ｅｒｉｃａｃｅａｅ)
ＤＵ Ｗｅｉ１ꎬ ＤＩＮＧ Ｙｏｎｇ１∗∗ꎬ ＺＨＵ Ｄｏｎｇ￣ｙａｎｇ２ꎬ ＹＩＮ Ｊｉ￣ｔｉｎｇ２ꎬ ＬＩＵ Ｘｉａｏ￣ｚｈｕ１ꎬ ＺＨＡＯ Ｐｉｎｇ２∗∗
(１ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｋｕｎｍｉｎｇ ６５０２２４ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ２ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｆｏｒｅｓｔ
Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｓｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ Ｍｏｕｎｔａｉｎｓ ｏｆ Ｃｈｉｎａꎬ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎꎬ
Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｋｕｎｍｉｎｇ ６５０２２４ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ａｒｂｕｔｉｎ ｗａｓ ｗｉｄｅｌｙ ｕｓｅｄ ｉｎ ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ ａｓ ａ ｗｈｉｔｅｎｉｎｇ ａｇｅｎｔ ｂｅｃａｕｓｅ ｏｆ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｍｅｌａｎｉｎ ａｓ
ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ. Ａｒｂｕｔｉｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ (ＡＳ) ａｓ ｏｎｅ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ＵＤＰ ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ (ＵＧＴｓ) ｗｈｉｃｈ ｂｅ￣
ｌｏｎｇｓ ｔｏ ｔｈｅ ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ (ＧＴｓ) ｆａｍｉｌｙ ｉｓ ａ ｒａｔｅ￣ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ｉｎ ａｒｂｕｔｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｆｒｏｍ ｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｎｅ. Ｔｏ
ｒｅｖｅａｌ ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｖｉｄｅ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｂａｓｉｓ ｏｆ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｎ ｐｌａｎｔ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｆｏｒ Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ
ｄｕｎａｌｉａｎｕｍ ａｒｂｕｔｉｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ (ＶｄＡＳ)ꎬ ａ ｇｅｎｅ ＶｄＡＳ１ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ＶｄＡＳ１ ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｂｙ ＲＴ￣ＰＣＲ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ
ＲＡＣＥ￣ＰＣＲ ｆｒｏｍ Ｖ􀆰 ｄｕｎａｌｉａｎｕｍ. Ｔｈｅ ｆｕｌｌ￣ｌｅｎｇｔｈ ｃＤＮＡ ｃｌｏｎｅ ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ １ ５７７ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ ａ １７￣ｎｕｃｌｅｏ￣
ｔｉｄｅ ５′￣ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎꎬ ａｎ ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ ｏｆ １４２８ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓꎬ ａｎｄ ａ １３２￣ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ３′￣ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎ.
Ｔｈｅ ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ ｅｎｃｏｄｅｄ ａ ｐｕｔａｔｉｖｅ ＶｄＡＳ１ ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ４７５ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｗｉｔｈ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ
５２􀆰 ２２ ｋＤ. ａｎｄ ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｐｏｉｎｔ ｏｆ ５􀆰 ７４. Ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｈａｒｇｅｄ ｒｅｓｉｄｕｅｓ (Ａｓｐ＋Ｇｌｕ) ａｎｄ ｐｏｓｉｔｉｖｅ
ｃｈａｒｇｅｄ ｒｅｓｉｄｕｅｓ (Ａｒｇ＋Ｌｙｓ) ｉｎ ＶｄＡＳ１ ｗｅｒｅ ５３ ａｎｄ ４５ꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ. ＶｄＡＳ１ ｓｈａｒｅｓ ７４％ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｗｉｔｈ ＵＧＴ ｉｎ
ｗｏｌｆｂｅｒｒｙ (Ｌｙｃｉｕｍ ｂａｒｂａｒｕｍ). Ｉｔ ｗａｓ ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ＶｄＡＳ１ ｈａｄ ｎｏ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ. Ｔｈｅ
ｍａｉｎ ｐａｒｔｓ ｏｆ ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ＶｄＡＳ１ ｗｅｒｅ ａ￣ｈｅｌｉｃｅｓ ａｎｄ ｒａｎｄｏｍ ｃｏｉｌｓ. Ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｒｅｓｕｌｔｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ
ｔｈｅ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＶｄＡＳ１.
植 物 分 类 与 资 源 学 报　 ２０１５ꎬ ３７ (１): ７１~７７
Ｐｌａｎｔ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 ＤＯＩ: １０.７６７７ / ｙｎｚｗｙｊ２０１５１４０５７
∗
∗∗
基金项目: 国家自然科学基金地区科学基金项目 (２１４６２０４０ꎬ ３１４６００７６)ꎻ 云南省优势特色重点学科生物学一级学科建设项目
(５００９７５０５)
通讯作者: Ａｕｔｈｏｒ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅꎻ Ｅ￣ｍａｉｌ: ｈｙｐｚｈａｏ＠ｙａｈｏｏ􀆰 ｃｏｍ (ＺＨＡＯ Ｐ)ꎻ ４４７１３６８９０＠ｑｑ􀆰 ｃｏｍ (ＤＩＮＧ Ｙ)
收稿日期: ２０１４－０４－０３ꎬ ２０１４－０６－１３接受发表
作者简介: 杜维 (１９８９－) 男ꎬ 硕士研究生ꎬ 主要从事化学生物学研究ꎮ
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ ｄｕｎａｌｉａｎｕｍꎻ Ａｒｂｕｔｉｎ ｓｙｎｔｈａｓｅꎻ Ｇｅｎｅ ｃｌｏｎｉｎｇꎻ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎａｌｙｓｉｓ
　 熊果苷 (ａｒｂｕｔｉｎ) (对￣羟基苯￣β￣Ｄ￣吡喃葡萄
糖苷) 是一种酚苷类物质ꎬ 主要分布于杜鹃花科
(Ｅｒｉｃａｃｅａｅ)、 蔷薇科 ( Ｒｏｓａｃｅａｅ) 和虎耳草科
(Ｓａｘｉｆｒａｇａｃｅａｅ) 等植物中ꎬ 具有镇咳、 祛痰、 平
喘和祛斑等多种生理活性 (王亚芳等ꎬ ２００３ꎻ
Ｂａｕｍａｎｎ等ꎬ ２００９)ꎮ 因其能够竞争性抑制酪氨
酸酶活性从而抑制黑色素的形成ꎬ 被国际公认为
２１世纪天然、 低毒、 高效的皮肤美白剂ꎬ 是皮
肤美白化妆品中理想的活性添加成分 (Ａｋｉｕ 等ꎬ
１９９１ꎻ Ｍａｅｄａ 和 Ｆｕｋｕｄａꎬ １９９６ꎻ Ｗｅｉ 等ꎬ ２００７)ꎬ
被广泛应用于化妆品领域ꎮ 天然熊果苷是植物体
内的对苯二酚和尿嘧啶二磷酸葡萄糖 (ＵＤＰＧ)
在 ＵＤＰ 糖基转移酶—熊果苷合成酶 (ａｒｂｕｔｉｎ ｓｙｎ￣
ｔｈａｓｅꎬ ＡＳ) (ＥＣ２􀆰 ４􀆰 １􀆰 ￣) 的催化下生物合成而来ꎮ
ＡＳ活性首次于 １９９２年在夹竹桃科 (Ａｐｏｃｙｎａｃｅａｅ)
萝芙木属 (Ｒａｕｖｏｌｆｉａ) 植物蛇根木 (Ｒ􀆰 ｓｅｒｐｅｎｔｉｎａ)
的悬浮细胞中检测到ꎬ 并通过悬浮细胞培养的方
式大量获取天然熊果苷 (Ｌｕｔｔｅｒｂａｃｈ 和 Ｓｔöｃｋｉｇｔꎬ
１９９２)ꎮ 随后 ＡＳ 得到纯化 (Ａｒｅｎｄ 等ꎬ ２０００)ꎬ 并
从蛇根木悬浮细胞 ｃＤＮＡ 文库中克隆得到 １ ２６０
ｂｐ的 ＡＳ基因 ｃＤＮＡꎬ 在大肠杆菌 Ｍ１５ 中进行了
异源表达 (Ａｒｅｎｄ等ꎬ ２００１ꎻ Ｈｅｆｎｅｒ等ꎬ ２００２ꎻ Ｈｅｆｎｅｒ
和 Ｓｔöｃｋｉｇｔꎬ ２００３)ꎬ 并获得其晶体 (吴方睿ꎬ ２０１３)ꎮ
ＡＳ 属于 ＮＲＤ１ｂ 糖基转移酶家族 (Ｋａｐｉｔｏｎｏｖ 和
Ｙｕꎬ １９９９)ꎬ 可以接受多种具有多样结构化合物
作为其底物ꎬ 是少有的具有多底物接受能力的多
功能糖基转移酶 (Ｈｅｆｎｅｒ等ꎬ ２００２)ꎮ
Ｚｈａｏ等 (２００８) 发现ꎬ 云南省杜鹃花科 (Ｅｒｉ￣
ｃａｃｅａｅ) 越桔属 (Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ) 野生植物樟叶越桔
(Ｖ􀆰 ｄｕｎａｌｉａｎｕｍ) 是一种富含熊果苷及其衍生物
的特殊资源植物ꎬ 推测该植物中有高活性表达的
樟叶越桔熊果苷合成酶 (Ｖ􀆰 ｄｕｎａｌｉａｎｕｍ ａｒｂｕｔｉｎｓ
ｙｎｔｈａｓｅꎬ ＶｄＡＳ) 的存在ꎬ 并提示该酶基因 ＶｄＡＳ
及其基因产物在该植物中可能具有某种重要的、
不可或缺的生物学功能ꎮ 但目前尚无樟叶越桔熊
果苷合成酶基因的相关报道ꎮ 本研究根据前期开
展的樟叶越桔叶芽转录组测序实验获得的 ＶｄＡＳ１
部分 ＥＳＴ序列设计引物ꎬ 结合 ＲＡＣＥ 方法获得
了樟叶越桔 ＶｄＡＳ１基因全长 ｃＤＮＡ序列ꎬ 并对其
所编码蛋白质的特性进行了分析ꎮ
１　 材料和方法
１􀆰 １　 材料
樟叶越桔叶芽采自云南省楚雄州武定县高桥镇唐家
村ꎬ 海拔高度为 ２ １００ ｍꎬ 位于北纬 ２５°５７′、 东经 １０２°
２４′ꎬ 原植物标本存放于中国科学院昆明植物研究所标本
馆ꎬ 由刘恩德博士鉴定ꎮ 取樟叶越桔新鲜叶芽置于液氮
中速冻ꎬ 于－８０ ℃冰箱中保存ꎬ 供提取总 ＲＮＡ用ꎮ
１􀆰 ２　 实验方法
１􀆰 ２􀆰 １　 实验试剂　 植物总 ＲＮＡ 提取试剂盒为 Ｏｍｅｇａ 公
司产品ꎬ 逆转录试剂和 ｐＭＤ１８￣Ｔ载体购自宝生物工程有
限公司ꎬ ＲＡＣＥ￣ＰＣＲ 试剂盒为 Ｃｌｏｎｔｅｃｈ 公司产品ꎬ 胶回
收试剂盒购自天根生化科技有限公司ꎬ 其他相关试剂购
自昆明滇工科技有限公司ꎬ 大肠杆菌 ＤＨ５α 为本实验室
保存菌种ꎮ
１􀆰 ２􀆰 ２　 总 ＲＮＡ提取与检测 　 参照朱东阳等 (２０１３) 方
法提取樟叶越桔叶芽总 ＲＮＡꎬ １􀆰 ２％琼脂糖凝胶上电泳
检测总 ＲＮＡ 完整性ꎬ 采用 Ｂｉｏｃｈｒｏｍ Ｌｉｂｒａ Ｓ２２￣紫外分光
光度计测定总 ＲＮＡ的 ＯＤ (Ａ２６０ / Ａ２８０) 值ꎮ
１􀆰 ２􀆰 ３　 ＲＡＣＥ 克隆 ＶｄＡＳ１ 基因全长 ｃＤＮＡ　 根据前期转
录组测序分析获得的 ＶｄＡＳ１基因 ＥＳＴ序列设计 ＲＡＣＥ 引
物ꎮ ３′￣ＲＡＣＥ 引物包括反转录引物 Ａｄａｐｔｏｒ￣Ｏｌｉｇｏ ( ｄＴ)
１７: ５′￣ＣＣＡＧＴＧＡＧＣＡＧＡＧＴＧＡＣＧＡＧＧＡＣＴＣＧＡＧＣＴＣＡＡＧＣ
(ｄＴ) １７￣３′ꎬ 接头外侧和内侧引物分别为 ＡＰ￣Ｏｕｔｅｒ: ５′￣
ＣＣＡＧＴＧＡＧＣＡＧＡＧＴＧＡＣＧ￣３′和 ＡＰ￣Ｉｎｎｅｒ: ５′￣ＧＡＧＧＡＣＴＣ
ＧＡＧＣＴＣＡＡＧＣ￣３′ꎬ 特异性外侧和内侧引物分别为 ３′￣ＧＳ￣
Ｏｕｔｅｒ: ５′￣ＧＴＴＴＣＴＴＧＣＧＡＧＴＡＣＡＧＧＧ￣３′ 和 ３′￣ＧＳ￣Ｉｎｎｅｒ:
５′￣ＣＧＧＧＣＣＡＣＴＣＡＴＡＣＡＧＡＴ￣３′ꎬ 第一链 ｃＤＮＡ 的合成按
ＲＮＡ反转录第一链合成试剂盒说明书进行操作ꎮ 二轮
ＰＣＲ反应条件为: ９４ ℃预变性 ３ ｍｉｎꎻ ９４ ℃变性 ３０ ｓꎬ
５３ ℃退火 ３０ ｓꎬ ７２ ℃延伸 １ ｍｉｎꎬ ３５个循环ꎻ ７２ ℃延伸
１０ ｍｉｎꎮ
根据 ３′￣ＲＡＣＥ 扩增测序获得 ＶｄＡＳ１ 基因 ３′末端序
列ꎬ 设计 ５′￣ＲＡＣＥ 特异性巢式引物 ５′￣ＧＳ￣Ｏｕｔｅｒ: ５′￣ＴＣ￣
ＣＧＣＣＡＡＧＣＣＡＴＡＣＣＧＴＴＴＣＧＴＧＴ￣３′和 ５′￣ＧＳ￣Ｉｎｎｅｒ: ５′￣ＧＧ
ＧＴＣＣＡＧＣＡＡＧＴＧＧＴＴＣＣＣＧＴＧＡ￣３′ꎬ 按 ＲＡＣＥ 试剂盒说
明书进行操作ꎮ 第一轮 ＰＣＲ反应条件为: ９４ ℃变性 ３０ ｓꎬ
７８ ℃退火 ３０ ｓꎬ ７２ ℃延伸 ２ ｍｉｎꎬ ８个循环ꎬ 每个循环退
火温度降低 １ ℃ꎻ ９４ ℃变性 ３０ ｓꎬ ７０ ℃退火 ３０ ｓꎬ ７２ ℃
延伸 ２ ｍｉｎꎬ ３０个循环ꎮ 第二轮 ＰＣＲ 反应条件为: ９４ ℃
预变性 ３ ｍｉｎꎻ ９４ ℃变性 ３０ ｓꎬ ７０ ℃退火 ３０ ｓꎬ ７２ ℃延伸
１ ｍｉｎꎬ ３５个循环ꎻ ７２ ℃延伸 １０ ｍｉｎꎮ
在 １􀆰 ２％的琼脂糖凝胶上电泳检测 ＰＣＲ 产物ꎬ 回收
目的片段并连接到 ｐＭＤ１８￣Ｔ 载体上ꎬ 转化大肠杆菌
ＤＨ５α感受态细胞ꎬ 随机筛选白色菌落ꎬ 对阳性克隆测
２７　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 植 物 分 类 与 资 源 学 报　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 第 ３７卷
序ꎮ 引物合成及测序由上海生工生物工程技术服务有限
公司完成ꎮ
１􀆰 ２􀆰 ４　 ＶｄＡＳ１ 的生物信息学分析 　 ＮＣＢＩ 中 ＯＲＦ ｆｉｎｄｅｒ
工具分析基因开放阅读框ꎻ ＤＮＡＭＡＮ 构建 ＯＲＦ 核苷酸
序列并推导其氨基酸序列ꎻ ＰｒｏｔＰａｒａｍ软件计算各种氨基
酸的含量和蛋白的理论分子量、 等电点和稳定性ꎻ ＮＣＢＩ
中的 Ｂｌａｓｔ工具对推导的蛋白质进行相似性比较ꎬ Ｃｌｕｓｔ￣
ａｌｘ２和 Ｊａｌｖｉｅｗ软件对同源性高的序列进行多序列比对ꎬ
ＭＥＧＡ４􀆰 １分子进化遗传分析软件通过邻位相连法
(Ｎｅｉｇｈｂｏｒ￣ｊｏｉｎｉｎｇ) 构建系统发生树ꎬ 系统树每个统计学
显著性分析以自展法 (Ｂｏｏｔ￣ｓｔｒｐ) 进行检验ꎬ 重复 １ ０００
次 (Ｋｕｍａｒ等ꎬ １９９４)ꎻ Ｓｉｇａｎａｌ Ｖ４􀆰 ０ (ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ􀆰ｃｂｓ􀆰 ｄｔｕ􀆰
ｄｋ / ｓｅｒｖｉｃｅｓ / ＳｉｇｎａｌＰ￣２􀆰 ０ / ) 分析蛋白质信号肽ꎻ ＴＭＨＭＭ
(ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ􀆰 ｃｂｓ􀆰 ｄｔｕ􀆰 ｄｋ / ｓｅｒｖｉｃｅｓ / ＴＭＨＭＭ / ) 和 Ｐｒｏｓｃａｌｅ
(ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ􀆰ｅｘｐａｓｙ􀆰 ｏｒｇ / ｃｇｉ￣ｂｉｎ / ｐｒｏｔｓｃａｌｅ􀆰 ｐｌ) 分别检测其
跨膜结构和亲水 /疏水性特性ꎻ ＳＯＰＭＡ 程序 ( ｈｔｔｐ: / /
ｎｐｓａｐｂｉｌ􀆰 ｉｂｃｐ􀆰 ｆｒ / ｃｇｉ￣ｂｉｎ / ｎｐｓａ ＿ ａｕｔｏｍａｔ􀆰 ｐｌ? ｐａｇｅ ＝ / ＮＰＳＡ /
ｎｐｓａ＿ｓｏｐｍａ􀆰 ｈｔｍｌ) 预测蛋白序列的二级结构ꎻ ＮＣＢＩ 提供
的 Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ Ｄｏｍａｉｎ Ｓｅａｒｃｈ (ＣＤ￣Ｓｅａｒｃｈ) 服务器 (ｈｔｔｐ: / /
ｗｗｗ􀆰 ｎｃｂｉ􀆰 ｎｌｍ􀆰 ｎｉｈ􀆰 ｇｏｖ / Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ / ｃｄｄ / ｗｒｐｓｂ􀆰 ｃｇｉ) 进行蛋白
功能域分析ꎮ
２　 结果与分析
２􀆰 １　 樟叶越桔 ＶｄＡＳ１基因全长 ｃＤＮＡ的获得
本实验提取的樟叶越桔叶芽总 ＲＮＡ 的 ２８ Ｓ
和 １８ Ｓ ｒＲＮＡ带型完整且前者的亮度约为后者的
两倍ꎬ 总 ＲＮＡ的 ＯＤ (Ａ２６０ / Ａ２８０) 值处于 １􀆰 ８~２􀆰 ０
之间ꎮ 利用前述引物结合 ＲＡＣＥ￣ＰＣＲ 方法分别
扩增获得 ＶｄＡＳ１ 基因的 ３′末端 ｃＤＮＡ 和 ５′末端
ｃＤＮＡ (图 １)ꎬ 经回收克隆测序长度分别为 ８５１ ｂｐ
和 ５６５ ｂｐꎬ 经过序列拼接ꎬ 最终获得了 １ ５７７ ｂｐ
全长 ｃＤＮＡ序列ꎮ
２􀆰 ２　 樟叶越桔 ＶｄＡＳ１基因序列分析
开放阅读框 (ＯＲＦ) 分析结果显示 ＶｄＡＳ１ 基
因全长 ｃＤＮＡ序列包括 ５′非编码区 １７ ｂｐꎬ ＯＲＦ １
４２８ ｂｐ 和 ３′非编码区 １３２ ｂｐꎬ 编码 ４７５ 个氨基
酸ꎬ 其 ＯＲＦ的核苷酸序列及其推导的氨基酸序
列如图 ２所示ꎮ
同源性分析结果显示 ＶｄＡＳ１ 基因推测编码
的樟叶越桔熊果苷合成酶 ＶｄＡＳ１与枸杞 (Ｌｙｃｉｕｍ
ｂａｒｂａｒｕｍ) (ＬｂＵＧＴꎬ ＡＢ３６０６３２􀆰 １)、 蛇根木 (Ｒ􀆰 ｓｅ￣
ｒｐｅｎｔｉｎａ) ( ＲｓＵＧＴꎬ ＡＪ３１０１４８􀆰 １)、 番茄 ( Ｓｏｌａ￣
ｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ) ( ＳｌＵＧＴꎬ ＸＭ ＿ ００４２３１１５９􀆰 １)
和绿毛山柳菊 (Ｈｉｅｒａｃｉｕｍ ｐｉｌｏｓｅｌｌａ) ( ＨｐＵＧＴꎬ
ＥＵ５６１０１６􀆰 １) 等的糖基转移酶之间具有 ４９％ ~
７４％的序列同源性ꎬ 且均具有高保守的 ＰＳＰＧ 结
构域 (图 ３)ꎬ 推测 ＶｄＡＳ１ 基因属于糖基转移酶
家族中的熊果苷合成酶ꎮ
系统发生分析结果 (图 ４) 显示绿毛山柳菊
ＨｐＵＧＴ和其余植物 ＧＴｓ 分别单独聚为一类ꎬ 其
中 ＶｄＡＳ１和仙客来 ＣｐＧＴ、 蛇根木 ＲｓＵＧＴ 聚为
一分支ꎮ
蛋白质理化性质预测结果显示ꎬ ＶｄＡＳ１ 的
理论分子量为 ５２􀆰 ２２ ｋＤꎬ 氨基酸总数为 ４７５ 个ꎬ
理论等电点为 ５􀆰 ７４ꎬ 负电荷残基 (Ａｓｐ＋Ｇｌｕ) 总数
为 ５３个ꎬ 正电荷残基 (Ａｒｇ＋Ｌｙｓ) 总数为 ４５ 个ꎬ
不稳定系数为 ３７􀆰 ９３ꎬ 属于稳定性蛋白质ꎮ 亲水 /
疏水性特性预测结果 (图 ５) 表明ꎬ ＶｄＡＳ１ 在第
１１５位的氨基酸疏水性最强 (２􀆰 ８１４)ꎬ 第 １８７位的
氨基酸亲水性最强 (－２􀆰 ８８９)ꎬ 亲水性氨基酸均
匀分布在整个肽链中ꎬ 没有明显的疏水区域ꎮ
ＶｄＡＳ１信号肽序列预测结果显示ꎬ 最大 Ｃ
值 (原始剪切位点的分值) 为 ０􀆰 １０９ꎬ 位于第 ３０
位氨基酸处ꎻ 最大 Ｙ值 (综合剪切位点的分值)
为 ０􀆰 １０４ꎬ 位于第 ４５位氨基酸处ꎻ 最大 Ｓ值 (信
号肽的分值) 为 ０􀆰 ３２４ꎬ 位于第 ３３ 位氨基酸处ꎬ
平均 Ｓ值为 ０􀆰 １２５ꎬ 位于第 １~４４位氨基酸之间ꎬ
可能性值为 ０􀆰 ４７ꎻ 综合计算信号肽存在的可能
性值为 ０􀆰 ００１ꎬ 信号锚定的可能性值为 ０􀆰 ００１ꎬ 第
图 １　 ＶｄＡＳ１ ３′￣ＲＡＣＥ (Ａ) 和 ５′￣ＲＡＣＥ (Ｂ) ＰＣＲ
产物电泳 Ｍ为 ＤＮＡ分子量标准
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ＶｄＡＳ１ ３′￣ＲＡＣＥ (Ａ)
ａｎｄ ５′￣ＲＡＣＥ (Ｂ) ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ
Ｍ. ＤＮＡ ５０００ / ２０００ ｍａｒｋｅｒｓ
３７１期　 　 　 　 　 　 　 　 　 杜维等: 樟叶越桔熊果苷合成酶基因 ＶｄＡＳ１的克隆及序列分析　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　
２９~３０位氨基酸之间的剪切的值为 ０􀆰 ０００ꎬ 推测
ＶｄＡＳ１为非分泌性蛋白质ꎮ 蛋白质跨膜结构域
预测结果 (图 ６) 显示ꎬ ＶｄＡＳ１ 肽链位于细胞膜
外ꎬ 不存在跨膜区ꎬ 结合信号肽预测结果ꎬ 推测
ＶｄＡＳ１在细胞质基质中合成后不经转运ꎬ 直接
锚定在细胞基质中特定部位行使功能ꎮ
图 ２　 ＶｄＡＳ１ ＯＲＦ核苷酸序列及其推导的氨基酸序列
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎｄ ｄｅｄｕｃｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ＶｄＡＳ１ ＯＲＦ
４７　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 植 物 分 类 与 资 源 学 报　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 第 ３７卷
图 ３　 ＶｄＡＳ１和其他植物 ＧＴｓ的氨基酸序列比对　 ＰＳＰＧ ｂｏｘ: 高保守结构域
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ ｄｅｄｕｃｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ＶｄＡＳ１ ａｎｄ ＧＴｓ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ ｏｔｈｅｒ ｐｌａｎｔｓ　 ＰＳＰＧ ｂｏｘ: ｈｉｇｈｌｙ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｄｏｍａｉｎｓ
ＣｐＧＴ (仙客来ꎬ ＡＢ２９４３９６􀆰 １)ꎻ ＦｋＵＧＴ (连翘ꎬ ＡＢ５２４７１５􀆰 １)ꎻ ＦｖＧＴ (野草莓ꎬ ＸＭ＿００４３０６６４４􀆰 １)ꎻ ＧｍＧＴ (大豆ꎬ ＸＭ＿
００３５３２１４３􀆰 １)ꎻ ＨｐＵＧＴ (绿毛山柳菊ꎬ ＥＵ５６１０１６􀆰 １)ꎻ ＬｂＵＧＴ (枸杞ꎬ ＡＢ３６０６３２􀆰 １)ꎻ ＭｔＧＴ (苜蓿ꎬ ＸＭ＿００３６２６５０８􀆰 １)ꎻ
ＲｃＵＧＴ (蓖麻ꎬ ＸＭ＿００２５３３８６５􀆰 １)ꎻ ＲｓＵＧＴ (蛇根木ꎬ ＡＪ３１０１４８􀆰 １)ꎻ ＳｇＵＧＴ２ (罗汉果ꎬ ＨＱ２５９６２１􀆰 １)ꎻ ＳｇＵＧＴ３ (罗汉果ꎬ
ＨＱ２５９６２２􀆰 １)ꎻ ＳｌＧＴ (番茄ꎬ ＸＭ＿００４２３１１５９􀆰 １)ꎻ ＶｖＧＴ (葡萄ꎬ ＸＭ＿００２２８０８８７􀆰 ２)
５７１期　 　 　 　 　 　 　 　 　 杜维等: 樟叶越桔熊果苷合成酶基因 ＶｄＡＳ１的克隆及序列分析　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　
　 　 蛋白质二级结构预测结果 (图 ７) 显示 α￣螺
旋和随机卷曲是 ＶｄＡＳ１ 的主要构件ꎬ 分别占
４３􀆰 １２％和 ３６􀆰 ６７％ꎮ 此外ꎬ 还含有 ６􀆰 ６７％的 β￣
转角和 １３􀆰 ５４％的 β￣折叠结构ꎮ
蛋白质功能域分析结果表明 ＶｄＡＳ１ 可能含
有 ＰＬＮ０３０１５、 ＰＬＮ００１６４、 ＰＬＮ０２５３４、 ＵＤＰＧＴ、
ＭＧＴ和 ＣＯＧ１８１９等多种功能域ꎬ 其中包括 ＵＧＴｓ
所特有的、 与核苷酸糖的 ＵＤＰ 结合有关 (Ｐａｑｕｅ￣
ｔｔｅ等ꎬ ２００３) 的 ＵＤＰＧＴ功能域ꎮ
３　 讨论
糖基转移酶为一个高差异、 多源的大家族ꎬ
根据它们的序列相似性、 保守域和底物特异性ꎬ
图 ４　 ＶｄＡＳ１和其他植物 ＧＴｓ的进化树分析
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＶｄＡＳ１ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｐｌａｎｔ ＧＴｓ
图 ５　 ＶｄＡＳ１蛋白质疏水性和亲水性分析
Ｆｉｇ􀆰 ５　 Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ＶｄＡＳ１ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙ ｐｒｏｆｉｌｅ
图 ６　 ＶｄＡＳ１跨膜结构域预测
Ｆｉｇ􀆰 ６　 Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ＶｄＡＳ１
图 ７　 ＶｄＡＳ１基因蛋白氨基酸序列的二级结构预测
Ｆｉｇ􀆰 ７　 Ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｄｅｄｕｃｅｄ ＶｄＡＳ１ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ
６７　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 植 物 分 类 与 资 源 学 报　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 第 ３７卷
又可进一步分成 ９２ 个家族 (Ｂｒｅｔｏｎ 等ꎬ ２０１２)ꎮ
其中ꎬ ＵＤＰ 糖基转移酶家族 (ＵＧＴｓ) 又称糖基
转移酶家族 １ꎬ 是糖基转移酶中的最大家族ꎮ 在
拟南芥 ( Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ) 中发现有 １２０ 个
ＵＧＴｓ基因 (Ｌｉ等ꎬ ２００１)ꎬ 水稻 (Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ｓｓｐ.
ｊａｐｏｎｉｃａ) 中发现有 ２１３ 个 ＵＧＴｓ基因 (Ｙｏｎｅｋｕｒａ￣
Ｓａｋａｋｉｂａｒａ 和 Ｈａｎａｄａꎬ ２０１１)ꎬ 小立碗藓 (Ｐｈｙ￣
ｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ) 和江南卷柏 (Ｓｅｌａｇｉｎｅｌｌａ ｍｏｅｌｌ￣
ｅｎｄｏｒｆfiｉ) 中分别发现有 ２１ 个和 １４２ 个 ＵＧＴｓ 基
因 (Ｃａｏ等ꎬ ２００８)ꎮ 序列分析发现来自不同物种
的 ＵＧＴｓ 均具有一个由 ４４ 个氨基酸残基组成的
高保守性的 ＰＳＰＧ 结构域 (Ｐａｑｕｅｔｔｅ 等ꎬ ２００３)ꎮ
研究表明 ＰＳＰＧ结构域可能在代谢平衡调节、 外
源性物质解毒、 次生代谢产物的生物合成及其
储存和运输中扮演着重要的角色 (Ｐａｑｕｅｔｔｅ 等ꎬ
２００３ꎻ Ｙｏｎｅｋｕｒａ￣Ｓａｋａｋｉｂａｒａ和 Ｈａｎａｄａꎬ ２０１１ꎻ Ｂａｒｖ￣
ｋａｒ等ꎬ ２０１２)ꎮ 本研究从樟叶越桔中成功分离获
得熊果苷合成酶基因 ＶｄＡＳ１ 的全长 ｃＤＮＡ 序列ꎬ
推导的 ＶｄＡＳ１属于 ＵＤＰ 糖基转移酶家族的一个
新成员ꎬ 同样具有一个高保守的 ＰＳＰＧ 结构域ꎬ
并推测 ＶｄＡＳ１ 基因表达的 ＶｄＡＳ１ 蛋白直接锚定
在细胞质中行使功能ꎮ ＶｄＡＳ１ 是否具有与蛇根
木 ＲｓＵＧＴ类似的多底物接受特性则需要开展深
入的异源表达和活性功能验证等研究ꎮ
〔参　 考　 文　 献〕
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ｔｕｒｅ ａｎｄ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｏｆ ｔｗｏ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｅｎｚｙｍｅｓ ｆｒｏｍ Ｒａｕ￣
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Ｚｈａｏ Ｐꎬ Ｔａｎａｋａ Ｔꎬ Ｈｉｒａｂａｙａｓｈｉ Ｋ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００８. Ｃａｆｆｅｏｙｌ ａｒｂｕｔｉｎ ａｎｄ
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Ｚｈｕ ＤＹ (朱东阳)ꎬ Ｙｉｎ ＪＴ (尹继庭)ꎬ Ｄｉｎｇ Ｙ (丁勇) ｅｔ ａｌ.ꎬ
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７７１期　 　 　 　 　 　 　 　 　 杜维等: 樟叶越桔熊果苷合成酶基因 ＶｄＡＳ１的克隆及序列分析